本研究通過分析小RNA(microRNAs)在大鼠大腦中間神經元前體細胞株GE6體外分化中的表達, 篩選出在中間神經元前體細胞系分化成熟過程中特異性表達的小RNA, 并預測分析其可能在此過程中的功能。實驗中, 將GE6在三種不同條件下培養, 即:不加入任何其他生長因子, 正常分化培養4天的GE6(Ge6_4d); 加入骨形態發生蛋白-2(BMP2)后分化培養4天的GE6(Ge6_bmp2);以及加入音猥因子(SHH)后分化培養4天的GE6(Ge6_shh)。設陰性對照組為未分化的GE6(Ge6_u)。四組GE6細胞進行細胞免疫熒光染色、qRT-PCR以及小RNA芯片檢測分析。通過四組細胞的兩兩比較、篩選及分析發現, 多種小RNA在GE6細胞的分化過程中含量有明顯變化。miR-710、miR-290-5p和miR-3473等在加入分泌因子BMP2的GE6細胞中含量顯著上調。這些小RNA可能對大鼠中間神經元分化起到重要的調控作用。
引用本文： 葛昕旭, 劉倩, 尹舒, 李赫冬. 中間神經元前體細胞株GE6在不同分化條件下小RNA的表達. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(6): 1273-1278. doi: 10.7507/1001-5515.20150226 復制
0 引言
大腦皮層中的中間神經元通過分泌γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)這種大腦中主要的抑制性神經遞質來調節突觸活性，所以又稱為GABA能中間神經元。它能與以谷氨酸為神經遞質的投射神經元形成突觸并調節投射神經元在前腦中的功能[1-2]。在嚙齒類動物中，大腦皮層中的中間神經元主要起源于發育中前腦下皮質的神經節隆起(ganglionic eminences，GEs)，然后沿切線方向遷移至大腦皮層[2-5]。大腦皮層中的中間神經元對于外傷所造成的中樞神經系統損傷特別敏感。中間神經元的缺失會造成神經系統中GABA能的下降從而導致神經系統的過度興奮[4]。所以對中間神經元分化及發育機制的研究對于脊髓損傷的臨床治療具有重要作用。而在顳葉癲癇病模型中移植可分泌GABA的細胞可以減少癲癇癥的發作[7]。這表明GABA能細胞的移植可能成為治療此類病癥最有效的方法。然而，目前對于調控中間神經元分化、發育及遷移的機制并不十分清楚。
GE6細胞株來源于大鼠大腦GE區，是一個已驗證的帶有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的中間神經元前體細胞株[8]。在含有堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，FGF2)的培養基中，GE6細胞可以進行傳代培養；而在不含有生長因子FGF2的培養基中可以分化生成幾乎所有亞型的中間神經元。從GE6細胞株分化而來的中間神經元細胞不僅可以產生電興奮，也可以與抑制性和興奮性神經元形成突觸連結[8]。通過體外分化培養GE6細胞株，可以模擬中間神經元前體細胞在體內的分化，從而研究其分化的機制。
小RNA(microRNA)是真核細胞中一類小片段的非編碼RNA，參與基因表達的轉錄后調控。它們與目的基因3＇端非編碼區域的特定序列相結合，可導致目的mRNA的降解或者干擾其編碼的蛋白質的翻譯過程[7]。前人的研究證明小RNA在許多生命過程中起重要的調控作用，包括神經元的存活和分化[4, 7]。也有研究發現小RNA對于癲癇癥的一系列進程具有一定的調控作用[9]。
基因芯片又叫做DNA芯片、DNA微陣列。基因芯片技術的一般原理是采用原位合成或者顯微印刷技術，將數以萬計的DNA探針分子固定于支持物的表面，產生二維DNA探針陣列。基因芯片與標記的樣品進行雜交后，可通過檢測雜交的信號來實現對生物樣品快速、高效地檢測或診斷。基因芯片主要的應用為基因測序、基因表達水平的檢測、基因診斷、新藥篩選及臨床用藥等。在本實驗中，通過基因芯片技術中的小RNA芯片技術，將特定的小RNA序列作為探針分子，通過雜交后熒光量的檢測，測定不同細胞樣品中小RNA的表達水平，從而篩選出有顯著變化的小RNA。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
