從GenBank中檢索人源心肌肌鈣蛋白C亞基(cTnC)和心肌肌鈣蛋白I亞基(cTnI)編碼序列, 合成cTnC和cTnI第30至110氨基酸基因-cTnI(P), 并在兩者之間合成一段由15個氨基酸(G4S)3組成的接頭(linker)序列。構建原核表達載體pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P), 轉化大腸桿菌BL21(DE3), 用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導融合蛋白表達, 結果在大腸桿菌中成功實現了cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白的穩定可溶性高表達。經Ni2+柱純化后得到純度大于95%的cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白, 制備凍干品并采用萬孚飛測?心肌肌鈣蛋白I(cTnI)定量檢測試劑盒檢測其穩定性。cTnC-linker-TnI(P)凍干品在37℃可穩定保存10 d以上, 25℃、4℃穩定保存4個月以上。本研究獲得的cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白活性高, 凍干品穩定性好, 為后續研究提供了穩定高效的生物原材料。
引用本文： 宋曉麗, 劉曉云, 才蕾, 武建偉, 王繼華. cTnC-linker-TnI(P)基因的構建、融合蛋白表達及凍干品的制備. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(6): 1267-1272. doi: 10.7507/1001-5515.20150225 復制
0 引言
急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是指因持久而嚴重的心肌缺血所致的部分心肌急性壞死，是臨床上嚴重危害人類生命的急癥。但是，約有25%的AMI患者發病早期沒有典型的臨床癥狀，約30%的患者缺乏心電圖的特異改變[1]。目前醫學普遍認為，心肌梗死發病1 h內的治愈率可達99%，而一旦發病超過6 h，治愈率將降至90%。因此，選擇合適的早期診斷AMI的血清標志物至關重要。心肌肌鈣蛋白(cardiac troponin, cTn)I亞基(cTnI)被視為診斷AMI的金標準[2-3]。當心肌損傷發生后，使用cTnI作為判斷心肌損傷的血清標志物，其特異性在96%以上[4]。但是，在臨床中，不同檢測方法、檢測不同的抗原表位、待檢樣品中纖維蛋白、凝血劑等不同物質的影響，以及不同修飾作用下cTnI蛋白的構象會發生改變等因素，使得cTnI的檢測結果存在30~100倍的差異[5]。根據心肌損傷時血循環中90%以上為N-端、C-端被蛋白酶水解后的cTnI(30~110aa)肽段和心肌肌鈣蛋白C亞基(cTnC)形成的復合物[6]，本研究通過化學合成的方法，將cTnC與cTnI(30-110aa)用15個中性氨基酸(G4S)3組成的接頭(linker)連接在一起，構建原核表達載體，在大腸桿菌中得到cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白的高效、穩定表達，經Ni2+柱純化得到高純度重組蛋白，并制備可穩定保存的凍干品，為后續的檢測診斷、性能分析及抗體制備提供原材料，同時為制備結構穩定、用作統一校準品和質控品的cTnI奠定基礎。
1 材料與設備
1.1 菌株和質粒
質粒pUC57、pColdⅠ、菌株E.coli DH5α、BL21(DE3)為本實驗室保存。
1.2 工具酶和試劑
DNA/蛋白Marker、限制性內切酶、DNA Ligation Kit Ver 2.1(TaKaRa)；質粒提取試劑盒、DNA產物回收試劑盒(天根)；小牛血清(Thermo)；飛測?心肌肌鈣蛋白I(cTnI)定量檢測試劑盒(萬孚公司)；引物的合成與測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.3 儀器設備
AKTA UPC100 Purifier純化儀(GE公司)；蛋白電泳儀、核酸電泳儀、凝膠成像系統(Bio Rad公司)；凍干機Alpha 1-2/LD PLUS(Martin Christ公司)；飛測?免疫熒光檢測儀(Ⅱ代)(萬孚公司)。
2 方法
2.1 目的基因片段
GenBank中查詢人源cTnI、cTnC基因片段，由金唯智公司合成cTnI保守序列[30aa~110aa，約81個氨基酸-cTnI(P)]、cTnC基因全長序列(約161個氨基酸)，并構建在pUC57載體上。在cTnI(P)上游引入NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點；下游引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點；在cTnC上游引入NdeⅠ酶切位點，cTnC下游引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位點，并在HindⅢ和BamHⅠ酶切位點之間加上一個編碼15個氨基酸的短肽linker，堿基序列為gggggtggcggttcaggcgggggtggcagtgggggcggtgg gtct，氨基酸序列為(G4S)3。
2.2 pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)表達載體的構建
2.2.1 pColdⅠ-cTnI(P)載體構建
pUC57-cTnI(P)質粒、pColdⅠ質粒分別經NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切，回收cTnI(P)基因片段和pColdⅠ載體片段，連接后產物轉化DH5α感受態，經PCR及酶切鑒定出pColdⅠ-cTnI(P)陽性克隆, 如圖 1所示。
圖1
重組質粒pColdⅠ-cTnI(P)構建過程
Figure1.
