聚乙二醇(PEG)修飾是延長蛋白藥物體內半衰期和降低免疫原性的有效途徑。經過單因素實驗, 探索了PEG對LL-37與干擾素(IFN)-α2a融合蛋白修飾的最佳工藝條件, 分別為:PEG分子量為5 000、融合蛋白濃度為0.6 mg/mL、蛋白與PEG5000的物質的量之比為1：10、反應溫度為4℃、反應時間為4 h、pH為9.0。經正交實驗表明, 3個主要因素對蛋白修飾率的影響順序為融合蛋白濃度＞蛋白mPEG5000-SS的物質量之比＞pH, 最佳工藝條件為融合蛋白濃度為0.6 mg/mL、蛋白與mPEG5000-SS的物質的量之比為1：10、pH為8.8。在最佳修飾條件下, 三次平行實驗的平均蛋白修飾率為86.98%。在最佳修飾條件下, 蛋白的修飾率可穩定達到85%以上, LL-37與IFN-α2a融合蛋白的干擾素活性保持率為58%以上, 抗菌活性的保持率可達到97%以上。
引用本文： 張明杰. 聚乙二醇對LL-37與干擾素-α2a融合蛋白的修飾條件優化. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(6): 1261-1266. doi: 10.7507/1001-5515.20150224 復制
0 引言
Cathelicidin家族是一類在哺乳動物、禽類、魚類及爬行動物體內表達的保守的抗菌肽[1]。LL-37是人體唯一合成的Cathelicidin家族抗菌肽，主要由免疫細胞和上皮細胞表達合成[2]。LL-37的序列為LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVP RTES，因前兩個均為LL(亮氨酸)且序列長度為37而得名[3]。LL-37通過結構中形成的6個正電荷的雙親超螺旋與細菌細胞膜磷脂的親水部結合，然后其疏水部翻轉插入磷脂雙分子層，從而引起細胞膜的破壞[4]。LL-37對革蘭氏陽性和陰性菌均有效果，抗菌譜廣，受到研究與應用領域廣泛重視。
干擾素(interferon, IFN)是由免疫細胞產生的一類糖蛋白，具有抗腫瘤、抗病毒和調節免疫的作用，在臨床上獲得廣泛應用[5-6]。干擾素在臨床使用中存在的主要問題是由于其分子量小，容易被血清中的蛋白酶降解和被腎小球過濾掉。克服干擾素使用缺陷的有效手段，一是通過融合表達，增加分子量[7-8]；二是通過表面修飾，防止蛋白酶的降解[9]。本實驗室曾將LL-37與rhIFN-α2a進行融合表達，在制備出具有抗菌、抗病毒和抗腫瘤的三功能蛋白的同時，也延長了IFN-α2a在人體內的半衰期，其使用效果增強。本實驗中，通過將該融合蛋白經過聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)修飾，以進一步延長其半衰期，增強其作用效果。
1 材料與方法
1.1 材料
LL-37與IFN-α2a融合蛋白樣品(3.541 mg/mL)由本實驗室制備。PEG(相對分子質量為5 000、10 000和20 000)為Nektar公司產品。單甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺琥珀酸脂(mPEG-SS，PEG分子量5 000、10 000和20 000)購自上海西寶生物科技有限公司。
1.2 試劑
丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、SDS和考馬斯亮藍R-250為Sigma公司產品。其余試劑均為分析純。
1.3 設備
凝膠成像系統：GelDoc-It TS Imaging System型，上海金鵬分析儀器有限公司；層析儀：Akta Explorer。
1.4 PEG表觀質量檢測
PEG5000、PEG10000、PEG20000用硼酸-硼砂緩沖液(pH 9.0)溶解成終濃度10 mg/mL。參照《中國藥典》三部(2010版)方法進行SDS-PAGE分析，采用而磺染色，用凝膠成像系統拍照[10]。
1.5 PEG對LL-37與IFN-α2a融合蛋白修飾條件的單因素實驗
出發條件選擇為蛋白濃度0.6 mg/mL、蛋白：PEG(物質的量之比)=1：10、反應溫度4℃、反應時間6 h、pH 7.0。
(1) PEG分子量對修飾產物的影響：按出發條件建立3個反應體系，分別加入mPEG5000-SS、PEG10000-SS和PEG20000-SS，反應結束后進行SDS-PAGE分析。
