臨床上常將喜炎平與抗生素聯合應用來治療感染性疾病,本文通過研究喜炎平與頭孢唑啉聯合應用對小鼠外周血中性粒細胞的趨化功能和吞噬功能的影響來探討其作用機制。隨機選擇10只正常小鼠作為空白組;將金黃色葡萄球菌感染后的40只小鼠分為模型組、喜炎平組、頭孢唑啉組及喜炎平+頭孢唑啉組(聯合用藥組)。空白組與模型組經腹腔給予生理鹽水,其他組經腹腔依次給予喜炎平、頭孢唑啉、喜炎平+頭孢唑啉。采用transwell小室法檢測小鼠外周血中性粒細胞趨化功能。用流式細胞術檢測小鼠外周血中性粒細胞吞噬功能。結果顯示:各組小鼠外周血中性粒細胞的趨化指數的差異無統計學意義(P＞0.05)。空白組、喜炎平組、聯合用藥組小鼠外周血中性粒細胞的實際吞噬率和吞噬指數均明顯高于模型組和頭孢唑啉組(P＜0.01);空白組、喜炎平組和聯合用藥組間兩個指標的差異均無統計學意義(P＞0.05),模型組和頭孢唑啉組之間兩個指標的差異亦無統計學意義(P＞0.05)。本研究結果提示,喜炎平與頭孢唑啉聯合應用可以通過增強中性粒細胞的吞噬功能來提高療效。
引用本文： 熊南燕, 王雪玲, 劉曉霞, 陳劍華, 鄭海平, 霍忠超, 焦俊芳. 喜炎平與頭孢唑啉聯合應用對小鼠中性粒細胞功能影響的研究. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(5): 1079-1082. doi: 10.7507/1001-5515.20150191 復制
引言
喜炎平注射液為國家基本用藥品種，主要成分為穿心蓮內酯磺化物，屬清熱解毒、抗菌消炎藥。臨床上主要用于上呼吸道感染、病毒性肺炎、支氣管炎、小兒腹瀉、菌痢等治療，臨床上常見其與抗生素配伍使用。有研究發現，喜炎平與頭孢菌素類[1]、大環內酯類[2-3]抗生素聯合應用，可顯著提高對上呼吸道感染、小兒支原體肺炎等的療效。本課題組[4]和肖琪[5]的研究也發現喜炎平可增強頭孢類抗生素的抗菌作用。那么聯合應用后，通過哪些機制提高療效呢？本課題以喜炎平與頭孢唑啉聯合應用為例，對固有免疫細胞之一的中性粒細胞(polymorphonuclear,PMN)的相關功能進行了研究，為臨床上進一步聯合用藥提供有力的理論支持。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 試劑
異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、HEPES為Solarbio公司產品；酵母多糖為Sigma公司產品；transwell小室為corning公司產品；小鼠中性粒細胞分離液、紅細胞裂解液、臺盼藍、二甲基亞砜(DMSO)為天津灝洋生物制品有限公司產品，肝素為湖北康寶泰精細化工有限公司產品。
1.1.2 動物
昆明種小鼠70只，雌雄各半，鼠齡6~8周，體重18~22 g(購自河北省實驗動物中心，合格證編號：1311031)。
1.1.3 菌株
金黃色葡萄球菌敏感菌株26001-25、大腸埃希桿菌應用菌株 44102-3a7均購自北京市藥品生物制品檢定所。
2.1.4 趨化因子的制備
秤取酵母多糖加入到新鮮人血清中(濃度為2 mg/mL)，37 ℃水浴保溫30 min，3000 r/min，離心30 min，收集上清液，56 ℃、30 min加熱處理，-30 ℃保存，備用。使用前，37 ℃預溫10~20 min。
2.1.5 倫理審查意見
本文實驗方案均經過河北工程大學醫學院醫學生物科研倫理委員會同意。
1.2 實驗方法
1.2.1 動物分組、造模及給藥