Building process of recombinant plasmid pColdⅠ-cTnI(P)
2.2.2 pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)載體構建
pUC57-cTnC-linker質粒、pColdⅠ-cTnI(P)質粒分別經NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切，回收cTnC-linker片段和pColdⅠ-cTnI(P)片段，連接后產物轉化DH5α感受態，經PCR及酶切鑒定出pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)陽性克隆，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，鑒定出正確的pColdⅠ-cTnC-linker-cTnI(P)表達載體，如圖 2所示。
圖2
重組質粒pColdⅠ-cTnC-linker-Tn I(P)構建過程
Figure2.
Building process of recombinant plasmid pColdⅠ-cTnC-linker-Tn I(P)
2.3 cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白的誘導表達
將pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)質粒轉入BL21(DE3)感受態中，復蘇后涂布于含氨芐抗生素(100 mg/L)的LB平板，37℃過夜培養。挑取5~6個單菌落至5 mL液體LB培養基中，37℃震蕩培養5 h，根據載體自身特點及蛋白表達方式，優化誘導條件，在菌液OD600為0.6時加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG誘導蛋白表達，20℃震蕩培養過夜。離心收集菌體后加入約1/10菌液體積的超聲裂解液(20 mmol/L PB緩沖液，pH 6.5；1 mmol/L苯甲基磺酰氟)重懸，超聲波破碎菌體；12 000 r/min，20 min，4℃)分離上清和沉淀，經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)檢測，重組蛋白以可溶性蛋白形式表達。
2.4 cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白的純化
pColdⅠ載體在cspA啟動子下游有His-tag序列，將菌體超聲破碎上清液用Ni2+ Sepharose 6 Fast Flow親和層析柱純化，收集洗脫液裝入透析袋，置于保存緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，0.5 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，5% glycerol)中過夜透析脫鹽，經SDS-PAGE檢測后分裝保存于-80℃。
2.5 cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白活性精密度及凍干品穩定性檢測
用Wondfo飛測?心肌肌鈣蛋白I(cTnI)定量檢測試劑盒[熒光免疫層析法，檢測范圍：0.03~50.0 ng/mL，臨界值(cut off)：0.3 ng/mL]檢測純化后的cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白活性，計算批內精密度。根據試劑盒的檢測范圍，將融合蛋白溶液稀釋成位于檢測范圍內的高(H)、中(M)、低(L)三個不同的濃度。以15%小牛血清、20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mmol/L EDTA、0.15 mol/L NaCl(pH 7.5)為凍干稀釋液，-80℃冷凍4 h后，0.03 mbar真空冷凍干燥18 h。每個濃度隨機選取10支凍干品，分別置于37、25、4℃跟蹤檢測不同溫度下的蛋白活性。
3 結果
3.1 pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)表達載體的構建與鑒定
3.1.1 pColdⅠ-cTnI(P)載體構建與鑒定
pUC57-cTnI(P)質粒、pColdⅠ質粒分別經NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切，回收cTnI(P)基因片段和pColdⅠ載體片段，連接構建pColdⅠ-cTnI(P)載體，經BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切得到249 bp的片段，鑒定出pColdⅠ-cTnI(P)陽性克隆，如圖 3所示。
圖3
pColdⅠ-cTnI(P)酶切鑒定
M：DNA Marker DL 5000；1-3：重組質粒pColdⅠ-cTnI(P)酶切鑒定