(2) 融合蛋白濃度對產物修飾率的影響：按濃度梯度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL配制修飾反應體系，其它條件同出發條件。反應完后取樣分析融合蛋白修飾率。
(3) 蛋白與mPEG-SS物質的量之比對產物修飾率的影響：在上述確定的最佳蛋白濃度下，分別取蛋白：mPEG-SS(物質的量之比)=1：5、1：10、1：15、1：20、1：25配制修飾反應體系，其它條件同出發條件。取樣分析融合蛋白修飾率。
(4) 反應時間對產物修飾率的影響：在前述確定的蛋白濃度、蛋白PEG物質的量之比，配制7份反應體系，其它條件同出發條件，分別反應2、4、6、8、10、12、14 h，取樣分析融合蛋白修飾率。
(5) 反應溫度對產物修飾率的影響：在前述確定的各最佳條件下，制備4份修飾反應液(pH 7.0)，分別在4、10、20、30℃條件下反應，取樣分析融合蛋白修飾率。
(6) pH對融合蛋白修飾率的影響：在前述確定的最優條件下，制備10份反應液，分別調節pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，取樣分析融合蛋白修飾率。
1.6 PEG對LL-37與IFN-α2a融合蛋白修飾的正交實驗設計
根據單因素實驗結果，選擇融合蛋白濃度(A)、蛋白與mPEG-SS物質的量之比(B)和pH (C)3個因素，以蛋白修飾率為響應結果，進行正交實驗設計。正交實驗設計及實驗結果分析采用軟件Minitable15。因素及因素水平如表 1所示。對正交實驗的結果進行3次平行實驗驗證。
表1
正交實驗的因素與水平
Table1.
Factors and levels of orthogonal design
1.7 相對分子質量與修飾率的測定
通過凝膠電泳成像系統獲得凝膠圖譜，用系統軟件進行掃描分析。根據蛋白Marker估計PEG及其修飾產物的相對分子質量，并按下式計算蛋白修飾率：
| $蛋白修飾率\left( \% \right) = \frac{{被修飾蛋白條帶的體積}}{{原蛋白條帶的體積}} \times 100\% $ |
1.8 修飾產物的體外活性檢測
修飾產物的干擾素活性按《中國藥典》三部(2010版)附錄中干擾素將從測定方法檢測其體外活性，并對照原料蛋白活性，計算活性保留率。
修飾產物的抗菌活性參照文獻[11]進行。用大腸桿菌ATCC 25922作為檢測菌種，用雙層瓊脂糖打孔法測定。底層培養基上打直徑3 mm的圓孔，每孔加10μL發酵液，37℃孵化3 h后，在底層上覆蓋一層營養瓊脂，37℃繼續培養20 h，測量無菌生長的透明圈直徑。并對照原料蛋白活性，計算活性保留率。
2 實驗結果
2.1 PEG的表觀分子量
三種分子量的PEG的SDS-PAGE結果如圖 1所示。
圖1
PEG5000、PEG10000與PEG20000的SDS-PAGE圖譜
Figure1.
SDS-PAGE map of PEG5000, PEG10000 and PEG20000
與蛋白Marker相比，PEG5000的分子量約為14 000，PEG10000的分子量約為29 000，PEG20000的分子量約為40 000，較其實際的分子量均偏大。PEG5000與PEG10000約偏大到3倍，PEG20000約偏大到2倍。偏大的原因與SDS-PAGE測量分子大小是以鏈長度為標準有關。在相同鏈長條件下，組成鏈長單元的平均氨基酸分子量要比乙二醇大，故在以蛋白為標準對照的體系中，PEG的表觀分子量就顯得偏大。
2.2 PEG分子量對修飾產物的影響
PEG分子量對LL-37與IFN-α2a融合蛋白修飾的影響如圖 2所示。
圖2
PEG分子量對LL-37與IFN-α2a融合蛋白修飾的影響
Marker：蛋白質分子量標準(低)；0：未修飾的融合蛋白；1：PEG5000修飾的融合蛋白；2：PEG10000修飾的融合蛋白；3：PEG20000修飾的融合蛋白
Figure2. Effects of PEG molecular weight on LL-37 and IFN-α2a fusion protein modificationMarker: proteins molecular weight standards (low); 0: fused proteins without PEG modification; 1: fused proteins with PEG5000 modification; 2: fused proteins with PEG10000 modification; 3: fused proteins with PEG20000 modification
