本研究目的是探討超順磁性殼聚糖FGF-2明膠微球(SPCFGM)對小鼠間充質干細胞增殖分化作用的影響。采用化學共沉淀法制備超順磁性氧化鐵殼聚糖納米粒子(SPIOCNs),與質粒FGF-2結合后,用乳化交聯法制備SPCFGM和不含質粒FGF-2的超順磁性殼聚糖明膠微球(SPCGM),激光粒度分析儀和透射電鏡檢測SPCFGM、SPIOCNs表征,測定SPCFGM的載藥量、包封率及體外釋放活性,分別用等量SPCFGM、SPCGM、加入C3H10細胞培養基中,設SPCFGM組、SPCGM組、空白對照組3組細胞。DAPI染色觀察細胞凋亡,Western blot法驗證各組FGF-2的表達水平,CCK8法和流式細胞術檢測細胞的增殖活力及細胞周期分布。結果顯示:SPIOCNs微粒和SPCFGM微球都呈球形,粒徑分別為(25±9) nm和(140±12) μm。SPCFGM的載藥量為57.13%±5.41%,包封率為69.97%±0.04%。3組細胞無凋亡形態,SPCFGM組FGF-2蛋白水平表達較其它兩組明顯增高,細胞增殖活力明顯增高(P＜0.05)。SPCFGM可釋放FGF-2,并保持FGF-2的生物活性,促進C3H10細胞增殖分化,對細胞無毒副作用。
引用本文： 丁幸坡, 李明, 曹豫江, 楊瓊, 何通川, 羅聰, 李海冰, 畢楊. 質粒FGF-2磁性殼聚糖明膠微球對間充質干細胞增殖分化的影響. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(5): 1083-1089. doi: 10.7507/1001-5515.20150192 復制
引言
目前，如何促進關節軟骨損傷修復與再生是生物學家及生物工程師面臨的嚴峻挑戰[1]。從生物學角度來看，關節軟骨損傷后易引起關節疼痛、畸形及功能喪失，其修復是一個復雜的過程，因其無神經及血管支配，細胞體積比較低并且富含粘多糖的特性就限制了新生細胞主動或被動的向病變部位遷移,導致修復困難[2-3]。
軟骨組織工程用于關節軟骨損傷修復是近年來研究的熱點。間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有向軟骨細胞分化的潛能，是軟骨組織工程理想的種子細胞。但是MSCs的分化潛能隨年齡的增長而明顯下降，誘導分化機制尚不明確，其遺傳及體內增殖的安全性有待確定[4]。成纖維細胞生長因子2 (fibroblast growth factor2,FGF-2)是成纖維細胞因子家族一員，是參與軟骨損傷早期修復的關鍵因子，促進軟骨下間充質細胞的聚集和向軟骨細胞分化，在軟骨再生過程中起重要作用[5]。利用FGF-2對 MSCs的干預作用，即可以促進MSCs增殖，又可以定向誘導MSCs向軟骨細胞分化，但是外源性FGF-2性質不穩定，半衰期短，進入體內后易被蛋白酶降解[6]。因此，為了使FGF-2能在體內充分發揮其生物學效應，本研究擬通過制備超順磁性殼聚糖FGF-2明膠微球(superparamagnetic chitosan FGF-2 gelatin microspheres,SPCFGM)，實現FGF-2明膠微球既作為一種基因載體又作為釋放系統的可能性，調節FGF-2體內釋放的量效關系，為軟骨組織工程技術探索一條新的途徑。
1 材料與方法
1.1 材料
質粒pIRES2-EGFP-FGF-2由本課題組前期完成，胎牛血清和培養基DMEM購自美國Hyclone公司，質粒提取試劑盒購自美國Omega公司，FGF2一抗及羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物有限公司，CCK-8試劑購自南京凱基生物科技發展有限公司，硫酸亞鐵銨、硫酸鐵銨購自重慶北碚化學試劑廠，明膠，殼聚糖，4′,6-二脒基-2-苯基吲(4′，6-diamidino-2-pheny lindole，DAPI)購自Sigma公司，鹽酸及亞鐵氰化鉀購自成都市科龍化工試劑廠，所用化學試劑均為分析純。
1.2 超順磁性氧化鐵殼聚糖納米粒子的制備及檢測
化學共沉淀法[7]制備超順磁性氧化鐵殼聚糖納米粒子(superparamagnetic iron oxide chitosan nanoparticles,SPIOCNs)，將得到的黑色沉淀用蒸餾水反復洗滌，直至中性，室溫保存。取適量樣本在透射電鏡下觀察形態，并用激光衍射粒度分析儀測定粒徑及分布。用凱氏定氮法測定SPIOCNs氮含量[8]。
1.3 質粒pIRES2-EGFP-FGF-2與SPIOCNs的結合實驗
取1 μL質粒pIRES2-EGFP-FGF-2在1.8 V條件下利用電轉法轉染入E.coli DH5α感受態細菌中，37 ℃孵育30 min，加入含有卡那霉素(1∶1 000)的LB培養基中，培養過夜，按照質粒提取試劑盒的說明書提取質粒，經BglⅡ、Sal I 雙酶切鑒定，并檢測濃度。將SPIOCNs溶入醋酸鈉緩沖液中(pH=5.5),按不同氮/磷比例(0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1)與質粒混合，旋渦攪拌20 s,55 ℃下復合1 h。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察質粒與SPIOCNs結合情況。