Figure3. Restriction map of pColdⅠ-cTnI(P)Lane M: DL5000; Lane 1-3: enzyme digestion assay of recombinant plasmid
3.1.2 pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)載體構建與鑒定
重組pColdⅠ-cTnI(P)質粒及PUC57-cTnI-linker質粒，經NdeⅠ、BamHⅠ雙酶切，回收pColdⅠ-cTnI(P)大片段及cTnI-linker片段，連接構建pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)載體，經HindⅢ酶切，得到306 bp大小的片段，與預期結果一致，如圖 4所示；將重組質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結果與預期序列完全一致。
圖4
pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)酶切鑒定
M：DNA Marker DL 5000；1-3：重組質粒pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)酶切鑒定
Figure4. Restriction map of pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)Lane M: DL5000; Lane 1-3: enzyme digestion assay of recombinant plasmid
3.2 cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白在大腸桿菌中的誘導表達
轉化了pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)質粒的大腸桿菌，經IPTG誘導培養，收集菌體經超聲波破碎后進行SDS-PAGE，結果顯示重組cTnC-linker-TnI(P)在大腸桿菌中以可溶性蛋白表達，條帶大小約為32.4 kD。菌體超聲破碎上清液經Ni2+ Sepharose 6 Fast Flow親和層析柱純化，透析脫鹽后取樣進行SDS-PAGE電泳，經Bio-Rad Gel Doc XR+凝膠成像系統分析，純化后的cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白純度大于95%，如圖 5所示。
圖5
cTnC-linker-TnI(P)表達產物及純化后蛋白SDS-PAGE分析
M：低分子量標準蛋白；1：誘導菌體；2：誘導菌體超聲破碎后的可溶蛋白；3：誘導菌體超聲破碎后的沉淀；4：純化后cTnC-linker-TnI(P)
Figure5. SDS-PAGE analysis of cTnC-linker-TnI(P) products and purified proteinLane M: Protein M W marker; Lane 1: induced expression of cTnC-linker-TnI(P) in
3.3 cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白活性精密度及凍干品的穩定性檢測
隨機抽取H、M、L三個濃度的凍干品各10支，使用萬孚飛測?心肌肌鈣蛋白I(cTnI)定量檢測試劑盒檢測其精密度。同時對置于37、25、4℃的凍干品進行跟蹤檢測。結果顯示：cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白凍干品批內精密度良好，可在37℃穩定保存至少10 d，在25℃和4℃穩定保存4個月以上，結果如表 1~4所示。
表1
Wondfo FinecareTM cTnI試劑盒檢測cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白凍干品活性精密度
Table1.
CV of lyophilized cTnC-linker-TnI(P) fusion protein by wondfo FinecareTM cTnI Test
表2
cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白凍干品37℃穩定性檢測(ng/mL)
Table2.
Stability of lyophilized cTnC-linker-TnI(P) fusion protein at 37℃(ng/mL)
表3
cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白凍干品25℃穩定性檢測(ng/mL)
Table3.
Stability of lyophilized cTnC-linker-TnI(P) fusion protein at 25℃(ng/mL)
表4
cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白凍干品4℃穩定性檢測(ng/mL)
Table4.