對比未修飾的融合蛋白條帶，三種分子量PEG修飾的融合蛋白均未完全修飾，其中PEG5000修飾后殘留的未修飾所占比重最小，約為12 %。在PEG5000所修飾的條帶中，依次出現了三條帶，對應分子量分別為約39 000、53 000和67 000，這與PEG5000單分子修飾、雙分子修飾和三分子修飾融合蛋白的分子量相當(PEG表觀分子量+融合蛋白分子量)，表明在修飾過程中，PEG對融合蛋白的修飾位點可以有三個，并可同時實現修飾。PEG10000的修飾產物中，只出現了單點修飾和二點修飾，未見有明顯的三點修飾條帶。PEG20000的修飾產物中，只出現了一個條帶，可能只有明顯的單點修飾發生。出現這種情況可能的原因是分子量越大，相對移動速度就越低，因此產生修飾所需的碰撞概率就降低，從而導致PEG分子量越大，修飾越困難。如果PEG的分子量過小，有可能會導致修飾后對蛋白的保護作用也相應減弱，因此，綜合考慮選擇PEG5000作為后續實驗的分子量[12]。
2.3 融合蛋白濃度對產物修飾率的影響
融合蛋白濃度對產物修飾率的影響結果如圖 3所示。
圖3
融合蛋白濃度對產物修飾率的影響
Figure3.
Effects of fusion protein concentration on modification rate
融合蛋白濃度在0.4~0.7 mg/mL時，修飾率較高，其中在0.6 mg/mL時修飾率最高，達到84%。按一級化學反應理論，反應物的濃度越高，反應速度越快，因此隨蛋白濃度的升高，修飾反應速度應該越來越快，但修飾率卻并未一直隨蛋白濃度升高而增加，反而在高濃度時出現下降。這可能是因為蛋白濃度升高后，在PEG濃度不變的情況下，PEG修飾受限所致。綜合各方面情況，選擇0.6 mg/mL為最佳蛋白濃度。
2.4 蛋白與PEG物質的量之比對融合蛋白修飾率的影響
蛋白與PEG物質的量之比對融合蛋白修飾率的影響結果如圖 4所示。
圖4
蛋白與PEG摩爾比對融合蛋白修飾率的影響
Figure4.
Effects of protein and PEG mole rate on fusion protein modification rate
如圖 4所示，蛋白與PEG5000的物質的量之比為1：10時，融合蛋白的修飾率達到最大值。低于1：10時修飾率下降，可能是PEG物質的量濃度低，反應速率下降的原因。物質的量之比超過1：10后，蛋白修飾率也下降，可能是PEG自身濃度升高后，體系粘度也升高，導致PEG擴散速率下降所致。綜合以上實驗結果，選擇蛋白與PEG5000的物質的量之比為1：10為最佳反應條件。
2.5 反應時間對融合蛋白修飾率的影響
反應時間對融合蛋白修飾率的影響如圖 5所示。PEG對融合蛋白的修飾反應速度在2 h以內較快，修飾率直線上升，至2 h時，修飾率已經達到75%以上。2 h之后，反應速率逐漸下降，至4 h后，反應速率趨于零，表現為修飾率自2 h后上升速度逐漸降低，至4 h后，累積修飾率達到85%以上后，基本不再上升，維持平衡。從盡可能提高修飾速率的角度考慮，選擇4 h為最佳修飾反應時間。
圖5
反應時間對融合蛋白修飾率的影響
Figure5.
Effect of reaction time on fusion protein modification rate
2.6 反應溫度對融合蛋白修飾率的影響
反應溫度對融合蛋白修飾率的影響如圖 6所示。
圖6
反應溫度對融合蛋白修飾率的影響
Figure6.
Effects of reaction temperature on fusion protein modification rate
如圖 6所示，溫度對提高融合蛋白修飾率未有明顯的影響。根據化學反應的一級方程理論，隨溫度升高分子擴散加快，反應速率相應上升，但在本實驗中，并未表現出對修飾速率的影響。因此融合蛋白修飾在反應時間4 h以上，溫度可能并不會對修飾率產生明顯影響。溫度對修飾速率影響的具體情況需要進一步研究。從更好保持蛋白的穩定性角度考慮，選擇4℃為融合蛋白修飾反應的溫度。
2.7 pH對融合蛋白修飾率的影響
pH對融合蛋白修飾率的影響如圖 7所示。
圖7
pH對融合蛋白修飾率的影響
Figure7.