1.4 SPCFGM的制備
乳化交聯法制備SPCFGM。取醋酸緩沖液(pH=5.5)配置的SPIOCNs 5 mL和FGF-2質粒5 mL混合，55 ℃孵育1 h，向混合液中加入10 mL 25%明膠，800 r/min攪拌溶解20 min制成明膠磁流體。另在三口燒瓶中加入100 mL液體石蠟和1 mL司班80，于65 ℃、800 r/min充分攪拌。將明膠磁流體緩慢滴入三口燒瓶中，300 r/min攪拌10 min，待出現乳狀液后迅速改為冰浴，降溫至4 ℃，緩慢滴加25％的戊二醛0.1 mL，繼續攪拌2 h，加入40 mL丙酮，攪拌3 min后靜置，待溶液分層后，可以看到制備出的淡黃色微球沉淀在最下層，過濾后將微球泡在10 mL丙酮溶液中，予4 ℃固化24 h。蒸餾水洗滌3次后將微球凍干，－20 ℃保存。取適量樣本用蒸餾水溶解，使微球均勻分散，取微球混液滴于載玻片上，在光學顯微鏡下觀察形態，并用激光衍射粒度分析儀測定其粒徑及分布。
1.5 SPCFGM的載藥量及包封率的測定
制備3批SPCFGM，收集最后的洗滌液，8 000 r/min離心5 min，取上清，用紫外分光光度儀在波長260 mm下檢測質粒濃度，并稱量微球重量。用上述方法制備不含質粒FGF-2的SPCGM，取制備過程中最后的洗滌液，用于檢測質粒濃度時調零，按下列公式計算微球的載藥量和包封率[9]:載藥量＝(投入FGF-2的量－上清液中FGF-2的量)／微球重量×100％、包封率＝(投入FGF-2的量－上清液中FGF-2的量)／投入FGF-2的量×100％。
1.6 磁力天平測定SPCFGM、SPCGM的磁感應性
分別取5 mL SPCFGM及SPCGM于EP管中，置于磁天平中間稱取重量，將磁場強度從0 mT(毫特斯拉,milli-tesla)逐級調到600 mT，以50 mT為間隔，分別記錄磁力天平顯示的重量，再將磁場強度從600 mT逐次下調至0 mT，再次記錄其重量變化，實驗重復三次，用0~50 mT間所測得的試管重量平均差值反映SPCFGM、SPCGM的磁感應性。
1.7 SPCFGM中質粒FGF-2的體外釋放實驗
稱取SPCFGM 5.00 mg，置于 25 mL三角燒瓶中，加10 mL 0.01 mol/L PBS(pH 7.4)，于37 ℃衡溫水浴，每次采樣0.5 mL上清液，同時補充PBS以維持釋放介質體積不變，用核酸蛋白測定儀(260 nm)測定釋放液中質粒FGF-2的含量，實驗重復3次，取其均值，連續測量7 d，計算每日及累計質粒釋放量，繪制體外釋放曲線[10]。
1.8 細胞培養及分組
小鼠胚胎期多潛能間充質干細胞C3H10細胞為重慶醫科大學附屬兒童醫院干細胞實驗室保存，置于含10%胎牛血清DMED培養基，5% CO2、37 ℃培養箱中培養，取對數生長期細胞用于實驗。稱取一定質量的SPCGM和SPCFGM兩種微球，用含10%血清的DMEM培養基配制成終濃度100 μg/mL的混懸液。實驗分為3組：空白對照組(Control組)，采用10%血清的DMEM培養基配；SPCGM組，采用100 μg/mL的SPCGM混懸液培養；SPCFGM組，采用100 μg/mL的SPCFGM混懸液培養。
1.9 DAPI染色檢測細胞凋亡
按上述方法處理3組C3H10細胞3 d后，吸棄培養基，用PBS將微球洗去，4%多聚甲醛固定1 h，吸棄多聚甲醛，PBS洗3遍，每孔加入2 μg/mL DAPI 0.5 mL，37 ℃避光孵育10 min，PBS洗三遍，倒置熒光顯微鏡觀察各組細胞細胞核形態，是否有核濃縮、核碎裂、染色質聚集等現象。
1.10 Western blot法檢測FGF-2在C3H10細胞中的表達
按上述方法處理3組C3H10細胞7 d后，提取各組細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，取50 μg經10％SDS-PAGE分離，條件：先80 V、30 min，后100V、100 min，然后100 V、60 min電轉移至PVDF膜上，用5％脫脂奶粉室溫封閉1 h；TBST洗膜3次，加入兔抗小鼠FGF-2一抗(1∶200稀釋)和小鼠抗小鼠β-actin 單抗(1∶200稀釋)，4 ℃過夜；TBST洗膜后，分別加入HRP標記的羊抗兔或羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋)，室溫孵育1 h；TBST洗膜3次后ECL發光成像。
1.11 CCK-8法檢測SPCFGM對C3H10細胞的增殖影響
以1×105個/mL密度接種于96孔培養板中，按上述方法處理3組C3H10細胞，，每孔100 uL培養體系，每組設3個復孔。置37℃ 、5%CO2的培養箱分別培養1、3、5和7 d后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，于培養箱中繼續孵育2 h，酶標儀上測定450 nm波長處每孔細胞的吸光度值(A450)，實驗重復3次。