GE6細胞株由四川大學李赫冬實驗室提供[8]。加葡萄糖、雙抗的DMEM/F12培養基(Invitrogen公司，美國)；肝素(Heprin，Sigma公司，美國)；B27(Invitrogen公司，美國)；FGF2(Preprotech公司，英國)。反轉錄試劑盒(PrimeScript? RT，TaKaRa公司，日本)；熒光qRT-PCR試劑盒(iQTM SYBR? Green Supermix，BIO-RAD公司，美國)。神經元標志物Tuj1(mouse)抗體(AVES LABS公司，美國)；4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司，美國)。
1.2 實驗方法
1.2.1 GE6細胞株的體外培養
永生的中間神經元前體細胞株GE6按照文獻[8]描述，用加有生長因子FGF2的無血清培養基進行傳代培養。GE6細胞以2×106個/孔的濃度鋪在事先用多聚賴氨酸和層粘連蛋白處理過的六孔培養皿中，在37℃、10% CO2濃度的培養箱中培養。1 d后，細胞貼壁，更換培養基為不含FGF2的培養基，并分為3組：①不加入任何其他生長因子，正常分化培養4 d的GE6細胞(Ge6_4d)；②加入BMP2骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP2)(濃度為25 ng/mL)后分化培養4 d的GE6細胞(Ge6_bmp2)；③加入音猥因子(sonic hedgehog，SHH)(濃度為0.1μmol/L)后分化培養4 d的GE6細胞(Ge6_shh)。其中BMP2因子抑制神經元細胞增殖，促進細胞分化；而SHH因子可以促進神經元細胞的增殖[10-13]。然后以未分化的GE6細胞(Ge6_u)作為對照組。
1.2.2 細胞免疫熒光染色
將分化好的GE6細胞鋪入放有多聚賴氨酸和層粘連蛋白處理過的蓋玻片的24孔培養皿中，用新鮮配制的4%多聚甲醛溶液(PFA)固定10~15 min。將固定的細胞爬片放到6孔板上，以磷酸緩沖液(PBS)洗3次，然后使用神經元特異性抗體Tuj1(稀釋比例：1：500)孵育染色。每孔加入50μL一抗, 室溫孵育2~3 h后用PBST(0.3% Triton+1×PBS)洗3次。用濃度為1：500的山羊抗鼠二抗(CY3)及濃度為1：1 000的DAPI(10μg/mL，Sigma)避光孵育1 h，PBST洗3次。染色后的細胞爬片用Mounting medium封固劑(中杉金橋生物科技公司)封片，避光條件下晾干后，在熒光倒置顯微鏡(Nikon Eclipse Ti)下照相。將各個通道得到的圖片進行合并，然后計數。每次試驗選取至少3個視野計數，結果取平均數，并計算Tuj1陽性率(Tuj1陽性率＝Tuj1陽性細胞總數／綠色熒光細胞總數)。
1.2.3 小RNA芯片
將按照1.2.1中所示方法培養所得的四組細胞作為樣本進行小RNA芯片檢測。用Trizol收集細胞樣品，每組細胞分為等體積的兩份，一份用于小RNA芯片的檢測，另一份用于熒光定量PCR。小RNA芯片結果由康成生物公司測定，通過芯片中位值對小RNA芯片原始信號值進行標準化。通過標準化后的信號值計算出每個小RNA在每兩組不同樣本間的表達變化，并通過單因素ANOVA分析計算樣本間小RNA表達量變化的差異。表達變化倍數在2倍以上且P值小于0.05的小RNA被挑選出來，定義為差異表達的小RNA。篩選出的小RNA通過Target Scan Mouse 6.0(http://www.targetscan.org/mmu_60/)分析其可能的目的基因，并使用DAVID Functional Annotation Tool軟件(http://david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsp)對目的基因進行功能性分析和聚類。
1.2.4 細胞總RNA的提取及熒光定量PCR
用Trizol收集的細胞樣品提取總RNA，并進行含量測定。然后，用PrimeScript逆轉錄試劑盒(TaKaRa)將細胞樣品中提取出的總RNA逆轉錄成cDNA。每個反應體系為10μL，其中RNA的最大量為500 ng，得到的cDNA用來進行定量測定。