Stability of lyophilized cTnC-linker-TnI(P) fusion protein at 4℃(ng/mL)
4 討論
早期公認的心肌損傷標志物如肌紅蛋白、肌酸激酶同工酶、乳酸脫氫酶等，均不是心肌組織所特異表達的蛋白，因此，特異性和敏感度較差，而且在心肌損傷后，它們在血清中的存在時間較短，應用于早期診斷心肌損傷時會出現較高的假陽性。cTnI特異地存在于心肌，當心肌細胞受損后釋放入血，出現時間早，持續時間長，被認為是心肌細胞的獨特標志物。美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration, FDA)于1994~1995年間批準cTnI用作AMI的實驗室診斷指標。心肌損傷患者血清中cTnI多以cTnI-TnC復合物形式存在，復合物中cTnI穩定性增加，不易被蛋白酶水解[7]。本研究以pColdⅠ為高效表達載體、大腸桿菌BL21(DE3)為宿主表達菌，采用大腸桿菌偏好的密碼子，制備cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白。linker的加入，為cTnC與cTnI蛋白折疊提供緩沖空間，保持正確空間構象，從而最大程度地保持cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白的免疫反應活性。利用目的蛋白N端的His-tag進行Ni2+柱親和層析純化，然后在蛋白復性保存液中過夜透析去鹽，得到純化的cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白。純化過程簡便快捷，減少或避免了目的蛋白的降解及修飾。使用Wondfo飛測?心肌肌鈣蛋白I(cTnI)定量檢測試劑盒檢測cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白凍干品活性，結果表明融合蛋白在含EDTA、小牛血清的基質中具有很好的穩定性，凍干品的批內精密度和不同溫度存放的穩定性均符合作為檢測試劑的質控品要求。
臨床檢測cTnI的臨界值一般在0.04~0.3 ng/mL，對檢測方法的靈敏度要求很高。國際公認的cTnI標準物質SRM2921為心肌組織中直接提取獲得，來源受限而且價格昂貴，液體形態不便運輸，易造成蛋白質的降解，因此臨床使用效果不理想。我國尚無國家認可的商品化cTnI標準品供應[8]。穩定的標準參考品和質控品是保障臨床生化免疫檢測方法可靠性、準確性的基礎。對于cTnI檢測來說，制備來源充足、純度高、分子穩定且免疫活性完整的溯源參考物質，已成為cTnI測定標準化的關鍵之一[9]。文獻報道，采用真空冷凍干燥工藝，溶液在凍干前分裝，可自動化操作，便捷準確，并可實現連續化；同時，處理條件溫和，避免蛋白質分解變性，保存最高活性，有利于長途運輸和長期保存[10]。本文在cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白凍干基質中加入EDTA和小牛血清，凍干品外觀呈白色多孔疏松結構，在室溫下可穩定保存4個月以上。使用時，加入無菌水即可迅速復溶，無須顛倒或震蕩，操作簡捷。cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白凍干品的研發為制備低成本的cTnI標準品及質控材料的后續研究奠定了基礎。
0 引言
急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是指因持久而嚴重的心肌缺血所致的部分心肌急性壞死，是臨床上嚴重危害人類生命的急癥。但是，約有25%的AMI患者發病早期沒有典型的臨床癥狀，約30%的患者缺乏心電圖的特異改變[1]。目前醫學普遍認為，心肌梗死發病1 h內的治愈率可達99%，而一旦發病超過6 h，治愈率將降至90%。因此，選擇合適的早期診斷AMI的血清標志物至關重要。心肌肌鈣蛋白(cardiac troponin, cTn)I亞基(cTnI)被視為診斷AMI的金標準[2-3]。當心肌損傷發生后，使用cTnI作為判斷心肌損傷的血清標志物，其特異性在96%以上[4]。但是，在臨床中，不同檢測方法、檢測不同的抗原表位、待檢樣品中纖維蛋白、凝血劑等不同物質的影響，以及不同修飾作用下cTnI蛋白的構象會發生改變等因素，使得cTnI的檢測結果存在30~100倍的差異[5]。