本研究旨在探討納秒電脈沖(nsEP)對人卵巢癌細胞鉑敏感株A2780及鉑耐藥株C30的DNA損傷效應。將A2780和C30分別作用于場強為6 kV/cm,脈寬為24 ns的脈沖電場處理60 s。假處理組予假脈沖處理。nsEP處理后0 h、4 h、8 h、12 h和24 h采用CCK-8法檢測細胞生存率;采用堿性單細胞凝膠電泳實驗(彗星實驗)檢測細胞DNA損傷,測定彗星尾長(TL)、尾矩(TM)和Olive尾矩(OTM)的75th百分位數。結果顯示隨著時間增加,A2780和C30細胞的生存率和彗星形成率均先降低后增加,8 h時最低(P＜0.05);C30細胞的生存率高于A2780細胞(P＜0.05),彗星形成率低于A2780細胞(P＜0.05);C30細胞的TL、TM和OTM均低于A2780細胞(P＜0.05);細胞死亡率和彗星形成率呈正相關(r=0.997,P＜0.05;r=0.998,P＜0.05)。結果表明,nsEP對人卵巢癌鉑敏感細胞株和鉑耐藥細胞株的DNA損傷效應存在差異;nsEP致細胞死亡與DNA損傷相關。
引用本文： 劉紹麗, 付曉, 任學毅, 于廷和, 胡麗娜. 納秒電脈沖致人卵巢癌細胞DNA損傷的時間效應. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(5): 1075-1078. doi: 10.7507/1001-5515.20150190 復制
引言
卵巢癌是女性生殖器常見惡性腫瘤之一，盡管已有多種治療應用于臨床，但其5年生存率仍僅為45%[1]。卵巢癌的化療是一種聯合化療，以鉑類為基礎，其中順鉑是比較有效且廣泛應用于臨床的一線藥物，但長期化療患者及卵巢癌復發患者的耐藥情況十分普遍，故療效不盡如人意[2]。因此，尋求新的、非藥物的治療方案甚有必要。Beebe等[3]發現單獨使用脈沖電場可致腫瘤細胞死亡。根據脈沖電場參數(強度或脈寬)的不同，可產生不同的生物效應。微秒(μs)強度的電脈沖可產生電穿孔效應(electroporation)；納秒(ns)強度的電脈沖對細胞膜的影響極小而能夠對細胞核產生較大影響，從而有效抑制腫瘤的生長。理論計算表明納秒電脈沖(nanosecond electric pulses,nsEP)可跨膜影響細胞內結構[4]。nsEP作為一種不需要藥物的純電場治療，且無熱消融，有望成為腫瘤治療的一種新型手段[5]。為進一步研究卵巢癌順鉑耐藥細胞的治療，本文選擇人卵巢癌鉑敏感細胞株A2780和人卵巢癌鉑耐藥細胞株C30作為研究對象，旨在通過研究nsEP對人卵巢癌鉑敏感和鉑耐藥細胞株DNA損傷的時間效應，探討nsEP引起的DNA損傷與細胞死亡之間的相關性。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 試劑RPMI
1640培養基(Hyclone，美國)，胎牛血清(四季青，中國)，胰蛋白酶(Hyclone，美國)，DAPI(Biotium，美國)，順鉑注射液(云南個舊生物藥業有限公司，中國)，CCK-8試劑盒(同仁，日本)，低熔點瓊脂糖(Promega，美國)，正常熔點瓊脂糖(TIANGEN，中國)，TritonX-100(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，中國)。
1.1.2 儀器
納秒脈沖電源(本實驗室自主研制)[4]，CO2細胞培養箱、全波長酶標儀(Thermo Scientific，美國)，電泳儀(BIO-RAD，美國)，熒光顯微鏡(Nikon Ti-E，日本)。
1.1.3 細胞系
人卵巢癌鉑敏感細胞株A2780購于中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC)，鉑耐藥株C30為重慶醫科大學第二附屬醫院婦產科重點實驗室保存。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
A2780和C30細胞以含體積分數為10%胎牛血清，5%雙抗(100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素)的RPMI 1640培養基，于37 ℃、 5% CO2培養條件下培養，每2~3 d換液，并觀察其生長狀態。C30細胞培養基中加入9 μg/mL順鉑，實驗前48 h更換為無藥培養基。