常規基因及小RNA熒光定量PCR均采用10μL體系：預混液5μL，cDNA 50倍稀釋后取4.4μL，上游引物0.3μL，下游引物0.3μL。常規基因的熒光定量PCR反應條件為：變性95℃，10 s；退火58℃，30 s；延伸72℃，30 s；35個循環。小RNA的熒光定量PCR反應條件為：變性95℃，10 s；退火65℃，30 s；延伸72℃，30 s；30個循環。重復實驗3次，結果采用2△△Ct方法計算相對表達量。常規基因表達量分析是通過與內參GAPDH比較來標準化的；小RNA表達量的分析是通過與小核RNA(U6)比較來標準化的。相關的常規基因引物序列如下：GAPDH上游引物：5＇-GCAAGTTCAACGGCACAG-3＇；下游引物：5＇-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3＇；Tubb3(Tuj1蛋白基因)上游引物：5＇-GGCCTTTGGACACCTATTCAG-3＇；下游引物：5＇-TCTCACATTCTTTCCTCACGAC-3＇。相關的小RNA特異引物直接購自廣州瑞博公司。
1.2.5 數據統計
每組實驗重復次數不少于3次。所有數據的表達形式為均數±標準差(
2 實驗結果與分析
2.1 加入BMP2因子組GE6細胞分化后Tuj1表達量增加
為了觀察不同條件下GE6細胞的分化情況，我們首先對Ge6_u、Ge6_4d、Ge6_shh以及Ge6_bmp2 4組細胞進行細胞免疫熒光染色，如圖 1所示。Ge6_u、Ge6_4d、Ge6_shh、Ge6_bmp2 4組細胞Tuj1陽性率分別為0.002±0.002、0.015±0.003、0.022±0.007以及0.076±0.016。分化后的3組細胞Tuj1陽性率均高于Ge6_u組細胞，差異均有統計學意義(P＜0.05)；同時，Ge6_bmp2組細胞Tuj1陽性率也分別高于Ge6_shh組和Ge6_4d組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；而Ge6_shh組和Ge6_4d組細胞比較，Tuj1陽性率無明顯差異。
圖1
GE6細胞中Tuj1免疫熒光染色結果(40×)
Figure1.
Immunofluorescent staining of Tuj1 in GE6 cells (40×)
提取4組細胞中的總RNA，逆轉錄生成cDNA后進行熒光定量PCR。將Ge6_u組細胞中Tuj1蛋白相應的Tubb3基因mRNA的表達量定為單位“1”，則其余各組細胞中Tubb3基因mRNA的相對表達量為：Ge6_bmp2組：70.630±0.013；Ge6_shh組：44.736±4.330；Ge6_4d組：49.864±11.248。與細胞免疫熒光染色結果相一致，分化后的3組細胞Tubb3基因mRNA的相對表達量均分別高于Ge6_u組細胞，差異均具有統計學意義(P＜0.05)；同時Ge6_bmp2組細胞Tubb3基因mRNA的相對表達量也分別高于Ge6_shh組和Ge6_4d組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；而Ge6_shh組和Ge6_4d組細胞Tubb3基因mRNA的相對表達量則無明顯差異。
綜合以上實驗結果，加入BMP2因子組的GE6細胞分化后Tuj1表達量增加。
2.2 小RNA芯片結果及其熒光定量PCR驗證
通過小RNA芯片數據的分析，篩選發現共有89個差異表達的小RNA，即在任意兩組間差異表達的小RNA。其中，與Ge6_u組細胞相比，54個小RNA的含量在3組分化后的細胞中均上調，27個小RNA的含量在3組分化后的細胞中均下調；將Ge6_bmp2細胞分別與另外3組細胞比較，發現13個小RNA在Ge6_bmp2細胞中含量均高于其余3組細胞。
為了驗證小RNA芯片的結果，通過綜合考量小RNA在各組細胞中的表達水平以及差異大小，從芯片結果中篩選出13個小RNA，即：分別與另外3組細胞相比，Ge6_bmp2組細胞中均上調的7個小RNA，以及分別與Ge6_u組細胞相比，在分化后的3組細胞中均下調的6個小RNA；同時列出小RNA芯片檢測結果中它們在不同分化條件下的含量，如表 1所示。
表1
GE6體外分化中特異性表達的小RNA及其含量(數據來自小RNA芯片)
Table1.