70只昆明種小鼠，雌雄各半。實驗前用電子體溫計測定小鼠直腸溫度兩次，兩次間隔時間為1 h，選出兩次體溫相近的小鼠65只，其中隨機選擇10只作為空白組，其他55只小鼠每只均經腹腔注射濃度為9×108個/mL的金黃色葡萄球菌菌液0.2 mL，1 h后再測體溫，選擇有明顯發熱反應的小鼠40只，按發熱之高低平均分配于4組，分別為模型組、喜炎平組、頭孢唑啉組和喜炎平+頭孢唑啉組(聯合用藥組)，每組10只。空白組和模型組經腹腔給予生理鹽水(normal saline,NS)，70 mg/(kg·次)，每天2次；其他3組分別給予喜炎平，13 mg/(kg·次)，每天2次；頭孢唑啉，70 mg/(kg·次)，每天2次；喜炎平+頭孢唑啉，用量及用法同喜炎平及頭孢唑啉組。連續給藥7 d，于第7天給藥后2 h小鼠球后靜脈叢采血約0.8~1 mL，肝素抗凝。
1.2.2 中性粒細胞趨化功能檢測
(1)分離小鼠中性粒細胞取方法1.2.1中抗凝血0.6~0.8 mL，按小鼠中性粒細胞分離液說明書操作分離中性粒細胞，臺盼藍染色法檢測分離率及細胞活力，分離率達到80%以上，細胞活力大于95%，用含HEPES的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)調整濃度為2×105個/mL。
(2)transwell小室檢測中性粒細胞趨化功能 取24孔transwell小室，每份中性粒細胞懸液做2個小室。在下室分別加入500 μL趨化因子和500 μL PBS,上室均加入200 μL中性粒細胞懸液，于37 ℃、 5% CO2、飽和濕度條件下培養1 h，棄去上室液體，PBS洗滌2遍，用棉簽擦去上室膜上未趨化細胞，移去小室，倒置，風干，在下室加入500 μL、0.1%結晶紫染液，將小室置于其中，使膜浸沒在染液中，37 ℃，孵育30 min，棄去結晶紫染液，用PBS洗滌2遍，在下室加入500 μL、33%醋酸溶液，將小室置于其中，使膜浸沒在染液中，震蕩10 min，充分溶解脫色，取出小室，酶標儀570 nm測OD值。計算趨化指數。
趨化指數=趨化因子OD值/PBS OD值
1.2.3 中性粒細胞吞噬功能檢測
(1)FITC標記細胞[6]取對數生長期(16~18 h培養)的大腸埃希菌，3 000 r/min離心15 min，用PBS洗滌2次，用碳酸鹽緩沖液(carbonate buffer solution,CB,pH 9.5)配成濃度為0.5×109個/mL的細菌懸液，加入1 mg/mL FITC溶液，終濃度為5 μg/mL，37 ℃孵育2 h，3 000 r/min離心15 min，棄上清，PBS洗滌2次，PBS配成1×109個/mL懸液。
(2)流式細胞術檢測中性粒細胞吞噬功能 在兩個流式管中分別加入實驗方法1.2.1 中的抗凝血100 μL，加入標記菌液20 μL，混勻，一支流式管放入37 ℃水浴15 min，另一支放入0 ℃環境15 min，迅速取出放入冰中10 min，加入冷PBS 2 mL，1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入紅細胞裂解液2 mL，室溫放置5 min，1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入冷PBS 2 mL洗滌2次，離心，棄上清，PBS重懸細胞(包含細胞數至少10 000個)，用流式細胞儀進行檢測，計算吞噬率和吞噬指數。
吞噬率(%)=吞噬細菌的細胞數/總細胞數×100%