1.2.2 nsEP處理
取對數生長期的細胞制備密度為5×105個/mL的單細胞懸液，取1 mL細胞于24孔板中，調整電極間距離為1 cm，電壓6 kV(即場強6 kV/cm)，脈寬為24 ns的脈沖電場處理60 s。假處理組細胞給予假脈沖處理。
1.2.3 CCK-8法檢測細胞死亡率
nsEP處理后繼續培養細胞于0、4、8、12和24 h用CCK-8試劑盒測定細胞活性，并計算細胞死亡率[6]。每個時間點均設置有實驗組(nsEP處理后)、假處理組(nsEP假處理)和空白組(不含細胞，僅加入100 μL實驗用培養基)。具體步驟：①將上述nsEP處理后的細胞調整密度為3.5×105個/mL的單細胞懸液，接種于96孔板中，設置3個復孔；②在相同時間點的96孔板每孔中加入CCK-8試劑10 μL，包括空白組；③將孔板中的細胞放置于37 ℃細胞培養箱中繼續孵育2 h后，用全波長酶標儀于450 nm測定吸光度(A)。
細胞存活率(%)=[(A實驗孔－A空白孔)/(A對照孔－A空白孔)]×100%。
細胞死亡率(%) =1－細胞存活率(%)
1.2.4 單細胞凝膠電泳實驗
于nsEP處理后4、8、12、24 h，參照Singh等[7]描述的方法行單細胞凝膠電泳。具體步驟如下：第一層膠的制備：于自制的光面載玻片上滴加150 μL 1％的正常熔點瓊脂糖，加蓋蓋玻片。4 ℃固化20 min。第二層膠的制備：輕輕揭去蓋玻片，在第一層膠上滴加1∶5(細胞∶低熔點瓊脂糖)比例配制的含有8×104個細胞的75 μL低熔點瓊脂糖，加蓋蓋玻片，4 ℃固化20 min。裂解：輕輕揭去蓋玻片，將制好的凝膠玻片浸入冰冷的堿性(pH 10.0)裂解液中(臨用前加1％ Triton X-100)，4 ℃裂解2 h。解旋：取出凝膠玻片，PBS漂洗3次后置于水平電泳槽內，加入pH 13的堿性電泳緩沖液(高于玻片2~3 mm)，避光放置20 min。電泳：設置電壓25 V，電流300 mA，電泳20 min。漂洗：pH 7.5的Tris-HCl漂洗3次，每次5 min，室溫晾干。染色：膠上滴加濃度為5 μg/mL DAPI染色15 min，雙蒸水漂洗3次，每次5 min，室溫晾干。圖像采集：采用倒置熒光顯微鏡觀察、攝像。每組至少采集100個細胞作彗星分析。
單細胞凝膠電泳后得到的彗星圖像用CASP(http://casplab.com)軟件分析，測量尾長(tail length,TL)、尾矩(tail moment,TM，尾部DNA%×尾長)以及Olive尾矩(Olive tail moment,OTM，尾部DNA%×尾矩長)，并計算彗星形成率(%)[
1.3 統計學方法
采用SPSS 21.0統計學軟件進行統計學處理，組間均數比較采用ANOVA檢驗。對細胞死亡率和彗星形成率之間的關系采用線性相關分析。非正態數據采用Kruskal-Wallis檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。
2 結果
2.1 細胞生存率
nsEP處理后0~8 h，A2780和C30細胞的生存率逐漸降低，8~24 h逐漸上升，8 h時細胞生存率最低。C30細胞的生存率明顯高于A2780細胞(P＜0.05)，如圖 1所示。
圖1
nsEP處理后A2780和C30在不同時間點的生存率*P＜0.05，與A2780細胞株相比
Figure1.
Cell viability of A2780 and C30 vary with time after nsEP *P＜0.05, vs. A2780
2.2 細胞死亡率與彗星形成率
單細胞凝膠電泳結果，如圖 2所示，可明顯看出A2780細胞在4、8、12和24 h都表觀出彗星圖像的尾長比C30細胞長。A2780細胞的死亡率與彗星形成率在4~24 h均高于C30細胞，如圖 3所示；A2780和C30細胞的死亡率均與彗星形成率呈正相關(r=0.997，P＜0.05；r=0.998，P＜0.05)。
圖2
nsEP處理后A2780和C30在不同時間點的單細胞凝膠電泳結果
Figure2.