Content of specific microRNAs during GE6 differentiation (data from microRNA chip)
通過熒光定量PCR檢測與小RNA芯片相同細胞樣品中13個目的小RNA的含量，結果表明miRNA-710、miRNA-290-5p、miRNA-3473的表達水平以及在各組細胞中的變化趨勢與芯片結果相符。將小RNA在Ge6_u組細胞中的含量定為單位“1”，則其余各組細胞中miRNA-710的相對含量分別為：Ge6_bmp2組：3.733±0.087；Ge6_shh組：2.985±0.272；Ge6_4d組：2.850±0.359。miRNA-290-5p在其余各組細胞中的相對含量為：Ge6_bmp2組：2.932±0.125；Ge6_shh組：2.398±0.325；Ge6_4d組：2.508±0.186。miRNA-3473在其余各組細胞中的相對含量為：Ge6_bmp2組：26.568±1.050；Ge6_shh組：20.158±0.063；Ge6_4d組：10.506±1.103。與Ge6_u組細胞相比，這3個小RNA的相對含量在分化后的3組細胞中均明顯升高，差異均有統計學意義(P＜0.05)；同時，在Ge6_bmp2組細胞中這3個小RNA的相對含量也分別高于Ge6_shh組和Ge6_4d組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。
2.3 小RNA靶基因及其功能預測
為了研究篩選出的小RNA與中間神經元分化和發育的相互關系，通過Target Scan Mouse 6.0(http://www.targetscan.org/mmu_60/)尋找這3個小RNA的靶基因。通過DAVID Functional Annotation Tool軟件(http://david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsp)，對其靶基因可能調控的功能進行聚類分析，如
表2
特異性小RNA靶基因預測及功能聚類分析結果
Table2.
Clustering target genes of specific microRNAs
3 討論
正常培養條件下，GE6細胞能同時分化生成中間神經元細胞和少突膠質細胞[8]。本實驗利用因子BMP2和SHH對中間神經元細胞分化的不同作用，篩選出在GE6細胞分化成中間神經元過程中可能具有重要作用的小RNA。特別是在GE6細胞中高表達的miR-290-5p，不僅在加入BMP2后含量明顯上調，并且通過軟件預測可能靶向大腦皮層發育以及神經元遷移等功能。這提示miR-290-5p可能參與調控中間神經元發育相關基因的表達，對中間神經元的分化成熟起重要作用，對深入了解探索中間神經元發育的相關機制具有重要意義。
在哺乳動物體內，miR-290-5p是miR-290a的兩種成熟形態之一(另一成熟形態為miR-290-3p)。miR-290a位于第7號染色體，同家族還有miR-290b、miR-291a(b)、miR-292a(b)、miR-293、miR-294和miR-295共8個不同的小RNA。已有研究表明，miR-290-5p及其同家族小RNA在多種組織及細胞中具有重要作用。在小鼠B細胞中過表達miR-290-5p和miR-292-5p可促進免疫球蛋白κ的轉錄激活；相反，在小鼠B細胞中特異性敲除miR-290-5p和miR-292-5p可抑制免疫球蛋白κ的轉錄激活[14]。此外，miR-290-5p不僅在甲狀腺細胞生長[15]及肝臟細胞再生[16]過程中具有至關重要的調節作用，在腫瘤細胞的轉移以及腎臟鈉離子的轉運中也是不可或缺的[17-18]。
盡管如此，miR-290-5p在神經系統的具體功能卻仍未有文獻報道。因此，接下來我們計劃通過在GE6細胞的體外分化中抑制或者過表達miR-290-5p等進一步的實驗，檢測miR-290-5p在GE6細胞體外分化中的作用，特別是對GE6細胞分化生成中間神經元過程的直接作用。同時，我們將通過實驗篩選檢測出更多與神經元分化成熟過程直接相關的小RNA，并對其調控的機制進行探究和了解。