Effects of pH on fusion protein modification rate
如圖 7所示，隨著pH值的升高，修飾率逐漸升高。PEG與蛋白的修飾反應主要是PEG的羥基與蛋白氨基酸殘基的氨基或羧基發生縮合反應。堿性環境對羥基的縮合反應有利，酸性環境卻有利于酯鍵的水解。因此，在堿性環境下，PEG對融合蛋白的修飾能力將會加強。從實驗結果看，在pH 9左右時，反應速率達到最高值，因此pH 9為PEG5000對LL-37與IFN-α2a融合蛋白修飾的最佳pH條件。
2.8 正交實驗結果
單因素實驗的結果表明，修飾率對溫度的變化不敏感。反應時間從充分反應的角度選擇4 h，在該時間點前后，修飾率對時間的反應亦不敏感。綜合上述結果，在正交實驗設計時，最終舍棄了溫度與時間兩個因素，選擇融合蛋白濃度(A)、蛋白與mPEG-SS物質的量之比(B)和pH (C)3個因素進行正交實驗設計。正交實驗的結果如表 2所示。方差分析如表 3所示。
表2
L9(33)正交實驗結果
Table2.
Results of L9(33) orthogonal array design tests
表3
正交實驗方差分析結果
Table3.
Variance analysis's results of orthogonal array design
綜合表 2與表 3的結果，融合蛋白濃度(A)屬于顯著性影響因素(P＜0.05), 三個因素影響的大小順序為A＞B＞C。最佳工藝條件為A2B2C1，即融合蛋白濃度0.6 mg/mL、蛋白與mPEG-SS物質量之比為1：10、pH 8.8。
在最佳工藝條件下，3次平行實驗所獲得的蛋白修飾率依次為86.92%、87.18%和86.83%，平均為86.98%。
2.9 修飾產物的體外活性檢測
經檢測，LL-37與IFN-α2a融合蛋白中原始干擾素的活性為7.86×106 IU/mg。經上述探索的最佳工藝修飾后，LL-37與IFN-α2a融合蛋白的干擾素活性為4.58×106 IU/mg，干擾素活性保持率為58.3%。另外，LL-37與IFN-α2a融合蛋白原始的抗菌活性為1.32 cm/mg，修飾后為1.28 cm/mg，抗菌活性保持率為97.0%，表明PEG對LL-37與IFN-α2a融合蛋白的修飾對其中LL-37部分沒有明顯的影響。
3 討論
PEG修飾是延長蛋白藥物體內半衰期和免疫原性的有效途徑。經過單因素實驗，探索了PEG對LL-37與IFN-α2a融合蛋白修飾的最佳工作條件為最佳PEG分子量為5000、融合蛋白濃度為0.6 mg/mL、蛋白與mPEG5000-SS的物質量之比為1：10、反應溫度為4℃、反應時間為4 h、pH為9.0。經正交實驗，對融合蛋白濃度(A)、蛋白與mPEG5000-SS的物質量之比(B)和pH(C)等3個因素進行進一步優化，結果表明3個因素對修飾率的影響大小依次為A＞B＞C，最佳工藝條件為A2B2C1，即融合蛋白濃度為0.6 mg/mL、蛋白與mPEG5000-SS的物質量之比為1：10、pH為8.8。在最佳修飾條件下，三次平行實驗的平均蛋白修飾率為86.98%。LL-37與IFN-α2a融合蛋白的干擾素活性保持率為58%以上，抗菌活性的保持率可達到97%以上。
PEG修飾提高蛋白藥物體內半衰期的機制主要有兩方面：一方面增加了蛋白的分子量，減少了腎小球對其過濾作用；另一方面，掩蓋了蛋白酶的作用位點，減少了蛋白酶的降解作用。PEG修飾降低免疫原性的原理主要是對抗原決定簇的掩蓋作用所致。PEG5000修飾LL-37與IFN-α2a融合蛋白后對其體內半衰期延長和免疫原性的影響情況，并未在本實驗中給予驗證，還需要進一步進行實驗檢驗。PEG修飾引起修飾對象活性下降，是PEG修飾最主要的缺陷[13]。部分氨基酸殘基的氨基參與了IFN-α2a的受體結合位點結構組裝，如果在修飾過程中，PEG位點發生在受體結合部位，就會導致干擾素活性的降低。要克服這一缺陷，需要開發定向修飾技術。
蛋白表面可供PEG修飾的基團有氨基、羧基、巰基、糖基等。以蛋白表面氨基為對象的修飾技術，由于其成熟且容易操作，是蛋白藥物修飾的首選。美國FDA自1990年以來批準的PEG修飾蛋白藥物均采用氨基修飾。由于蛋白表達氨基分布的廣泛性，導致在很大程度上修飾存在隨機性，產品質量難以穩定重復，為此以含量稀少的基團(如巰基和糖基)為目標的定向修飾成為近年來的研究熱點[14]。
0 引言