1.12 流式細胞術檢測細胞增殖周期
按上述方法處理3組C3H10細胞3 d后，用PBS將微球洗去，用胰酶消化細胞，收集于EP管內，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗兩次后用預冷的70%(體積比)乙醇固定，流式細胞術分析細胞增殖周期。
1.13 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行統計學處理，結果以
2 結果
2.1 SPIOCNs、SPCFGM的形態及粒徑
經透射電子顯微鏡觀察SPIOCNs，如圖 1(a)所示，可見SPIOCNs微粒呈球形，分布均勻，呈聚集現象，激光衍射粒度分析儀測定其粒徑為(25±9) nm，符合超順磁性的條件。在光學顯微鏡下觀察SPCFGM，如圖 1(c)所示,可見SPCFGM微球呈規則球形，表面光滑，分散性好，粒徑(140±12) μm。
圖1
SPIOCNs、SPCFGM的形態及粒徑
(a) SPIOCNs透射電鏡照片(80 000×)； (b)SPIOCNs粒徑分布；(c)SPCFGM光學顯微鏡照片(100×)；(d)SPCFGM粒徑分布
Figure1. Morphologicy and grain size of SPIOCNs and SPCFGM(a) transmission electron micrograph of SPIOCNs (80 000×); (b) size distribution of SPIOCNs; (c) optical microscope images of SPCFGM (100×); (d) size distribution of SPCFGM
2.2 質粒pIRES2-EGFP-FGF-2與SPIOCNs的結合實驗
凱氏定氮法測定SPIOCNs氮含量為(18.45±2.07) mg/mL，質粒濃度為(308.64±24.67) ng/μL。瓊脂糖凝膠電泳圖顯示在不同氮/磷比條件下質粒與SPIOCNs的結合情況，如圖 2所示，在第6泳道(氮/磷比為2.5∶1)時無條帶跑出，說明此時SPIOCNs與質粒FGF-2已完全結合。
圖2
不同氮/磷比條件下質粒與SPIOCNs的結合的電泳圖
1：FGF-2質粒；2-6：質粒與SPIOCNs的氮/磷比分別為1∶2、1∶1、1.5∶1、 2∶1、2.5∶1；7：DNA MarkerⅡ
Figure2. Agarose gel electrophoretic profile of plasmid combined SPIOCNs with different N/P ratios1: FGF-2; 2-6: the N/P ration of plasmid/SPIOCNs is 1∶2, 1∶1, 1.5∶1, 2∶1, and 2.5∶1, respectively; 7: DNA MarkerⅡ
2.3 SPCFGM的磁感應性、載藥量、包封率及體外釋放活性
磁力天平測定結果顯示，當磁場強度由0 mT增加到50 mT時，SPCFGM增重(18.23±0.24) mg；SPCGMM增重(17.52±0.16) mg，當磁場強度從600 mT逐漸下降至0 mT時，二者的重量變化均為0 mg，提示SPCFGM和SPCGM有較強的磁感應性。載藥量和包封率是評價微球包裹藥物能力的兩個重要指標，在本實驗中，SPCFGM的載藥量為57.13%±5.41%，包封率為69.97%±0.04%。SPCFGM釋放曲線如圖 3所示，前4 d微球釋放FGF-2速度較快，5 d后釋放趨于平穩。
圖3
SPCFGM釋放FGF-2累積濃度的效果
Figure3.
Effect of accumulative concentrations of FGF-2 released from SPCFGM
2.4 DAPI染色檢測細胞凋亡形態
熒光顯微鏡下可見，微球處理細胞3 d后，SPCGM組和SPCFGM組細胞的細胞核呈強熒光，核形完整，染色質均勻，無核皺縮、核碎裂等凋亡細胞現象，與Control組的細胞形態無明顯差異，如圖 4所示。提示終濃度100 μg/mL明膠微球不會導致C3H10細胞凋亡，對其無細胞毒作用。
圖4
DAPI染色檢測細胞凋亡形態(400×)
Figure4.
Apoptosis morphology of cells detected by DAPI dye (400×)
2.5 Western blot法檢測FGF-2在C3H10細胞中的表達
Western blot分析顯示，微球處理7 d后，SPCFGM組FGF-2蛋白相對表達量(3.04±0.74)明顯高于Control組(0.81±0.16)及SPCGM組(0.63±0.15)(P＜0.05)，而Control組與SPCGM組FGF-2蛋白的表達量無統計學意義，如圖 5所示。提示SPCFGM在7 d內可以釋放FGF-2，并能高效表達FGF-2蛋白。
圖5
Western blot檢測各組細胞FGF-2蛋白的水平
Figure5.