許多與神經系統功能性相關的疾病如精神分裂癥(schizophrenia)、躁狂癥(mania)、雙相障礙(bipolar disorder)等，都與中間神經元缺失密切相關[4]。如果能篩選出可以直接調控中間神經元分化發育的小RNA，特別是可以直接調控中間神經元某種特定亞型細胞分化發育的小RNA，不僅可以為解決細胞移植治療中的細胞來源問題提供一個可能的思路，而且可以為相關神經疾病的藥物治療提供一個可能的方向。
0 引言
大腦皮層中的中間神經元通過分泌γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)這種大腦中主要的抑制性神經遞質來調節突觸活性，所以又稱為GABA能中間神經元。它能與以谷氨酸為神經遞質的投射神經元形成突觸并調節投射神經元在前腦中的功能[1-2]。在嚙齒類動物中，大腦皮層中的中間神經元主要起源于發育中前腦下皮質的神經節隆起(ganglionic eminences，GEs)，然后沿切線方向遷移至大腦皮層[2-5]。大腦皮層中的中間神經元對于外傷所造成的中樞神經系統損傷特別敏感。中間神經元的缺失會造成神經系統中GABA能的下降從而導致神經系統的過度興奮[4]。所以對中間神經元分化及發育機制的研究對于脊髓損傷的臨床治療具有重要作用。而在顳葉癲癇病模型中移植可分泌GABA的細胞可以減少癲癇癥的發作[7]。這表明GABA能細胞的移植可能成為治療此類病癥最有效的方法。然而，目前對于調控中間神經元分化、發育及遷移的機制并不十分清楚。
GE6細胞株來源于大鼠大腦GE區，是一個已驗證的帶有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的中間神經元前體細胞株[8]。在含有堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，FGF2)的培養基中，GE6細胞可以進行傳代培養；而在不含有生長因子FGF2的培養基中可以分化生成幾乎所有亞型的中間神經元。從GE6細胞株分化而來的中間神經元細胞不僅可以產生電興奮，也可以與抑制性和興奮性神經元形成突觸連結[8]。通過體外分化培養GE6細胞株，可以模擬中間神經元前體細胞在體內的分化，從而研究其分化的機制。
小RNA(microRNA)是真核細胞中一類小片段的非編碼RNA，參與基因表達的轉錄后調控。它們與目的基因3＇端非編碼區域的特定序列相結合，可導致目的mRNA的降解或者干擾其編碼的蛋白質的翻譯過程[7]。前人的研究證明小RNA在許多生命過程中起重要的調控作用，包括神經元的存活和分化[4, 7]。也有研究發現小RNA對于癲癇癥的一系列進程具有一定的調控作用[9]。
基因芯片又叫做DNA芯片、DNA微陣列。基因芯片技術的一般原理是采用原位合成或者顯微印刷技術，將數以萬計的DNA探針分子固定于支持物的表面，產生二維DNA探針陣列。基因芯片與標記的樣品進行雜交后，可通過檢測雜交的信號來實現對生物樣品快速、高效地檢測或診斷。基因芯片主要的應用為基因測序、基因表達水平的檢測、基因診斷、新藥篩選及臨床用藥等。在本實驗中，通過基因芯片技術中的小RNA芯片技術，將特定的小RNA序列作為探針分子，通過雜交后熒光量的檢測，測定不同細胞樣品中小RNA的表達水平，從而篩選出有顯著變化的小RNA。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
GE6細胞株由四川大學李赫冬實驗室提供[8]。加葡萄糖、雙抗的DMEM/F12培養基(Invitrogen公司，美國)；肝素(Heprin，Sigma公司，美國)；B27(Invitrogen公司，美國)；FGF2(Preprotech公司，英國)。反轉錄試劑盒(PrimeScript? RT，TaKaRa公司，日本)；熒光qRT-PCR試劑盒(iQTM SYBR? Green Supermix，BIO-RAD公司，美國)。神經元標志物Tuj1(mouse)抗體(AVES LABS公司，美國)；4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司，美國)。