實際吞噬率(%)=37 ℃吞噬率-0 ℃吞噬率
吞噬指數=熒光強度/總細胞數
1.3 統計學方法
應用SPSS 16.0統計軟件對所有數據進行統計學處理，結果以
2 結果
2.1 喜炎平與頭孢唑啉聯用對小鼠外周血中性粒細胞趨化功能的影響
transwell小室法檢測結果顯示，空白組、模型組、喜炎平組、頭孢唑啉組、喜炎平+頭孢唑啉組的趨化指數分別為：2.039±0.52、1.97±0.66、2.06±0.75、1.91±0.70、1.85±0.53，各組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。
2.2 喜炎平與頭孢唑啉聯合應用對小鼠外周血中性粒細胞吞噬功能的影響
各組37 ℃吞噬率結果，如圖 1所示。流式細胞術分析結果顯示，空白組(6.83%±2.42%)、喜炎平組(5.45%±1.70%)、聯合用藥組(6.88%±3.84%)小鼠中性粒細胞的實際吞噬率明顯高于模型組(3.54%±1.49%)及頭孢唑啉組(2.66%±1.73%)(P＜0.01)。空白組、喜炎平組和聯合用藥組間實際吞噬率差異無統計學意義(P
空白組(3.28±1.04)、喜炎平組(2.95±0.93)、聯合用藥組(3.16±0.91)小鼠中性粒細胞的吞噬指數也明顯高于模型組(1.15±0.86)和頭孢唑啉組(1.47±0.43)(P＜0.01)。空白組、喜炎平組和聯合用藥組間吞噬指數差異無統計學意義(P＞0.05)；模型組和頭孢唑啉組之間吞噬指數差異亦無統計學意義(P＞0.05)。
3 討論
中性粒細胞來源于骨髓，占血液白細胞總數的60%~70%。它是宿主抵抗感染的主要防御細胞，以及炎癥初期在損傷部位出現的主要白細胞，也是機體抗感染的第一道防線，具有趨化、吞噬、產生氧自由基及釋放作用等生物學特性。在病原微生物感染過程中，中性粒細胞活化，與血管壁接觸、滾動，緊密黏附于血管壁，在趨化因子的誘導下，中性粒細胞順趨化因子濃度梯度移行，穿過內皮細胞進入血管間隙，再遷移至感染部位。機體的吞噬功能是一個主動而復雜的過程，當中性粒細胞到達炎癥部位并與異物接觸后，形成偽足，將異物包圍，質膜內陷形成吞噬體，將入侵的病原微生物吞入胞內，由于中性粒細胞內含有大量溶酶體酶，進入胞內的吞噬體與溶酶體融合，溶酶體中的各種抗菌物質隨即釋放出來，將吞噬入細胞內的細菌和組織碎片分解。病原微生物在入侵的局部即被消滅，防止病原微生物在體內擴散[7]。
在這一過程中，中性粒細胞遷移到感染灶是其發揮抗感染作用的第一步，這個過程是順趨化因子濃度梯度進行的，即趨化性。在本實驗中，我們用酵母多糖活化的新鮮血清作為趨化因子，通過transwell小室，利用中性粒細胞的這一特性，在體外模擬中性粒細胞順趨化因子濃度梯度向感染灶趨化這一過程，對遷移至聚碳酸酯膜下層的中性粒細胞進行染色、脫色，通過測定趨化指數檢測中性粒細胞的趨化能力。趨化指數越大，表明趨化能力越強。結果發現，各處理組中中性粒細胞趨化指數無顯著性差異，說明喜炎平與頭孢唑啉聯合應用不會通過增強中性粒細胞的趨化作用來增強抗菌作用。