Comet assay figure of A2780 and C30 vary with time
圖3
nsEP處理后A2780和C30在不同時間點的細胞死亡率與彗星形成率*P＜0.05，與A2780細胞株相比
Figure3.
Percentage of dead cells and comet-formed of A2780 and C30 in 4, 8, 12 and 24 h *P＜0.05, vs. A2780
2.3 TL、TM和OTM
A2780和C30細胞的TL、TM、OTM及其75 th百分位數均隨時間變化而變化，最大值出現于8 h，如圖 4所示。A2780的TL、TM和OTM均高于C30(P＜0.05)。秩相關分析顯示C30的TL、TM、OTM(r=0.4，r=0.2，r=0.8，P＞0.05)以及A2780的TL、TM、OTM(r=0.8,r=0.4,r=0.4,P＞0.05)與其彗星形成率無相關性。
圖4
A2780和C30細胞的TL、TM、OTM均數及其75th百分位數
Figure4.
Means and 75th percentiles of TL, TM and OTM in A2780 and C30
3 討論
本文比較了nsEP對鉑敏感和鉑耐藥人卵巢癌細胞DNA損傷的時間效應。彗星形成率可以用來評估DNA的損傷程度[9]。研究發現，nsEP處理后，A2780和C30細胞的DNA損傷率和細胞死亡率均先升高，后降低，彗星形成率與細胞死亡率成正相關，DNA損傷率高于細胞死亡率。提示部分出現DNA損傷的細胞并未死亡，可能是由于損傷程度較輕，未達到死亡“閾值”，細胞通過啟動修復功能而存活[10]。因此，為提高抑瘤效應，應在修復完成前重復給予nsEP或其他治療，降低修復細胞的比例。本研究結果提示僅有部分細胞的死亡率可歸結于DNA損傷，其他細胞死亡機制需進一步研究。以往研究認為，DNA損傷可能并不是nsEP直接作用的結果，而是一個由損傷亞細胞結構變化所引起的后續生物效應[11]。我們前期研究發現，nsEP可引起細核質內高電壓，提示DNA斷裂可直接由電效應引起[4]。
本研究發現，相同的脈沖條件處理后，A2780細胞的死亡率及彗星形成率均明顯高于C30細胞，表明nsEP對鉑敏感細胞的損傷高于鉑耐藥細胞。因此，對鉑耐藥細胞應根據其絕對和相對尺寸，調整場強、脈寬和脈沖作用時間，從而實現有效的亞細胞結構損傷。兩株細胞的TL、TM 和 OTM值與相應的彗星形成率均無相關性，說明脈沖所致DNA損傷具有異質性，在治療性應用中應予以考慮。
綜上所述，nsEP對鉑敏感和鉑耐藥卵巢癌細胞的DNA損傷具有時間效應，nsEP對鉑敏感細胞株的損傷高于鉑耐藥細胞株；nsEP所致細胞死亡與DNA損傷有關。
引言
卵巢癌是女性生殖器常見惡性腫瘤之一，盡管已有多種治療應用于臨床，但其5年生存率仍僅為45%[1]。卵巢癌的化療是一種聯合化療，以鉑類為基礎，其中順鉑是比較有效且廣泛應用于臨床的一線藥物，但長期化療患者及卵巢癌復發患者的耐藥情況十分普遍，故療效不盡如人意[2]。因此，尋求新的、非藥物的治療方案甚有必要。Beebe等[3]發現單獨使用脈沖電場可致腫瘤細胞死亡。根據脈沖電場參數(強度或脈寬)的不同，可產生不同的生物效應。微秒(μs)強度的電脈沖可產生電穿孔效應(electroporation)；納秒(ns)強度的電脈沖對細胞膜的影響極小而能夠對細胞核產生較大影響，從而有效抑制腫瘤的生長。理論計算表明納秒電脈沖(nanosecond electric pulses,nsEP)可跨膜影響細胞內結構[4]。nsEP作為一種不需要藥物的純電場治療，且無熱消融，有望成為腫瘤治療的一種新型手段[5]。為進一步研究卵巢癌順鉑耐藥細胞的治療，本文選擇人卵巢癌鉑敏感細胞株A2780和人卵巢癌鉑耐藥細胞株C30作為研究對象，旨在通過研究nsEP對人卵巢癌鉑敏感和鉑耐藥細胞株DNA損傷的時間效應，探討nsEP引起的DNA損傷與細胞死亡之間的相關性。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 試劑RPMI
1640培養基(Hyclone，美國)，胎牛血清(四季青，中國)，胰蛋白酶(Hyclone，美國)，DAPI(Biotium，美國)，順鉑注射液(云南個舊生物藥業有限公司，中國)，CCK-8試劑盒(同仁，日本)，低熔點瓊脂糖(Promega，美國)，正常熔點瓊脂糖(TIANGEN，中國)，TritonX-100(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，中國)。