1.2 實驗方法
1.2.1 GE6細胞株的體外培養
永生的中間神經元前體細胞株GE6按照文獻[8]描述，用加有生長因子FGF2的無血清培養基進行傳代培養。GE6細胞以2×106個/孔的濃度鋪在事先用多聚賴氨酸和層粘連蛋白處理過的六孔培養皿中，在37℃、10% CO2濃度的培養箱中培養。1 d后，細胞貼壁，更換培養基為不含FGF2的培養基，并分為3組：①不加入任何其他生長因子，正常分化培養4 d的GE6細胞(Ge6_4d)；②加入BMP2骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP2)(濃度為25 ng/mL)后分化培養4 d的GE6細胞(Ge6_bmp2)；③加入音猥因子(sonic hedgehog，SHH)(濃度為0.1μmol/L)后分化培養4 d的GE6細胞(Ge6_shh)。其中BMP2因子抑制神經元細胞增殖，促進細胞分化；而SHH因子可以促進神經元細胞的增殖[10-13]。然后以未分化的GE6細胞(Ge6_u)作為對照組。
1.2.2 細胞免疫熒光染色
將分化好的GE6細胞鋪入放有多聚賴氨酸和層粘連蛋白處理過的蓋玻片的24孔培養皿中，用新鮮配制的4%多聚甲醛溶液(PFA)固定10~15 min。將固定的細胞爬片放到6孔板上，以磷酸緩沖液(PBS)洗3次，然后使用神經元特異性抗體Tuj1(稀釋比例：1：500)孵育染色。每孔加入50μL一抗, 室溫孵育2~3 h后用PBST(0.3% Triton+1×PBS)洗3次。用濃度為1：500的山羊抗鼠二抗(CY3)及濃度為1：1 000的DAPI(10μg/mL，Sigma)避光孵育1 h，PBST洗3次。染色后的細胞爬片用Mounting medium封固劑(中杉金橋生物科技公司)封片，避光條件下晾干后，在熒光倒置顯微鏡(Nikon Eclipse Ti)下照相。將各個通道得到的圖片進行合并，然后計數。每次試驗選取至少3個視野計數，結果取平均數，并計算Tuj1陽性率(Tuj1陽性率＝Tuj1陽性細胞總數／綠色熒光細胞總數)。
1.2.3 小RNA芯片
將按照1.2.1中所示方法培養所得的四組細胞作為樣本進行小RNA芯片檢測。用Trizol收集細胞樣品，每組細胞分為等體積的兩份，一份用于小RNA芯片的檢測，另一份用于熒光定量PCR。小RNA芯片結果由康成生物公司測定，通過芯片中位值對小RNA芯片原始信號值進行標準化。通過標準化后的信號值計算出每個小RNA在每兩組不同樣本間的表達變化，并通過單因素ANOVA分析計算樣本間小RNA表達量變化的差異。表達變化倍數在2倍以上且P值小于0.05的小RNA被挑選出來，定義為差異表達的小RNA。篩選出的小RNA通過Target Scan Mouse 6.0(http://www.targetscan.org/mmu_60/)分析其可能的目的基因，并使用DAVID Functional Annotation Tool軟件(http://david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsp)對目的基因進行功能性分析和聚類。
1.2.4 細胞總RNA的提取及熒光定量PCR
用Trizol收集的細胞樣品提取總RNA，并進行含量測定。然后，用PrimeScript逆轉錄試劑盒(TaKaRa)將細胞樣品中提取出的總RNA逆轉錄成cDNA。每個反應體系為10μL，其中RNA的最大量為500 ng，得到的cDNA用來進行定量測定。