Level of protein FGF-2 determined by Western blot in each group
2.6 CCK-8法檢測SPCFGM對C3H10細胞增殖的影響
各組細胞增殖情況如表 1所示，微球處理第1 d，3組細胞都增殖緩慢，SPCFGM組與SPCGM組對C3H10細胞增殖無明顯差異(P＞0.05)，從第3 d起，SPCFGM組細胞增殖加快，且明顯高于Control組及SPCGM組(P＜0.05)，而Control組與SPCGM組細胞增殖情況無明顯差異(P＞0.05)。提示SPCFGM在7 d內釋放FGF-2，FGF-2促進C3H10細胞增殖。
表1
各組細胞不同時間點的A450值(2.7 流式細胞術檢測細胞增殖周期
在細胞有絲分裂的各個時期中，能反映細胞增殖活性的時期是G2期和S期，細胞增殖指數PI=(G2+S)%。各組細胞增殖周期結果如圖 6所示，微球處理細胞3 d后，SPCFGM組細胞增殖指數最高(56.10±3.01)，增殖能力最強，明顯高于Control組(15.70±5.81)及SPCGM組(17.83±10.09)(P＜0.05)，提示SPCFGM在3 d內釋放FGF-2，FGF-2促進C3H10細胞的有絲分裂。
圖6
流式細胞儀檢側各組細胞增殖周期結果
Figure6.
Proliferation cycle results of various cells measured by flow cytometry
3 討論與結論
超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)具有超順磁性和良好的生物相容性，因而引起人們的廣泛關注。所謂超順磁性，是指當氧化鐵納米顆粒粒徑＜30 nm時，給予外加磁場就產生磁性，無磁場時，其磁性消失[11]。此特性還使得SPIONs具有磁靶向作用，已被用于腫瘤靶向治療[12]、磁共振成像[13]等研究。另有研究表明，適宜濃度SPIONs標記MSCs并不影響干細胞多向誘導分化能力[14]。并且SPIONs進入機體后，一部分可被機體吸收利用，其余部分通過腎臟、膽汁、皮膚等安全排除體外，對機體無損害[15]。然而，SPIONs在液態環境中易出現團聚現象，且易被氧化失去超順磁性，因此，SPIONs應用于生物醫學領域時，有必要對其進行表面修飾，不僅能增強穩定性，還能提高其在水溶液中的分散性和生物相容性，降低細胞毒性[16-17]。常用的表面修飾物有高分子聚合物、有機小分子、多糖、多肽等，本研究選用殼聚糖(chitosan,CS)修飾SPIONs。CS具有成本低、可生物降解性、生物相容性好、無毒性等優點，是常用的天然高分子載體材料[18]。同時，CS在酸性條件下為帶有陽離子的高分子聚合物，通過靜電吸附作用與DNA結合，使DNA不易被降解，并能夠完全進入細胞，可作為基因治療中的非病毒性載體[19]。
基因載體可以把目的基因送入靶細胞，然后將目的基因釋放出來，從而發揮目的基因的特點功能。因此，作為基因載體材料的重要判斷標準就是要能與DNA結合，并能在一定程度上保護DNA[20]。SPIOCNs的含氮量代表了復合微粒中殼聚糖的含量，間接反映了微粒結合DNA的能力。本實驗利用凱氏定氮法測定SPIOCNs的含氮量，并通過瓊脂糖凝膠電泳發現氮/磷比為2.5∶1時SPIOCNs與質粒FGF-2可以完全結合，Western blot證實SPCFGM作用于MSCs后，FGF-2蛋白高表達，說明與SPIOCNs結合的FGF-2可以釋放進入細胞，并得到高效表達，證明本實驗所制作的SPIOCNs可作為基因載體。
明膠是一種天然的動物膠原提取物，具有良好的生物相容性，明膠作為緩釋材料主要應用在藥物載體、賦型劑或緩釋殼層等方面。這些材料的形成主要是利用了明膠獨特的理化性能：能形成凝膠,易于成型；能與別的物質(如戊二醛)發生交聯反應，形成緩釋層；能被酶降解，易于被人體吸收等[21]。明膠與一些生長因子如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、FGF-2具有相反的電性，不僅能夠通過電荷吸引吸附細胞因子，而且可通過滲透、擴散和基質本身的溶蝕調控細胞因子釋放速率，起到緩釋的作用[22]。故本研究選用明膠作為FGF-2的包封材料。
載藥量和包封率是評價微球載藥能力的重要指標，受制備材料、制備工藝等因素影響。本實驗通過乳化交聯法制備的SPCFGM表面光滑，分布均勻，載藥量為57.13%±5.41%，包封率為69.97%±0.04%，達到FGF-2維持其活性的釋放量。本實驗制備的微球中由于加入了納米氧化鐵，使微球的重量增加，導致FGF-2在微球中的百分比下降，包封率有所降低。因此，提高微球載藥量和包封率是本實驗下一步研究的重點。
本研究還通過體外試驗證實，SPCFGM作用于MSCs后，緩慢釋放FGF-2，使FGF-2蛋白在MSCs中高表達，MSCs細胞增殖指數明顯增高，能促進MSCs增殖分化，且SPCFGM對MSCs的增值分化具有持續性作用，證明SPCFGM可以持續緩慢釋放FGF-2，并保持FGF-2的生物活性，與Mastrogiacomo等對FGF-2的研究一致[23]。