根據心肌損傷時血循環中90%以上為N-端、C-端被蛋白酶水解后的cTnI(30~110aa)肽段和心肌肌鈣蛋白C亞基(cTnC)形成的復合物[6]，本研究通過化學合成的方法，將cTnC與cTnI(30-110aa)用15個中性氨基酸(G4S)3組成的接頭(linker)連接在一起，構建原核表達載體，在大腸桿菌中得到cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白的高效、穩定表達，經Ni2+柱純化得到高純度重組蛋白，并制備可穩定保存的凍干品，為后續的檢測診斷、性能分析及抗體制備提供原材料，同時為制備結構穩定、用作統一校準品和質控品的cTnI奠定基礎。
1 材料與設備
1.1 菌株和質粒
質粒pUC57、pColdⅠ、菌株E.coli DH5α、BL21(DE3)為本實驗室保存。
1.2 工具酶和試劑
DNA/蛋白Marker、限制性內切酶、DNA Ligation Kit Ver 2.1(TaKaRa)；質粒提取試劑盒、DNA產物回收試劑盒(天根)；小牛血清(Thermo)；飛測?心肌肌鈣蛋白I(cTnI)定量檢測試劑盒(萬孚公司)；引物的合成與測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.3 儀器設備
AKTA UPC100 Purifier純化儀(GE公司)；蛋白電泳儀、核酸電泳儀、凝膠成像系統(Bio Rad公司)；凍干機Alpha 1-2/LD PLUS(Martin Christ公司)；飛測?免疫熒光檢測儀(Ⅱ代)(萬孚公司)。
2 方法
2.1 目的基因片段
GenBank中查詢人源cTnI、cTnC基因片段，由金唯智公司合成cTnI保守序列[30aa~110aa，約81個氨基酸-cTnI(P)]、cTnC基因全長序列(約161個氨基酸)，并構建在pUC57載體上。在cTnI(P)上游引入NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點；下游引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點；在cTnC上游引入NdeⅠ酶切位點，cTnC下游引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位點，并在HindⅢ和BamHⅠ酶切位點之間加上一個編碼15個氨基酸的短肽linker，堿基序列為gggggtggcggttcaggcgggggtggcagtgggggcggtgg gtct，氨基酸序列為(G4S)3。
2.2 pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)表達載體的構建
2.2.1 pColdⅠ-cTnI(P)載體構建
pUC57-cTnI(P)質粒、pColdⅠ質粒分別經NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切，回收cTnI(P)基因片段和pColdⅠ載體片段，連接后產物轉化DH5α感受態，經PCR及酶切鑒定出pColdⅠ-cTnI(P)陽性克隆, 如圖 1所示。
圖1
重組質粒pColdⅠ-cTnI(P)構建過程
Figure1.
Building process of recombinant plasmid pColdⅠ-cTnI(P)
2.2.2 pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)載體構建
pUC57-cTnC-linker質粒、pColdⅠ-cTnI(P)質粒分別經NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切，回收cTnC-linker片段和pColdⅠ-cTnI(P)片段，連接后產物轉化DH5α感受態，經PCR及酶切鑒定出pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)陽性克隆，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，鑒定出正確的pColdⅠ-cTnC-linker-cTnI(P)表達載體，如圖 2所示。
圖2
重組質粒pColdⅠ-cTnC-linker-Tn I(P)構建過程
Figure2.