Cathelicidin家族是一類在哺乳動物、禽類、魚類及爬行動物體內表達的保守的抗菌肽[1]。LL-37是人體唯一合成的Cathelicidin家族抗菌肽，主要由免疫細胞和上皮細胞表達合成[2]。LL-37的序列為LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVP RTES，因前兩個均為LL(亮氨酸)且序列長度為37而得名[3]。LL-37通過結構中形成的6個正電荷的雙親超螺旋與細菌細胞膜磷脂的親水部結合，然后其疏水部翻轉插入磷脂雙分子層，從而引起細胞膜的破壞[4]。LL-37對革蘭氏陽性和陰性菌均有效果，抗菌譜廣，受到研究與應用領域廣泛重視。
干擾素(interferon, IFN)是由免疫細胞產生的一類糖蛋白，具有抗腫瘤、抗病毒和調節免疫的作用，在臨床上獲得廣泛應用[5-6]。干擾素在臨床使用中存在的主要問題是由于其分子量小，容易被血清中的蛋白酶降解和被腎小球過濾掉。克服干擾素使用缺陷的有效手段，一是通過融合表達，增加分子量[7-8]；二是通過表面修飾，防止蛋白酶的降解[9]。本實驗室曾將LL-37與rhIFN-α2a進行融合表達，在制備出具有抗菌、抗病毒和抗腫瘤的三功能蛋白的同時，也延長了IFN-α2a在人體內的半衰期，其使用效果增強。本實驗中，通過將該融合蛋白經過聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)修飾，以進一步延長其半衰期，增強其作用效果。
1 材料與方法
1.1 材料
LL-37與IFN-α2a融合蛋白樣品(3.541 mg/mL)由本實驗室制備。PEG(相對分子質量為5 000、10 000和20 000)為Nektar公司產品。單甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺琥珀酸脂(mPEG-SS，PEG分子量5 000、10 000和20 000)購自上海西寶生物科技有限公司。
1.2 試劑
丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、SDS和考馬斯亮藍R-250為Sigma公司產品。其余試劑均為分析純。
1.3 設備
凝膠成像系統：GelDoc-It TS Imaging System型，上海金鵬分析儀器有限公司；層析儀：Akta Explorer。
1.4 PEG表觀質量檢測
PEG5000、PEG10000、PEG20000用硼酸-硼砂緩沖液(pH 9.0)溶解成終濃度10 mg/mL。參照《中國藥典》三部(2010版)方法進行SDS-PAGE分析，采用而磺染色，用凝膠成像系統拍照[10]。
1.5 PEG對LL-37與IFN-α2a融合蛋白修飾條件的單因素實驗
出發條件選擇為蛋白濃度0.6 mg/mL、蛋白：PEG(物質的量之比)=1：10、反應溫度4℃、反應時間6 h、pH 7.0。
(1) PEG分子量對修飾產物的影響：按出發條件建立3個反應體系，分別加入mPEG5000-SS、PEG10000-SS和PEG20000-SS，反應結束后進行SDS-PAGE分析。
(2) 融合蛋白濃度對產物修飾率的影響：按濃度梯度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL配制修飾反應體系，其它條件同出發條件。反應完后取樣分析融合蛋白修飾率。
(3) 蛋白與mPEG-SS物質的量之比對產物修飾率的影響：在上述確定的最佳蛋白濃度下，分別取蛋白：mPEG-SS(物質的量之比)=1：5、1：10、1：15、1：20、1：25配制修飾反應體系，其它條件同出發條件。取樣分析融合蛋白修飾率。
(4) 反應時間對產物修飾率的影響：在前述確定的蛋白濃度、蛋白PEG物質的量之比，配制7份反應體系，其它條件同出發條件，分別反應2、4、6、8、10、12、14 h，取樣分析融合蛋白修飾率。
(5) 反應溫度對產物修飾率的影響：在前述確定的各最佳條件下，制備4份修飾反應液(pH 7.0)，分別在4、10、20、30℃條件下反應，取樣分析融合蛋白修飾率。
(6) pH對融合蛋白修飾率的影響：在前述確定的最優條件下，制備10份反應液，分別調節pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，取樣分析融合蛋白修飾率。
1.6 PEG對LL-37與IFN-α2a融合蛋白修飾的正交實驗設計
根據單因素實驗結果，選擇融合蛋白濃度(A)、蛋白與mPEG-SS物質的量之比(B)和pH (C)3個因素，以蛋白修飾率為響應結果，進行正交實驗設計。正交實驗設計及實驗結果分析采用軟件Minitable15。因素及因素水平如表 1所示。對正交實驗的結果進行3次平行實驗驗證。
表1
正交實驗的因素與水平
Table1.