DAPI是一種熒光染料，可與雙鏈DNA結合發揮標記作用，常用于細胞凋亡檢測。凋亡細胞的細胞核破裂形成碎片，核解體，染色質固縮，向外周聚集，形成周邊化。本實驗結果顯示，SPCFGM作用于MSCs，細胞核完整，染色質均勻，無細胞凋亡形態。進一步證實SPCFGM無細胞毒性。綜上所述，本實驗成功制備了可釋放FGF-2的SPCFGM，并保持FGF-2的活性，能促進MSCs增殖，并對MSCs細胞無毒副作用，是理想的基因載體和包封材料。下一步，我們擬將其用于體內試驗，探索利用SPCFGM修復關節軟骨缺損的新方法。
引言
目前，如何促進關節軟骨損傷修復與再生是生物學家及生物工程師面臨的嚴峻挑戰[1]。從生物學角度來看，關節軟骨損傷后易引起關節疼痛、畸形及功能喪失，其修復是一個復雜的過程，因其無神經及血管支配，細胞體積比較低并且富含粘多糖的特性就限制了新生細胞主動或被動的向病變部位遷移,導致修復困難[2-3]。
軟骨組織工程用于關節軟骨損傷修復是近年來研究的熱點。間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有向軟骨細胞分化的潛能，是軟骨組織工程理想的種子細胞。但是MSCs的分化潛能隨年齡的增長而明顯下降，誘導分化機制尚不明確，其遺傳及體內增殖的安全性有待確定[4]。成纖維細胞生長因子2 (fibroblast growth factor2,FGF-2)是成纖維細胞因子家族一員，是參與軟骨損傷早期修復的關鍵因子，促進軟骨下間充質細胞的聚集和向軟骨細胞分化，在軟骨再生過程中起重要作用[5]。利用FGF-2對 MSCs的干預作用，即可以促進MSCs增殖，又可以定向誘導MSCs向軟骨細胞分化，但是外源性FGF-2性質不穩定，半衰期短，進入體內后易被蛋白酶降解[6]。因此，為了使FGF-2能在體內充分發揮其生物學效應，本研究擬通過制備超順磁性殼聚糖FGF-2明膠微球(superparamagnetic chitosan FGF-2 gelatin microspheres,SPCFGM)，實現FGF-2明膠微球既作為一種基因載體又作為釋放系統的可能性，調節FGF-2體內釋放的量效關系，為軟骨組織工程技術探索一條新的途徑。
1 材料與方法
1.1 材料
質粒pIRES2-EGFP-FGF-2由本課題組前期完成，胎牛血清和培養基DMEM購自美國Hyclone公司，質粒提取試劑盒購自美國Omega公司，FGF2一抗及羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物有限公司，CCK-8試劑購自南京凱基生物科技發展有限公司，硫酸亞鐵銨、硫酸鐵銨購自重慶北碚化學試劑廠，明膠，殼聚糖，4′,6-二脒基-2-苯基吲(4′，6-diamidino-2-pheny lindole，DAPI)購自Sigma公司，鹽酸及亞鐵氰化鉀購自成都市科龍化工試劑廠，所用化學試劑均為分析純。
1.2 超順磁性氧化鐵殼聚糖納米粒子的制備及檢測
化學共沉淀法[7]制備超順磁性氧化鐵殼聚糖納米粒子(superparamagnetic iron oxide chitosan nanoparticles,SPIOCNs)，將得到的黑色沉淀用蒸餾水反復洗滌，直至中性，室溫保存。取適量樣本在透射電鏡下觀察形態，并用激光衍射粒度分析儀測定粒徑及分布。用凱氏定氮法測定SPIOCNs氮含量[8]。
1.3 質粒pIRES2-EGFP-FGF-2與SPIOCNs的結合實驗
取1 μL質粒pIRES2-EGFP-FGF-2在1.8 V條件下利用電轉法轉染入E.coli DH5α感受態細菌中，37 ℃孵育30 min，加入含有卡那霉素(1∶1 000)的LB培養基中，培養過夜，按照質粒提取試劑盒的說明書提取質粒，經BglⅡ、Sal I 雙酶切鑒定，并檢測濃度。將SPIOCNs溶入醋酸鈉緩沖液中(pH=5.5),按不同氮/磷比例(0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1)與質粒混合，旋渦攪拌20 s,55 ℃下復合1 h。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察質粒與SPIOCNs結合情況。
1.4 SPCFGM的制備
乳化交聯法制備SPCFGM。取醋酸緩沖液(pH=5.5)配置的SPIOCNs 5 mL和FGF-2質粒5 mL混合，55 ℃孵育1 h，向混合液中加入10 mL 25%明膠，800 r/min攪拌溶解20 min制成明膠磁流體。另在三口燒瓶中加入100 mL液體石蠟和1 mL司班80，于65 ℃、800 r/min充分攪拌。將明膠磁流體緩慢滴入三口燒瓶中，300 r/min攪拌10 min，待出現乳狀液后迅速改為冰浴，降溫至4 ℃，緩慢滴加25％的戊二醛0.1 mL，繼續攪拌2 h，加入40 mL丙酮，攪拌3 min后靜置，待溶液分層后，可以看到制備出的淡黃色微球沉淀在最下層，過濾后將微球泡在10 mL丙酮溶液中，予4 ℃固化24 h。蒸餾水洗滌3次后將微球凍干，－20 ℃保存。取適量樣本用蒸餾水溶解，使微球均勻分散，取微球混液滴于載玻片上，在光學顯微鏡下觀察形態，并用激光衍射粒度分析儀測定其粒徑及分布。