當中性粒細胞到達炎癥部位后，可迅速吞噬入侵的病原微生物，是中性粒細胞細胞內殺傷、消化分解病原體的必須步驟。在本實驗中，我們用FITC標記大腸桿菌，與中性粒細胞共同孵育后，通過流式細胞術測定具有熒光的中性粒細胞數量(即吞噬率)和平均熒光強度(吞噬指數)，分別代表吞噬細菌的中性粒細胞數量和中性粒細胞吞噬的細菌數量。從而來檢測各組藥物處理后中性粒細胞的吞噬功能。結果發現，小鼠感染金黃色葡萄球菌(模型組)后，吞噬率和吞噬指數明顯低于正常小鼠；用頭孢唑啉處理后，吞噬率和吞噬指數未見回升，仍低于正常小鼠；用喜炎平處理后，小鼠吞噬率吞噬指數升高，接近正常水平；兩種藥物聯合處理后，吞噬率和吞噬指數回升，接近正常水平，且與喜炎平處理后的數值接近。由本部分結果可知，機體感染金黃色葡萄球菌后中性粒細胞吞噬功能受到一定程度的抑制，喜炎平治療后可解除此抑制，使中性粒細胞吞噬功能達到正常水平；而頭孢唑啉雖可殺傷金黃色葡萄球菌，但不能改善中性粒細胞的吞噬功能，當兩種藥物聯合應用時，其藥理作用可互相補充，增強抗菌療效。
結合文獻與本組結果，我們認為喜炎平與頭孢唑啉聯合應用不僅可通過增強頭孢唑啉的抗菌活性來提高療效，也可以通過增強中性粒細胞的吞噬功能來提高療效。
引言
喜炎平注射液為國家基本用藥品種，主要成分為穿心蓮內酯磺化物，屬清熱解毒、抗菌消炎藥。臨床上主要用于上呼吸道感染、病毒性肺炎、支氣管炎、小兒腹瀉、菌痢等治療，臨床上常見其與抗生素配伍使用。有研究發現，喜炎平與頭孢菌素類[1]、大環內酯類[2-3]抗生素聯合應用，可顯著提高對上呼吸道感染、小兒支原體肺炎等的療效。本課題組[4]和肖琪[5]的研究也發現喜炎平可增強頭孢類抗生素的抗菌作用。那么聯合應用后，通過哪些機制提高療效呢？本課題以喜炎平與頭孢唑啉聯合應用為例，對固有免疫細胞之一的中性粒細胞(polymorphonuclear,PMN)的相關功能進行了研究，為臨床上進一步聯合用藥提供有力的理論支持。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 試劑
異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、HEPES為Solarbio公司產品；酵母多糖為Sigma公司產品；transwell小室為corning公司產品；小鼠中性粒細胞分離液、紅細胞裂解液、臺盼藍、二甲基亞砜(DMSO)為天津灝洋生物制品有限公司產品，肝素為湖北康寶泰精細化工有限公司產品。
1.1.2 動物
昆明種小鼠70只，雌雄各半，鼠齡6~8周，體重18~22 g(購自河北省實驗動物中心，合格證編號：1311031)。
1.1.3 菌株
金黃色葡萄球菌敏感菌株26001-25、大腸埃希桿菌應用菌株 44102-3a7均購自北京市藥品生物制品檢定所。
2.1.4 趨化因子的制備
秤取酵母多糖加入到新鮮人血清中(濃度為2 mg/mL)，37 ℃水浴保溫30 min，3000 r/min，離心30 min，收集上清液，56 ℃、30 min加熱處理，-30 ℃保存，備用。使用前，37 ℃預溫10~20 min。
2.1.5 倫理審查意見
本文實驗方案均經過河北工程大學醫學院醫學生物科研倫理委員會同意。
1.2 實驗方法
1.2.1 動物分組、造模及給藥
70只昆明種小鼠，雌雄各半。實驗前用電子體溫計測定小鼠直腸溫度兩次，兩次間隔時間為1 h，選出兩次體溫相近的小鼠65只，其中隨機選擇10只作為空白組，其他55只小鼠每只均經腹腔注射濃度為9×108個/mL的金黃色葡萄球菌菌液0.2 mL，1 h后再測體溫，選擇有明顯發熱反應的小鼠40只，按發熱之高低平均分配于4組，分別為模型組、喜炎平組、頭孢唑啉組和喜炎平+頭孢唑啉組(聯合用藥組)，每組10只。空白組和模型組經腹腔給予生理鹽水(normal saline,NS)，70 mg/(kg·次)，每天2次；其他3組分別給予喜炎平，13 mg/(kg·次)，每天2次；頭孢唑啉，70 mg/(kg·次)，每天2次；喜炎平+頭孢唑啉，用量及用法同喜炎平及頭孢唑啉組。連續給藥7 d，于第7天給藥后2 h小鼠球后靜脈叢采血約0.8~1 mL，肝素抗凝。