Factors and levels of orthogonal design
1.7 相對分子質量與修飾率的測定
通過凝膠電泳成像系統獲得凝膠圖譜，用系統軟件進行掃描分析。根據蛋白Marker估計PEG及其修飾產物的相對分子質量，并按下式計算蛋白修飾率：
| $蛋白修飾率\left( \% \right) = \frac{{被修飾蛋白條帶的體積}}{{原蛋白條帶的體積}} \times 100\% $ |
1.8 修飾產物的體外活性檢測
修飾產物的干擾素活性按《中國藥典》三部(2010版)附錄中干擾素將從測定方法檢測其體外活性，并對照原料蛋白活性，計算活性保留率。
修飾產物的抗菌活性參照文獻[11]進行。用大腸桿菌ATCC 25922作為檢測菌種，用雙層瓊脂糖打孔法測定。底層培養基上打直徑3 mm的圓孔，每孔加10μL發酵液，37℃孵化3 h后，在底層上覆蓋一層營養瓊脂，37℃繼續培養20 h，測量無菌生長的透明圈直徑。并對照原料蛋白活性，計算活性保留率。
2 實驗結果
2.1 PEG的表觀分子量
三種分子量的PEG的SDS-PAGE結果如圖 1所示。
圖1
PEG5000、PEG10000與PEG20000的SDS-PAGE圖譜
Figure1.
SDS-PAGE map of PEG5000, PEG10000 and PEG20000
與蛋白Marker相比，PEG5000的分子量約為14 000，PEG10000的分子量約為29 000，PEG20000的分子量約為40 000，較其實際的分子量均偏大。PEG5000與PEG10000約偏大到3倍，PEG20000約偏大到2倍。偏大的原因與SDS-PAGE測量分子大小是以鏈長度為標準有關。在相同鏈長條件下，組成鏈長單元的平均氨基酸分子量要比乙二醇大，故在以蛋白為標準對照的體系中，PEG的表觀分子量就顯得偏大。
2.2 PEG分子量對修飾產物的影響
PEG分子量對LL-37與IFN-α2a融合蛋白修飾的影響如圖 2所示。
圖2
PEG分子量對LL-37與IFN-α2a融合蛋白修飾的影響
Marker：蛋白質分子量標準(低)；0：未修飾的融合蛋白；1：PEG5000修飾的融合蛋白；2：PEG10000修飾的融合蛋白；3：PEG20000修飾的融合蛋白
Figure2. Effects of PEG molecular weight on LL-37 and IFN-α2a fusion protein modificationMarker: proteins molecular weight standards (low); 0: fused proteins without PEG modification; 1: fused proteins with PEG5000 modification; 2: fused proteins with PEG10000 modification; 3: fused proteins with PEG20000 modification
對比未修飾的融合蛋白條帶，三種分子量PEG修飾的融合蛋白均未完全修飾，其中PEG5000修飾后殘留的未修飾所占比重最小，約為12 %。在PEG5000所修飾的條帶中，依次出現了三條帶，對應分子量分別為約39 000、53 000和67 000，這與PEG5000單分子修飾、雙分子修飾和三分子修飾融合蛋白的分子量相當(PEG表觀分子量+融合蛋白分子量)，表明在修飾過程中，PEG對融合蛋白的修飾位點可以有三個，并可同時實現修飾。PEG10000的修飾產物中，只出現了單點修飾和二點修飾，未見有明顯的三點修飾條帶。PEG20000的修飾產物中，只出現了一個條帶，可能只有明顯的單點修飾發生。出現這種情況可能的原因是分子量越大，相對移動速度就越低，因此產生修飾所需的碰撞概率就降低，從而導致PEG分子量越大，修飾越困難。如果PEG的分子量過小，有可能會導致修飾后對蛋白的保護作用也相應減弱，因此，綜合考慮選擇PEG5000作為后續實驗的分子量[12]。
2.3 融合蛋白濃度對產物修飾率的影響
融合蛋白濃度對產物修飾率的影響結果如圖 3所示。
圖3
融合蛋白濃度對產物修飾率的影響
Figure3.