常規基因及小RNA熒光定量PCR均采用10μL體系：預混液5μL，cDNA 50倍稀釋后取4.4μL，上游引物0.3μL，下游引物0.3μL。常規基因的熒光定量PCR反應條件為：變性95℃，10 s；退火58℃，30 s；延伸72℃，30 s；35個循環。小RNA的熒光定量PCR反應條件為：變性95℃，10 s；退火65℃，30 s；延伸72℃，30 s；30個循環。重復實驗3次，結果采用2△△Ct方法計算相對表達量。常規基因表達量分析是通過與內參GAPDH比較來標準化的；小RNA表達量的分析是通過與小核RNA(U6)比較來標準化的。相關的常規基因引物序列如下：GAPDH上游引物：5＇-GCAAGTTCAACGGCACAG-3＇；下游引物：5＇-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3＇；Tubb3(Tuj1蛋白基因)上游引物：5＇-GGCCTTTGGACACCTATTCAG-3＇；下游引物：5＇-TCTCACATTCTTTCCTCACGAC-3＇。相關的小RNA特異引物直接購自廣州瑞博公司。
1.2.5 數據統計
每組實驗重復次數不少于3次。所有數據的表達形式為均數±標準差(
2 實驗結果與分析
2.1 加入BMP2因子組GE6細胞分化后Tuj1表達量增加
為了觀察不同條件下GE6細胞的分化情況，我們首先對Ge6_u、Ge6_4d、Ge6_shh以及Ge6_bmp2 4組細胞進行細胞免疫熒光染色，如圖 1所示。Ge6_u、Ge6_4d、Ge6_shh、Ge6_bmp2 4組細胞Tuj1陽性率分別為0.002±0.002、0.015±0.003、0.022±0.007以及0.076±0.016。分化后的3組細胞Tuj1陽性率均高于Ge6_u組細胞，差異均有統計學意義(P＜0.05)；同時，Ge6_bmp2組細胞Tuj1陽性率也分別高于Ge6_shh組和Ge6_4d組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；而Ge6_shh組和Ge6_4d組細胞比較，Tuj1陽性率無明顯差異。
圖1
GE6細胞中Tuj1免疫熒光染色結果(40×)
Figure1.
Immunofluorescent staining of Tuj1 in GE6 cells (40×)
提取4組細胞中的總RNA，逆轉錄生成cDNA后進行熒光定量PCR。將Ge6_u組細胞中Tuj1蛋白相應的Tubb3基因mRNA的表達量定為單位“1”，則其余各組細胞中Tubb3基因mRNA的相對表達量為：Ge6_bmp2組：70.630±0.013；Ge6_shh組：44.736±4.330；Ge6_4d組：49.864±11.248。與細胞免疫熒光染色結果相一致，分化后的3組細胞Tubb3基因mRNA的相對表達量均分別高于Ge6_u組細胞，差異均具有統計學意義(P＜0.05)；同時Ge6_bmp2組細胞Tubb3基因mRNA的相對表達量也分別高于Ge6_shh組和Ge6_4d組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；而Ge6_shh組和Ge6_4d組細胞Tubb3基因mRNA的相對表達量則無明顯差異。
綜合以上實驗結果，加入BMP2因子組的GE6細胞分化后Tuj1表達量增加。
2.2 小RNA芯片結果及其熒光定量PCR驗證
通過小RNA芯片數據的分析，篩選發現共有89個差異表達的小RNA，即在任意兩組間差異表達的小RNA。其中，與Ge6_u組細胞相比，54個小RNA的含量在3組分化后的細胞中均上調，27個小RNA的含量在3組分化后的細胞中均下調；將Ge6_bmp2細胞分別與另外3組細胞比較，發現13個小RNA在Ge6_bmp2細胞中含量均高于其余3組細胞。
為了驗證小RNA芯片的結果，通過綜合考量小RNA在各組細胞中的表達水平以及差異大小，從芯片結果中篩選出13個小RNA，即：分別與另外3組細胞相比，Ge6_bmp2組細胞中均上調的7個小RNA，以及分別與Ge6_u組細胞相比，在分化后的3組細胞中均下調的6個小RNA；同時列出小RNA芯片檢測結果中它們在不同分化條件下的含量，如表 1所示。
表1
GE6體外分化中特異性表達的小RNA及其含量(數據來自小RNA芯片)
Table1.