Building process of recombinant plasmid pColdⅠ-cTnC-linker-Tn I(P)
2.3 cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白的誘導表達
將pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)質粒轉入BL21(DE3)感受態中，復蘇后涂布于含氨芐抗生素(100 mg/L)的LB平板，37℃過夜培養。挑取5~6個單菌落至5 mL液體LB培養基中，37℃震蕩培養5 h，根據載體自身特點及蛋白表達方式，優化誘導條件，在菌液OD600為0.6時加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG誘導蛋白表達，20℃震蕩培養過夜。離心收集菌體后加入約1/10菌液體積的超聲裂解液(20 mmol/L PB緩沖液，pH 6.5；1 mmol/L苯甲基磺酰氟)重懸，超聲波破碎菌體；12 000 r/min，20 min，4℃)分離上清和沉淀，經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)檢測，重組蛋白以可溶性蛋白形式表達。
2.4 cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白的純化
pColdⅠ載體在cspA啟動子下游有His-tag序列，將菌體超聲破碎上清液用Ni2+ Sepharose 6 Fast Flow親和層析柱純化，收集洗脫液裝入透析袋，置于保存緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，0.5 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，5% glycerol)中過夜透析脫鹽，經SDS-PAGE檢測后分裝保存于-80℃。
2.5 cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白活性精密度及凍干品穩定性檢測
用Wondfo飛測?心肌肌鈣蛋白I(cTnI)定量檢測試劑盒[熒光免疫層析法，檢測范圍：0.03~50.0 ng/mL，臨界值(cut off)：0.3 ng/mL]檢測純化后的cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白活性，計算批內精密度。根據試劑盒的檢測范圍，將融合蛋白溶液稀釋成位于檢測范圍內的高(H)、中(M)、低(L)三個不同的濃度。以15%小牛血清、20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mmol/L EDTA、0.15 mol/L NaCl(pH 7.5)為凍干稀釋液，-80℃冷凍4 h后，0.03 mbar真空冷凍干燥18 h。每個濃度隨機選取10支凍干品，分別置于37、25、4℃跟蹤檢測不同溫度下的蛋白活性。
3 結果
3.1 pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)表達載體的構建與鑒定
3.1.1 pColdⅠ-cTnI(P)載體構建與鑒定
pUC57-cTnI(P)質粒、pColdⅠ質粒分別經NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切，回收cTnI(P)基因片段和pColdⅠ載體片段，連接構建pColdⅠ-cTnI(P)載體，經BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切得到249 bp的片段，鑒定出pColdⅠ-cTnI(P)陽性克隆，如圖 3所示。
圖3
pColdⅠ-cTnI(P)酶切鑒定
M：DNA Marker DL 5000；1-3：重組質粒pColdⅠ-cTnI(P)酶切鑒定
Figure3. Restriction map of pColdⅠ-cTnI(P)Lane M: DL5000; Lane 1-3: enzyme digestion assay of recombinant plasmid
3.1.2 pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)載體構建與鑒定
重組pColdⅠ-cTnI(P)質粒及PUC57-cTnI-linker質粒，經NdeⅠ、BamHⅠ雙酶切，回收pColdⅠ-cTnI(P)大片段及cTnI-linker片段，連接構建pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)載體，經HindⅢ酶切，得到306 bp大小的片段，與預期結果一致，如圖 4所示；將重組質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結果與預期序列完全一致。
圖4
pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)酶切鑒定
M：DNA Marker DL 5000；1-3：重組質粒pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)酶切鑒定
Figure4. Restriction map of pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)Lane M: DL5000; Lane 1-3: enzyme digestion assay of recombinant plasmid
3.2 cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白在大腸桿菌中的誘導表達
轉化了pColdⅠ-cTnC-linker-TnI(P)質粒的大腸桿菌，經IPTG誘導培養，收集菌體經超聲波破碎后進行SDS-PAGE，結果顯示重組cTnC-linker-TnI(P)在大腸桿菌中以可溶性蛋白表達，條帶大小約為32.4 kD。菌體超聲破碎上清液經Ni2+ Sepharose 6 Fast Flow親和層析柱純化，透析脫鹽后取樣進行SDS-PAGE電泳，經Bio-Rad Gel Doc XR+凝膠成像系統分析，純化后的cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白純度大于95%，如圖 5所示。
圖5
cTnC-linker-TnI(P)表達產物及純化后蛋白SDS-PAGE分析
M：低分子量標準蛋白；1：誘導菌體；2：誘導菌體超聲破碎后的可溶蛋白；3：誘導菌體超聲破碎后的沉淀；4：純化后cTnC-linker-TnI(P)
Figure5. SDS-PAGE analysis of cTnC-linker-TnI(P) products and purified proteinLane M: Protein M W marker; Lane 1: induced expression of cTnC-linker-TnI(P) in
3.3 cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白活性精密度及凍干品的穩定性檢測
隨機抽取H、M、L三個濃度的凍干品各10支，使用萬孚飛測?心肌肌鈣蛋白I(cTnI)定量檢測試劑盒檢測其精密度。同時對置于37、25、4℃的凍干品進行跟蹤檢測。結果顯示：cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白凍干品批內精密度良好，可在37℃穩定保存至少10 d，在25℃和4℃穩定保存4個月以上，結果如表 1~4所示。
表1
Wondfo FinecareTM cTnI試劑盒檢測cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白凍干品活性精密度
Table1.