Effects of fusion protein concentration on modification rate
融合蛋白濃度在0.4~0.7 mg/mL時，修飾率較高，其中在0.6 mg/mL時修飾率最高，達到84%。按一級化學反應理論，反應物的濃度越高，反應速度越快，因此隨蛋白濃度的升高，修飾反應速度應該越來越快，但修飾率卻并未一直隨蛋白濃度升高而增加，反而在高濃度時出現下降。這可能是因為蛋白濃度升高后，在PEG濃度不變的情況下，PEG修飾受限所致。綜合各方面情況，選擇0.6 mg/mL為最佳蛋白濃度。
2.4 蛋白與PEG物質的量之比對融合蛋白修飾率的影響
蛋白與PEG物質的量之比對融合蛋白修飾率的影響結果如圖 4所示。
圖4
蛋白與PEG摩爾比對融合蛋白修飾率的影響
Figure4.
Effects of protein and PEG mole rate on fusion protein modification rate
如圖 4所示，蛋白與PEG5000的物質的量之比為1：10時，融合蛋白的修飾率達到最大值。低于1：10時修飾率下降，可能是PEG物質的量濃度低，反應速率下降的原因。物質的量之比超過1：10后，蛋白修飾率也下降，可能是PEG自身濃度升高后，體系粘度也升高，導致PEG擴散速率下降所致。綜合以上實驗結果，選擇蛋白與PEG5000的物質的量之比為1：10為最佳反應條件。
2.5 反應時間對融合蛋白修飾率的影響
反應時間對融合蛋白修飾率的影響如圖 5所示。PEG對融合蛋白的修飾反應速度在2 h以內較快，修飾率直線上升，至2 h時，修飾率已經達到75%以上。2 h之后，反應速率逐漸下降，至4 h后，反應速率趨于零，表現為修飾率自2 h后上升速度逐漸降低，至4 h后，累積修飾率達到85%以上后，基本不再上升，維持平衡。從盡可能提高修飾速率的角度考慮，選擇4 h為最佳修飾反應時間。
圖5
反應時間對融合蛋白修飾率的影響
Figure5.
Effect of reaction time on fusion protein modification rate
2.6 反應溫度對融合蛋白修飾率的影響
反應溫度對融合蛋白修飾率的影響如圖 6所示。
圖6
反應溫度對融合蛋白修飾率的影響
Figure6.
Effects of reaction temperature on fusion protein modification rate
如圖 6所示，溫度對提高融合蛋白修飾率未有明顯的影響。根據化學反應的一級方程理論，隨溫度升高分子擴散加快，反應速率相應上升，但在本實驗中，并未表現出對修飾速率的影響。因此融合蛋白修飾在反應時間4 h以上，溫度可能并不會對修飾率產生明顯影響。溫度對修飾速率影響的具體情況需要進一步研究。從更好保持蛋白的穩定性角度考慮，選擇4℃為融合蛋白修飾反應的溫度。
2.7 pH對融合蛋白修飾率的影響
pH對融合蛋白修飾率的影響如圖 7所示。
圖7
pH對融合蛋白修飾率的影響
Figure7.