1.1.2 儀器
納秒脈沖電源(本實驗室自主研制)[4]，CO2細胞培養箱、全波長酶標儀(Thermo Scientific，美國)，電泳儀(BIO-RAD，美國)，熒光顯微鏡(Nikon Ti-E，日本)。
1.1.3 細胞系
人卵巢癌鉑敏感細胞株A2780購于中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC)，鉑耐藥株C30為重慶醫科大學第二附屬醫院婦產科重點實驗室保存。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
A2780和C30細胞以含體積分數為10%胎牛血清，5%雙抗(100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素)的RPMI 1640培養基，于37 ℃、 5% CO2培養條件下培養，每2~3 d換液，并觀察其生長狀態。C30細胞培養基中加入9 μg/mL順鉑，實驗前48 h更換為無藥培養基。
1.2.2 nsEP處理
取對數生長期的細胞制備密度為5×105個/mL的單細胞懸液，取1 mL細胞于24孔板中，調整電極間距離為1 cm，電壓6 kV(即場強6 kV/cm)，脈寬為24 ns的脈沖電場處理60 s。假處理組細胞給予假脈沖處理。
1.2.3 CCK-8法檢測細胞死亡率
nsEP處理后繼續培養細胞于0、4、8、12和24 h用CCK-8試劑盒測定細胞活性，并計算細胞死亡率[6]。每個時間點均設置有實驗組(nsEP處理后)、假處理組(nsEP假處理)和空白組(不含細胞，僅加入100 μL實驗用培養基)。具體步驟：①將上述nsEP處理后的細胞調整密度為3.5×105個/mL的單細胞懸液，接種于96孔板中，設置3個復孔；②在相同時間點的96孔板每孔中加入CCK-8試劑10 μL，包括空白組；③將孔板中的細胞放置于37 ℃細胞培養箱中繼續孵育2 h后，用全波長酶標儀于450 nm測定吸光度(A)。
細胞存活率(%)=[(A實驗孔－A空白孔)/(A對照孔－A空白孔)]×100%。
細胞死亡率(%) =1－細胞存活率(%)
1.2.4 單細胞凝膠電泳實驗
于nsEP處理后4、8、12、24 h，參照Singh等[7]描述的方法行單細胞凝膠電泳。具體步驟如下：第一層膠的制備：于自制的光面載玻片上滴加150 μL 1％的正常熔點瓊脂糖，加蓋蓋玻片。4 ℃固化20 min。第二層膠的制備：輕輕揭去蓋玻片，在第一層膠上滴加1∶5(細胞∶低熔點瓊脂糖)比例配制的含有8×104個細胞的75 μL低熔點瓊脂糖，加蓋蓋玻片，4 ℃固化20 min。裂解：輕輕揭去蓋玻片，將制好的凝膠玻片浸入冰冷的堿性(pH 10.0)裂解液中(臨用前加1％ Triton X-100)，4 ℃裂解2 h。解旋：取出凝膠玻片，PBS漂洗3次后置于水平電泳槽內，加入pH 13的堿性電泳緩沖液(高于玻片2~3 mm)，避光放置20 min。電泳：設置電壓25 V，電流300 mA，電泳20 min。漂洗：pH 7.5的Tris-HCl漂洗3次，每次5 min，室溫晾干。染色：膠上滴加濃度為5 μg/mL DAPI染色15 min，雙蒸水漂洗3次，每次5 min，室溫晾干。圖像采集：采用倒置熒光顯微鏡觀察、攝像。每組至少采集100個細胞作彗星分析。
單細胞凝膠電泳后得到的彗星圖像用CASP(http://casplab.com)軟件分析，測量尾長(tail length,TL)、尾矩(tail moment,TM，尾部DNA%×尾長)以及Olive尾矩(Olive tail moment,OTM，尾部DNA%×尾矩長)，并計算彗星形成率(%)[
1.3 統計學方法
采用SPSS 21.0統計學軟件進行統計學處理，組間均數比較采用ANOVA檢驗。對細胞死亡率和彗星形成率之間的關系采用線性相關分析。非正態數據采用Kruskal-Wallis檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。
2 結果
2.1 細胞生存率
nsEP處理后0~8 h，A2780和C30細胞的生存率逐漸降低，8~24 h逐漸上升，8 h時細胞生存率最低。C30細胞的生存率明顯高于A2780細胞(P＜0.05)，如圖 1所示。
圖1
nsEP處理后A2780和C30在不同時間點的生存率*P＜0.05，與A2780細胞株相比
Figure1.