Content of specific microRNAs during GE6 differentiation (data from microRNA chip)
通過熒光定量PCR檢測與小RNA芯片相同細胞樣品中13個目的小RNA的含量，結果表明miRNA-710、miRNA-290-5p、miRNA-3473的表達水平以及在各組細胞中的變化趨勢與芯片結果相符。將小RNA在Ge6_u組細胞中的含量定為單位“1”，則其余各組細胞中miRNA-710的相對含量分別為：Ge6_bmp2組：3.733±0.087；Ge6_shh組：2.985±0.272；Ge6_4d組：2.850±0.359。miRNA-290-5p在其余各組細胞中的相對含量為：Ge6_bmp2組：2.932±0.125；Ge6_shh組：2.398±0.325；Ge6_4d組：2.508±0.186。miRNA-3473在其余各組細胞中的相對含量為：Ge6_bmp2組：26.568±1.050；Ge6_shh組：20.158±0.063；Ge6_4d組：10.506±1.103。與Ge6_u組細胞相比，這3個小RNA的相對含量在分化后的3組細胞中均明顯升高，差異均有統計學意義(P＜0.05)；同時，在Ge6_bmp2組細胞中這3個小RNA的相對含量也分別高于Ge6_shh組和Ge6_4d組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。
2.3 小RNA靶基因及其功能預測
為了研究篩選出的小RNA與中間神經元分化和發育的相互關系，通過Target Scan Mouse 6.0(http://www.targetscan.org/mmu_60/)尋找這3個小RNA的靶基因。通過DAVID Functional Annotation Tool軟件(http://david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsp)，對其靶基因可能調控的功能進行聚類分析，如
表2
特異性小RNA靶基因預測及功能聚類分析結果
Table2.
Clustering target genes of specific microRNAs
3 討論
正常培養條件下，GE6細胞能同時分化生成中間神經元細胞和少突膠質細胞[8]。本實驗利用因子BMP2和SHH對中間神經元細胞分化的不同作用，篩選出在GE6細胞分化成中間神經元過程中可能具有重要作用的小RNA。特別是在GE6細胞中高表達的miR-290-5p，不僅在加入BMP2后含量明顯上調，并且通過軟件預測可能靶向大腦皮層發育以及神經元遷移等功能。這提示miR-290-5p可能參與調控中間神經元發育相關基因的表達，對中間神經元的分化成熟起重要作用，對深入了解探索中間神經元發育的相關機制具有重要意義。
在哺乳動物體內，miR-290-5p是miR-290a的兩種成熟形態之一(另一成熟形態為miR-290-3p)。miR-290a位于第7號染色體，同家族還有miR-290b、miR-291a(b)、miR-292a(b)、miR-293、miR-294和miR-295共8個不同的小RNA。已有研究表明，miR-290-5p及其同家族小RNA在多種組織及細胞中具有重要作用。在小鼠B細胞中過表達miR-290-5p和miR-292-5p可促進免疫球蛋白κ的轉錄激活；相反，在小鼠B細胞中特異性敲除miR-290-5p和miR-292-5p可抑制免疫球蛋白κ的轉錄激活[14]。此外，miR-290-5p不僅在甲狀腺細胞生長[15]及肝臟細胞再生[16]過程中具有至關重要的調節作用，在腫瘤細胞的轉移以及腎臟鈉離子的轉運中也是不可或缺的[17-18]。
盡管如此，miR-290-5p在神經系統的具體功能卻仍未有文獻報道。因此，接下來我們計劃通過在GE6細胞的體外分化中抑制或者過表達miR-290-5p等進一步的實驗，檢測miR-290-5p在GE6細胞體外分化中的作用，特別是對GE6細胞分化生成中間神經元過程的直接作用。同時，我們將通過實驗篩選檢測出更多與神經元分化成熟過程直接相關的小RNA，并對其調控的機制進行探究和了解。
許多與神經系統功能性相關的疾病如精神分裂癥(schizophrenia)、躁狂癥(mania)、雙相障礙(bipolar disorder)等，都與中間神經元缺失密切相關[4]。如果能篩選出可以直接調控中間神經元分化發育的小RNA，特別是可以直接調控中間神經元某種特定亞型細胞分化發育的小RNA，不僅可以為解決細胞移植治療中的細胞來源問題提供一個可能的思路，而且可以為相關神經疾病的藥物治療提供一個可能的方向。