Effects of pH on fusion protein modification rate
如圖 7所示，隨著pH值的升高，修飾率逐漸升高。PEG與蛋白的修飾反應主要是PEG的羥基與蛋白氨基酸殘基的氨基或羧基發生縮合反應。堿性環境對羥基的縮合反應有利，酸性環境卻有利于酯鍵的水解。因此，在堿性環境下，PEG對融合蛋白的修飾能力將會加強。從實驗結果看，在pH 9左右時，反應速率達到最高值，因此pH 9為PEG5000對LL-37與IFN-α2a融合蛋白修飾的最佳pH條件。
2.8 正交實驗結果
單因素實驗的結果表明，修飾率對溫度的變化不敏感。反應時間從充分反應的角度選擇4 h，在該時間點前后，修飾率對時間的反應亦不敏感。綜合上述結果，在正交實驗設計時，最終舍棄了溫度與時間兩個因素，選擇融合蛋白濃度(A)、蛋白與mPEG-SS物質的量之比(B)和pH (C)3個因素進行正交實驗設計。正交實驗的結果如表 2所示。方差分析如表 3所示。
表2
L9(33)正交實驗結果
Table2.
Results of L9(33) orthogonal array design tests
表3
正交實驗方差分析結果
Table3.
Variance analysis's results of orthogonal array design
綜合表 2與表 3的結果，融合蛋白濃度(A)屬于顯著性影響因素(P＜0.05), 三個因素影響的大小順序為A＞B＞C。最佳工藝條件為A2B2C1，即融合蛋白濃度0.6 mg/mL、蛋白與mPEG-SS物質量之比為1：10、pH 8.8。
在最佳工藝條件下，3次平行實驗所獲得的蛋白修飾率依次為86.92%、87.18%和86.83%，平均為86.98%。
2.9 修飾產物的體外活性檢測
經檢測，LL-37與IFN-α2a融合蛋白中原始干擾素的活性為7.86×106 IU/mg。經上述探索的最佳工藝修飾后，LL-37與IFN-α2a融合蛋白的干擾素活性為4.58×106 IU/mg，干擾素活性保持率為58.3%。另外，LL-37與IFN-α2a融合蛋白原始的抗菌活性為1.32 cm/mg，修飾后為1.28 cm/mg，抗菌活性保持率為97.0%，表明PEG對LL-37與IFN-α2a融合蛋白的修飾對其中LL-37部分沒有明顯的影響。
3 討論
PEG修飾是延長蛋白藥物體內半衰期和免疫原性的有效途徑。經過單因素實驗，探索了PEG對LL-37與IFN-α2a融合蛋白修飾的最佳工作條件為最佳PEG分子量為5000、融合蛋白濃度為0.6 mg/mL、蛋白與mPEG5000-SS的物質量之比為1：10、反應溫度為4℃、反應時間為4 h、pH為9.0。經正交實驗，對融合蛋白濃度(A)、蛋白與mPEG5000-SS的物質量之比(B)和pH(C)等3個因素進行進一步優化，結果表明3個因素對修飾率的影響大小依次為A＞B＞C，最佳工藝條件為A2B2C1，即融合蛋白濃度為0.6 mg/mL、蛋白與mPEG5000-SS的物質量之比為1：10、pH為8.8。在最佳修飾條件下，三次平行實驗的平均蛋白修飾率為86.98%。LL-37與IFN-α2a融合蛋白的干擾素活性保持率為58%以上，抗菌活性的保持率可達到97%以上。
PEG修飾提高蛋白藥物體內半衰期的機制主要有兩方面：一方面增加了蛋白的分子量，減少了腎小球對其過濾作用；另一方面，掩蓋了蛋白酶的作用位點，減少了蛋白酶的降解作用。PEG修飾降低免疫原性的原理主要是對抗原決定簇的掩蓋作用所致。PEG5000修飾LL-37與IFN-α2a融合蛋白后對其體內半衰期延長和免疫原性的影響情況，并未在本實驗中給予驗證，還需要進一步進行實驗檢驗。PEG修飾引起修飾對象活性下降，是PEG修飾最主要的缺陷[13]。部分氨基酸殘基的氨基參與了IFN-α2a的受體結合位點結構組裝，如果在修飾過程中，PEG位點發生在受體結合部位，就會導致干擾素活性的降低。要克服這一缺陷，需要開發定向修飾技術。
蛋白表面可供PEG修飾的基團有氨基、羧基、巰基、糖基等。以蛋白表面氨基為對象的修飾技術，由于其成熟且容易操作，是蛋白藥物修飾的首選。美國FDA自1990年以來批準的PEG修飾蛋白藥物均采用氨基修飾。由于蛋白表達氨基分布的廣泛性，導致在很大程度上修飾存在隨機性，產品質量難以穩定重復，為此以含量稀少的基團(如巰基和糖基)為目標的定向修飾成為近年來的研究熱點[14]。