1.5 SPCFGM的載藥量及包封率的測定
制備3批SPCFGM，收集最后的洗滌液，8 000 r/min離心5 min，取上清，用紫外分光光度儀在波長260 mm下檢測質粒濃度，并稱量微球重量。用上述方法制備不含質粒FGF-2的SPCGM，取制備過程中最后的洗滌液，用于檢測質粒濃度時調零，按下列公式計算微球的載藥量和包封率[9]:載藥量＝(投入FGF-2的量－上清液中FGF-2的量)／微球重量×100％、包封率＝(投入FGF-2的量－上清液中FGF-2的量)／投入FGF-2的量×100％。
1.6 磁力天平測定SPCFGM、SPCGM的磁感應性
分別取5 mL SPCFGM及SPCGM于EP管中，置于磁天平中間稱取重量，將磁場強度從0 mT(毫特斯拉,milli-tesla)逐級調到600 mT，以50 mT為間隔，分別記錄磁力天平顯示的重量，再將磁場強度從600 mT逐次下調至0 mT，再次記錄其重量變化，實驗重復三次，用0~50 mT間所測得的試管重量平均差值反映SPCFGM、SPCGM的磁感應性。
1.7 SPCFGM中質粒FGF-2的體外釋放實驗
稱取SPCFGM 5.00 mg，置于 25 mL三角燒瓶中，加10 mL 0.01 mol/L PBS(pH 7.4)，于37 ℃衡溫水浴，每次采樣0.5 mL上清液，同時補充PBS以維持釋放介質體積不變，用核酸蛋白測定儀(260 nm)測定釋放液中質粒FGF-2的含量，實驗重復3次，取其均值，連續測量7 d，計算每日及累計質粒釋放量，繪制體外釋放曲線[10]。
1.8 細胞培養及分組
小鼠胚胎期多潛能間充質干細胞C3H10細胞為重慶醫科大學附屬兒童醫院干細胞實驗室保存，置于含10%胎牛血清DMED培養基，5% CO2、37 ℃培養箱中培養，取對數生長期細胞用于實驗。稱取一定質量的SPCGM和SPCFGM兩種微球，用含10%血清的DMEM培養基配制成終濃度100 μg/mL的混懸液。實驗分為3組：空白對照組(Control組)，采用10%血清的DMEM培養基配；SPCGM組，采用100 μg/mL的SPCGM混懸液培養；SPCFGM組，采用100 μg/mL的SPCFGM混懸液培養。
1.9 DAPI染色檢測細胞凋亡
按上述方法處理3組C3H10細胞3 d后，吸棄培養基，用PBS將微球洗去，4%多聚甲醛固定1 h，吸棄多聚甲醛，PBS洗3遍，每孔加入2 μg/mL DAPI 0.5 mL，37 ℃避光孵育10 min，PBS洗三遍，倒置熒光顯微鏡觀察各組細胞細胞核形態，是否有核濃縮、核碎裂、染色質聚集等現象。
1.10 Western blot法檢測FGF-2在C3H10細胞中的表達
按上述方法處理3組C3H10細胞7 d后，提取各組細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，取50 μg經10％SDS-PAGE分離，條件：先80 V、30 min，后100V、100 min，然后100 V、60 min電轉移至PVDF膜上，用5％脫脂奶粉室溫封閉1 h；TBST洗膜3次，加入兔抗小鼠FGF-2一抗(1∶200稀釋)和小鼠抗小鼠β-actin 單抗(1∶200稀釋)，4 ℃過夜；TBST洗膜后，分別加入HRP標記的羊抗兔或羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋)，室溫孵育1 h；TBST洗膜3次后ECL發光成像。
1.11 CCK-8法檢測SPCFGM對C3H10細胞的增殖影響
以1×105個/mL密度接種于96孔培養板中，按上述方法處理3組C3H10細胞，，每孔100 uL培養體系，每組設3個復孔。置37℃ 、5%CO2的培養箱分別培養1、3、5和7 d后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，于培養箱中繼續孵育2 h，酶標儀上測定450 nm波長處每孔細胞的吸光度值(A450)，實驗重復3次。
1.12 流式細胞術檢測細胞增殖周期
按上述方法處理3組C3H10細胞3 d后，用PBS將微球洗去，用胰酶消化細胞，收集于EP管內，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗兩次后用預冷的70%(體積比)乙醇固定，流式細胞術分析細胞增殖周期。
1.13 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行統計學處理，結果以
2 結果
2.1 SPIOCNs、SPCFGM的形態及粒徑
經透射電子顯微鏡觀察SPIOCNs，如圖 1(a)所示，可見SPIOCNs微粒呈球形，分布均勻，呈聚集現象，激光衍射粒度分析儀測定其粒徑為(25±9) nm，符合超順磁性的條件。在光學顯微鏡下觀察SPCFGM，如圖 1(c)所示,可見SPCFGM微球呈規則球形，表面光滑，分散性好，粒徑(140±12) μm。
圖1
SPIOCNs、SPCFGM的形態及粒徑
(a) SPIOCNs透射電鏡照片(80 000×)； (b)SPIOCNs粒徑分布；(c)SPCFGM光學顯微鏡照片(100×)；(d)SPCFGM粒徑分布