Cell viability of A2780 and C30 vary with time after nsEP *P＜0.05, vs. A2780
2.2 細胞死亡率與彗星形成率
單細胞凝膠電泳結果，如圖 2所示，可明顯看出A2780細胞在4、8、12和24 h都表觀出彗星圖像的尾長比C30細胞長。A2780細胞的死亡率與彗星形成率在4~24 h均高于C30細胞，如圖 3所示；A2780和C30細胞的死亡率均與彗星形成率呈正相關(r=0.997，P＜0.05；r=0.998，P＜0.05)。
圖2
nsEP處理后A2780和C30在不同時間點的單細胞凝膠電泳結果
Figure2.
Comet assay figure of A2780 and C30 vary with time
圖3
nsEP處理后A2780和C30在不同時間點的細胞死亡率與彗星形成率*P＜0.05，與A2780細胞株相比
Figure3.
Percentage of dead cells and comet-formed of A2780 and C30 in 4, 8, 12 and 24 h *P＜0.05, vs. A2780
2.3 TL、TM和OTM
A2780和C30細胞的TL、TM、OTM及其75 th百分位數均隨時間變化而變化，最大值出現于8 h，如圖 4所示。A2780的TL、TM和OTM均高于C30(P＜0.05)。秩相關分析顯示C30的TL、TM、OTM(r=0.4，r=0.2，r=0.8，P＞0.05)以及A2780的TL、TM、OTM(r=0.8,r=0.4,r=0.4,P＞0.05)與其彗星形成率無相關性。
圖4
A2780和C30細胞的TL、TM、OTM均數及其75th百分位數
Figure4.
Means and 75th percentiles of TL, TM and OTM in A2780 and C30
3 討論
本文比較了nsEP對鉑敏感和鉑耐藥人卵巢癌細胞DNA損傷的時間效應。彗星形成率可以用來評估DNA的損傷程度[9]。研究發現，nsEP處理后，A2780和C30細胞的DNA損傷率和細胞死亡率均先升高，后降低，彗星形成率與細胞死亡率成正相關，DNA損傷率高于細胞死亡率。提示部分出現DNA損傷的細胞并未死亡，可能是由于損傷程度較輕，未達到死亡“閾值”，細胞通過啟動修復功能而存活[10]。因此，為提高抑瘤效應，應在修復完成前重復給予nsEP或其他治療，降低修復細胞的比例。本研究結果提示僅有部分細胞的死亡率可歸結于DNA損傷，其他細胞死亡機制需進一步研究。以往研究認為，DNA損傷可能并不是nsEP直接作用的結果，而是一個由損傷亞細胞結構變化所引起的后續生物效應[11]。我們前期研究發現，nsEP可引起細核質內高電壓，提示DNA斷裂可直接由電效應引起[4]。
本研究發現，相同的脈沖條件處理后，A2780細胞的死亡率及彗星形成率均明顯高于C30細胞，表明nsEP對鉑敏感細胞的損傷高于鉑耐藥細胞。因此，對鉑耐藥細胞應根據其絕對和相對尺寸，調整場強、脈寬和脈沖作用時間，從而實現有效的亞細胞結構損傷。兩株細胞的TL、TM 和 OTM值與相應的彗星形成率均無相關性，說明脈沖所致DNA損傷具有異質性，在治療性應用中應予以考慮。
綜上所述，nsEP對鉑敏感和鉑耐藥卵巢癌細胞的DNA損傷具有時間效應，nsEP對鉑敏感細胞株的損傷高于鉑耐藥細胞株；nsEP所致細胞死亡與DNA損傷有關。