CV of lyophilized cTnC-linker-TnI(P) fusion protein by wondfo FinecareTM cTnI Test
表2
cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白凍干品37℃穩定性檢測(ng/mL)
Table2.
Stability of lyophilized cTnC-linker-TnI(P) fusion protein at 37℃(ng/mL)
表3
cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白凍干品25℃穩定性檢測(ng/mL)
Table3.
Stability of lyophilized cTnC-linker-TnI(P) fusion protein at 25℃(ng/mL)
表4
cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白凍干品4℃穩定性檢測(ng/mL)
Table4.
Stability of lyophilized cTnC-linker-TnI(P) fusion protein at 4℃(ng/mL)
4 討論
早期公認的心肌損傷標志物如肌紅蛋白、肌酸激酶同工酶、乳酸脫氫酶等，均不是心肌組織所特異表達的蛋白，因此，特異性和敏感度較差，而且在心肌損傷后，它們在血清中的存在時間較短，應用于早期診斷心肌損傷時會出現較高的假陽性。cTnI特異地存在于心肌，當心肌細胞受損后釋放入血，出現時間早，持續時間長，被認為是心肌細胞的獨特標志物。美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration, FDA)于1994~1995年間批準cTnI用作AMI的實驗室診斷指標。心肌損傷患者血清中cTnI多以cTnI-TnC復合物形式存在，復合物中cTnI穩定性增加，不易被蛋白酶水解[7]。本研究以pColdⅠ為高效表達載體、大腸桿菌BL21(DE3)為宿主表達菌，采用大腸桿菌偏好的密碼子，制備cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白。linker的加入，為cTnC與cTnI蛋白折疊提供緩沖空間，保持正確空間構象，從而最大程度地保持cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白的免疫反應活性。利用目的蛋白N端的His-tag進行Ni2+柱親和層析純化，然后在蛋白復性保存液中過夜透析去鹽，得到純化的cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白。純化過程簡便快捷，減少或避免了目的蛋白的降解及修飾。使用Wondfo飛測?心肌肌鈣蛋白I(cTnI)定量檢測試劑盒檢測cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白凍干品活性，結果表明融合蛋白在含EDTA、小牛血清的基質中具有很好的穩定性，凍干品的批內精密度和不同溫度存放的穩定性均符合作為檢測試劑的質控品要求。
臨床檢測cTnI的臨界值一般在0.04~0.3 ng/mL，對檢測方法的靈敏度要求很高。國際公認的cTnI標準物質SRM2921為心肌組織中直接提取獲得，來源受限而且價格昂貴，液體形態不便運輸，易造成蛋白質的降解，因此臨床使用效果不理想。我國尚無國家認可的商品化cTnI標準品供應[8]。穩定的標準參考品和質控品是保障臨床生化免疫檢測方法可靠性、準確性的基礎。對于cTnI檢測來說，制備來源充足、純度高、分子穩定且免疫活性完整的溯源參考物質，已成為cTnI測定標準化的關鍵之一[9]。文獻報道，采用真空冷凍干燥工藝，溶液在凍干前分裝，可自動化操作，便捷準確，并可實現連續化；同時，處理條件溫和，避免蛋白質分解變性，保存最高活性，有利于長途運輸和長期保存[10]。本文在cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白凍干基質中加入EDTA和小牛血清，凍干品外觀呈白色多孔疏松結構，在室溫下可穩定保存4個月以上。使用時，加入無菌水即可迅速復溶，無須顛倒或震蕩，操作簡捷。cTnC-linker-TnI(P)融合蛋白凍干品的研發為制備低成本的cTnI標準品及質控材料的后續研究奠定了基礎。