Figure1. Morphologicy and grain size of SPIOCNs and SPCFGM(a) transmission electron micrograph of SPIOCNs (80 000×); (b) size distribution of SPIOCNs; (c) optical microscope images of SPCFGM (100×); (d) size distribution of SPCFGM
2.2 質粒pIRES2-EGFP-FGF-2與SPIOCNs的結合實驗
凱氏定氮法測定SPIOCNs氮含量為(18.45±2.07) mg/mL，質粒濃度為(308.64±24.67) ng/μL。瓊脂糖凝膠電泳圖顯示在不同氮/磷比條件下質粒與SPIOCNs的結合情況，如圖 2所示，在第6泳道(氮/磷比為2.5∶1)時無條帶跑出，說明此時SPIOCNs與質粒FGF-2已完全結合。
圖2
不同氮/磷比條件下質粒與SPIOCNs的結合的電泳圖
1：FGF-2質粒；2-6：質粒與SPIOCNs的氮/磷比分別為1∶2、1∶1、1.5∶1、 2∶1、2.5∶1；7：DNA MarkerⅡ
Figure2. Agarose gel electrophoretic profile of plasmid combined SPIOCNs with different N/P ratios1: FGF-2; 2-6: the N/P ration of plasmid/SPIOCNs is 1∶2, 1∶1, 1.5∶1, 2∶1, and 2.5∶1, respectively; 7: DNA MarkerⅡ
2.3 SPCFGM的磁感應性、載藥量、包封率及體外釋放活性
磁力天平測定結果顯示，當磁場強度由0 mT增加到50 mT時，SPCFGM增重(18.23±0.24) mg；SPCGMM增重(17.52±0.16) mg，當磁場強度從600 mT逐漸下降至0 mT時，二者的重量變化均為0 mg，提示SPCFGM和SPCGM有較強的磁感應性。載藥量和包封率是評價微球包裹藥物能力的兩個重要指標，在本實驗中，SPCFGM的載藥量為57.13%±5.41%，包封率為69.97%±0.04%。SPCFGM釋放曲線如圖 3所示，前4 d微球釋放FGF-2速度較快，5 d后釋放趨于平穩。
圖3
SPCFGM釋放FGF-2累積濃度的效果
Figure3.
Effect of accumulative concentrations of FGF-2 released from SPCFGM
2.4 DAPI染色檢測細胞凋亡形態
熒光顯微鏡下可見，微球處理細胞3 d后，SPCGM組和SPCFGM組細胞的細胞核呈強熒光，核形完整，染色質均勻，無核皺縮、核碎裂等凋亡細胞現象，與Control組的細胞形態無明顯差異，如圖 4所示。提示終濃度100 μg/mL明膠微球不會導致C3H10細胞凋亡，對其無細胞毒作用。
圖4
DAPI染色檢測細胞凋亡形態(400×)
Figure4.
Apoptosis morphology of cells detected by DAPI dye (400×)
2.5 Western blot法檢測FGF-2在C3H10細胞中的表達
Western blot分析顯示，微球處理7 d后，SPCFGM組FGF-2蛋白相對表達量(3.04±0.74)明顯高于Control組(0.81±0.16)及SPCGM組(0.63±0.15)(P＜0.05)，而Control組與SPCGM組FGF-2蛋白的表達量無統計學意義，如圖 5所示。提示SPCFGM在7 d內可以釋放FGF-2，并能高效表達FGF-2蛋白。
圖5
Western blot檢測各組細胞FGF-2蛋白的水平
Figure5.
Level of protein FGF-2 determined by Western blot in each group
2.6 CCK-8法檢測SPCFGM對C3H10細胞增殖的影響
各組細胞增殖情況如表 1所示，微球處理第1 d，3組細胞都增殖緩慢，SPCFGM組與SPCGM組對C3H10細胞增殖無明顯差異(P＞0.05)，從第3 d起，SPCFGM組細胞增殖加快，且明顯高于Control組及SPCGM組(P＜0.05)，而Control組與SPCGM組細胞增殖情況無明顯差異(P＞0.05)。提示SPCFGM在7 d內釋放FGF-2，FGF-2促進C3H10細胞增殖。
表1
各組細胞不同時間點的A450值(2.7 流式細胞術檢測細胞增殖周期
在細胞有絲分裂的各個時期中，能反映細胞增殖活性的時期是G2期和S期，細胞增殖指數PI=(G2+S)%。各組細胞增殖周期結果如圖 6所示，微球處理細胞3 d后，SPCFGM組細胞增殖指數最高(56.10±3.01)，增殖能力最強，明顯高于Control組(15.70±5.81)及SPCGM組(17.83±10.09)(P＜0.05)，提示SPCFGM在3 d內釋放FGF-2，FGF-2促進C3H10細胞的有絲分裂。
圖6
流式細胞儀檢側各組細胞增殖周期結果
Figure6.