1.2.2 中性粒細胞趨化功能檢測
(1)分離小鼠中性粒細胞取方法1.2.1中抗凝血0.6~0.8 mL，按小鼠中性粒細胞分離液說明書操作分離中性粒細胞，臺盼藍染色法檢測分離率及細胞活力，分離率達到80%以上，細胞活力大于95%，用含HEPES的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)調整濃度為2×105個/mL。
(2)transwell小室檢測中性粒細胞趨化功能 取24孔transwell小室，每份中性粒細胞懸液做2個小室。在下室分別加入500 μL趨化因子和500 μL PBS,上室均加入200 μL中性粒細胞懸液，于37 ℃、 5% CO2、飽和濕度條件下培養1 h，棄去上室液體，PBS洗滌2遍，用棉簽擦去上室膜上未趨化細胞，移去小室，倒置，風干，在下室加入500 μL、0.1%結晶紫染液，將小室置于其中，使膜浸沒在染液中，37 ℃，孵育30 min，棄去結晶紫染液，用PBS洗滌2遍，在下室加入500 μL、33%醋酸溶液，將小室置于其中，使膜浸沒在染液中，震蕩10 min，充分溶解脫色，取出小室，酶標儀570 nm測OD值。計算趨化指數。
趨化指數=趨化因子OD值/PBS OD值
1.2.3 中性粒細胞吞噬功能檢測
(1)FITC標記細胞[6]取對數生長期(16~18 h培養)的大腸埃希菌，3 000 r/min離心15 min，用PBS洗滌2次，用碳酸鹽緩沖液(carbonate buffer solution,CB,pH 9.5)配成濃度為0.5×109個/mL的細菌懸液，加入1 mg/mL FITC溶液，終濃度為5 μg/mL，37 ℃孵育2 h，3 000 r/min離心15 min，棄上清，PBS洗滌2次，PBS配成1×109個/mL懸液。
(2)流式細胞術檢測中性粒細胞吞噬功能 在兩個流式管中分別加入實驗方法1.2.1 中的抗凝血100 μL，加入標記菌液20 μL，混勻，一支流式管放入37 ℃水浴15 min，另一支放入0 ℃環境15 min，迅速取出放入冰中10 min，加入冷PBS 2 mL，1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入紅細胞裂解液2 mL，室溫放置5 min，1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入冷PBS 2 mL洗滌2次，離心，棄上清，PBS重懸細胞(包含細胞數至少10 000個)，用流式細胞儀進行檢測，計算吞噬率和吞噬指數。
吞噬率(%)=吞噬細菌的細胞數/總細胞數×100%
實際吞噬率(%)=37 ℃吞噬率-0 ℃吞噬率
吞噬指數=熒光強度/總細胞數
1.3 統計學方法
應用SPSS 16.0統計軟件對所有數據進行統計學處理，結果以
2 結果
2.1 喜炎平與頭孢唑啉聯用對小鼠外周血中性粒細胞趨化功能的影響
transwell小室法檢測結果顯示，空白組、模型組、喜炎平組、頭孢唑啉組、喜炎平+頭孢唑啉組的趨化指數分別為：2.039±0.52、1.97±0.66、2.06±0.75、1.91±0.70、1.85±0.53，各組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。
2.2 喜炎平與頭孢唑啉聯合應用對小鼠外周血中性粒細胞吞噬功能的影響