Proliferation cycle results of various cells measured by flow cytometry
3 討論與結論
超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)具有超順磁性和良好的生物相容性，因而引起人們的廣泛關注。所謂超順磁性，是指當氧化鐵納米顆粒粒徑＜30 nm時，給予外加磁場就產生磁性，無磁場時，其磁性消失[11]。此特性還使得SPIONs具有磁靶向作用，已被用于腫瘤靶向治療[12]、磁共振成像[13]等研究。另有研究表明，適宜濃度SPIONs標記MSCs并不影響干細胞多向誘導分化能力[14]。并且SPIONs進入機體后，一部分可被機體吸收利用，其余部分通過腎臟、膽汁、皮膚等安全排除體外，對機體無損害[15]。然而，SPIONs在液態環境中易出現團聚現象，且易被氧化失去超順磁性，因此，SPIONs應用于生物醫學領域時，有必要對其進行表面修飾，不僅能增強穩定性，還能提高其在水溶液中的分散性和生物相容性，降低細胞毒性[16-17]。常用的表面修飾物有高分子聚合物、有機小分子、多糖、多肽等，本研究選用殼聚糖(chitosan,CS)修飾SPIONs。CS具有成本低、可生物降解性、生物相容性好、無毒性等優點，是常用的天然高分子載體材料[18]。同時，CS在酸性條件下為帶有陽離子的高分子聚合物，通過靜電吸附作用與DNA結合，使DNA不易被降解，并能夠完全進入細胞，可作為基因治療中的非病毒性載體[19]。
基因載體可以把目的基因送入靶細胞，然后將目的基因釋放出來，從而發揮目的基因的特點功能。因此，作為基因載體材料的重要判斷標準就是要能與DNA結合，并能在一定程度上保護DNA[20]。SPIOCNs的含氮量代表了復合微粒中殼聚糖的含量，間接反映了微粒結合DNA的能力。本實驗利用凱氏定氮法測定SPIOCNs的含氮量，并通過瓊脂糖凝膠電泳發現氮/磷比為2.5∶1時SPIOCNs與質粒FGF-2可以完全結合，Western blot證實SPCFGM作用于MSCs后，FGF-2蛋白高表達，說明與SPIOCNs結合的FGF-2可以釋放進入細胞，并得到高效表達，證明本實驗所制作的SPIOCNs可作為基因載體。
明膠是一種天然的動物膠原提取物，具有良好的生物相容性，明膠作為緩釋材料主要應用在藥物載體、賦型劑或緩釋殼層等方面。這些材料的形成主要是利用了明膠獨特的理化性能：能形成凝膠,易于成型；能與別的物質(如戊二醛)發生交聯反應，形成緩釋層；能被酶降解，易于被人體吸收等[21]。明膠與一些生長因子如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、FGF-2具有相反的電性，不僅能夠通過電荷吸引吸附細胞因子，而且可通過滲透、擴散和基質本身的溶蝕調控細胞因子釋放速率，起到緩釋的作用[22]。故本研究選用明膠作為FGF-2的包封材料。
載藥量和包封率是評價微球載藥能力的重要指標，受制備材料、制備工藝等因素影響。本實驗通過乳化交聯法制備的SPCFGM表面光滑，分布均勻，載藥量為57.13%±5.41%，包封率為69.97%±0.04%，達到FGF-2維持其活性的釋放量。本實驗制備的微球中由于加入了納米氧化鐵，使微球的重量增加，導致FGF-2在微球中的百分比下降，包封率有所降低。因此，提高微球載藥量和包封率是本實驗下一步研究的重點。
本研究還通過體外試驗證實，SPCFGM作用于MSCs后，緩慢釋放FGF-2，使FGF-2蛋白在MSCs中高表達，MSCs細胞增殖指數明顯增高，能促進MSCs增殖分化，且SPCFGM對MSCs的增值分化具有持續性作用，證明SPCFGM可以持續緩慢釋放FGF-2，并保持FGF-2的生物活性，與Mastrogiacomo等對FGF-2的研究一致[23]。
DAPI是一種熒光染料，可與雙鏈DNA結合發揮標記作用，常用于細胞凋亡檢測。凋亡細胞的細胞核破裂形成碎片，核解體，染色質固縮，向外周聚集，形成周邊化。本實驗結果顯示，SPCFGM作用于MSCs，細胞核完整，染色質均勻，無細胞凋亡形態。進一步證實SPCFGM無細胞毒性。綜上所述，本實驗成功制備了可釋放FGF-2的SPCFGM，并保持FGF-2的活性，能促進MSCs增殖，并對MSCs細胞無毒副作用，是理想的基因載體和包封材料。下一步，我們擬將其用于體內試驗，探索利用SPCFGM修復關節軟骨缺損的新方法。