各組37 ℃吞噬率結果，如圖 1所示。流式細胞術分析結果顯示，空白組(6.83%±2.42%)、喜炎平組(5.45%±1.70%)、聯合用藥組(6.88%±3.84%)小鼠中性粒細胞的實際吞噬率明顯高于模型組(3.54%±1.49%)及頭孢唑啉組(2.66%±1.73%)(P＜0.01)。空白組、喜炎平組和聯合用藥組間實際吞噬率差異無統計學意義(P
空白組(3.28±1.04)、喜炎平組(2.95±0.93)、聯合用藥組(3.16±0.91)小鼠中性粒細胞的吞噬指數也明顯高于模型組(1.15±0.86)和頭孢唑啉組(1.47±0.43)(P＜0.01)。空白組、喜炎平組和聯合用藥組間吞噬指數差異無統計學意義(P＞0.05)；模型組和頭孢唑啉組之間吞噬指數差異亦無統計學意義(P＞0.05)。
3 討論
中性粒細胞來源于骨髓，占血液白細胞總數的60%~70%。它是宿主抵抗感染的主要防御細胞，以及炎癥初期在損傷部位出現的主要白細胞，也是機體抗感染的第一道防線，具有趨化、吞噬、產生氧自由基及釋放作用等生物學特性。在病原微生物感染過程中，中性粒細胞活化，與血管壁接觸、滾動，緊密黏附于血管壁，在趨化因子的誘導下，中性粒細胞順趨化因子濃度梯度移行，穿過內皮細胞進入血管間隙，再遷移至感染部位。機體的吞噬功能是一個主動而復雜的過程，當中性粒細胞到達炎癥部位并與異物接觸后，形成偽足，將異物包圍，質膜內陷形成吞噬體，將入侵的病原微生物吞入胞內，由于中性粒細胞內含有大量溶酶體酶，進入胞內的吞噬體與溶酶體融合，溶酶體中的各種抗菌物質隨即釋放出來，將吞噬入細胞內的細菌和組織碎片分解。病原微生物在入侵的局部即被消滅，防止病原微生物在體內擴散[7]。
在這一過程中，中性粒細胞遷移到感染灶是其發揮抗感染作用的第一步，這個過程是順趨化因子濃度梯度進行的，即趨化性。在本實驗中，我們用酵母多糖活化的新鮮血清作為趨化因子，通過transwell小室，利用中性粒細胞的這一特性，在體外模擬中性粒細胞順趨化因子濃度梯度向感染灶趨化這一過程，對遷移至聚碳酸酯膜下層的中性粒細胞進行染色、脫色，通過測定趨化指數檢測中性粒細胞的趨化能力。趨化指數越大，表明趨化能力越強。結果發現，各處理組中中性粒細胞趨化指數無顯著性差異，說明喜炎平與頭孢唑啉聯合應用不會通過增強中性粒細胞的趨化作用來增強抗菌作用。
當中性粒細胞到達炎癥部位后，可迅速吞噬入侵的病原微生物，是中性粒細胞細胞內殺傷、消化分解病原體的必須步驟。在本實驗中，我們用FITC標記大腸桿菌，與中性粒細胞共同孵育后，通過流式細胞術測定具有熒光的中性粒細胞數量(即吞噬率)和平均熒光強度(吞噬指數)，分別代表吞噬細菌的中性粒細胞數量和中性粒細胞吞噬的細菌數量。從而來檢測各組藥物處理后中性粒細胞的吞噬功能。結果發現，小鼠感染金黃色葡萄球菌(模型組)后，吞噬率和吞噬指數明顯低于正常小鼠；用頭孢唑啉處理后，吞噬率和吞噬指數未見回升，仍低于正常小鼠；用喜炎平處理后，小鼠吞噬率吞噬指數升高，接近正常水平；兩種藥物聯合處理后，吞噬率和吞噬指數回升，接近正常水平，且與喜炎平處理后的數值接近。由本部分結果可知，機體感染金黃色葡萄球菌后中性粒細胞吞噬功能受到一定程度的抑制，喜炎平治療后可解除此抑制，使中性粒細胞吞噬功能達到正常水平；而頭孢唑啉雖可殺傷金黃色葡萄球菌，但不能改善中性粒細胞的吞噬功能，當兩種藥物聯合應用時，其藥理作用可互相補充，增強抗菌療效。
結合文獻與本組結果，我們認為喜炎平與頭孢唑啉聯合應用不僅可通過增強頭孢唑啉的抗菌活性來提高療效，也可以通過增強中性粒細胞的吞噬功能來提高療效。