尿激酶型纖溶酶原激活物受體(uPAR)是細胞外膜蛋白。uPAR不僅在惡性腫瘤細胞中表達明顯增高,同時在腫瘤間質中也表達增強。本研究將uPAR作為分子靶點,以人類氨基末端片段(hATF)作為靶向原件標記超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIO),利用該靶向探針在uPAR中度表達的HT29荷瘤裸鼠體內驗證該探針的影像效能。體外通過流式細胞術檢測細胞uPAR表達量,普魯士藍染色以及細胞MRI掃描檢測探針的特異性,MRI掃描荷瘤裸鼠檢測探針體內的成像效能,并通過病理學檢查顯示探針在腫瘤內分布情況。結果顯示,不同腫瘤細胞具有不同uPAR表達特性,在篩選的細胞系中,Hela為uPAR強陽性細胞,HT29為uPAR中度陽性細胞,Lovo則為uPAR陰性細胞。體外試驗利用強表達uPAR的Hela細胞與hATF-SPIO探針共同孵育,通過普魯士藍染色及MRI細胞掃描發現,hATF-SPIO能夠特異性結合Hela細胞且使得其T2WI信號明顯減低;而對照組Lovo細胞MRI信號值在探針孵育前后未見明顯變化,普魯士藍染色也未見hATF-SPIO在Lovo細胞中的滯留。MRI動物掃描顯示hATF-SPIO探針能夠隨著血流達到HT29移植瘤且使得HT29腫瘤在T2加權相上較Lovo移植瘤信號降低,在探針注入后24 h,兩者信號值有明顯差異;隨后腫瘤組織的普魯士藍染色觀察顯示hATF-SPIO探針在HT29移植瘤內存留。綜上所述,通過實驗證明hATF-SPIO不僅在體外能夠靶向結合uPAR表達的腫瘤細胞,并能夠在體內靶向顯影uPAR中度表達的結腸腫瘤。
引用本文： 張舒, 王磊, 陳露, 許華燕, 吳強, 畢鋒, 郜發寶, 許峰. 標記hATF的超順磁性氧化鐵納米顆粒探針在結腸癌腫瘤模型中的分子影像. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(5): 1067-1074. doi: 10.7507/1001-5515.20150189 復制
引言
結直腸癌是消化道惡性腫瘤的一種，發病率及病死率在所有惡性腫瘤中排名第三。然而，研究表明非遠端轉移的結直腸癌患者5年生存率可達70%～90%[1]，因此有效的早期篩查能夠使結直腸癌患者生存獲益。眾多成像系統中，核磁共振成像(magnetic resonance image，MRI)具有良好的組織分辨率及解析率，能夠探測深部組織病變，同時沒有潛在的放射性損傷，因此廣泛用于腫瘤檢測。近年來，隨著納米技術的發展，很多新型納米材料已用于分子影像，使分子影像技術的特異性及靈敏度均得以提高[2-3]。以MRI作為成像系統，采用超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide particle，SPIO)的靶向探針已在多種腫瘤診斷和治療中得到應用[4-6]。這些靶向腫瘤的SPIO作為MRI的T2造影劑不僅能夠提高MRI檢測微小病變及轉移灶的靈敏度，而且還能作為載物平臺，攜帶藥物或者核酸進入目的組織，提高療效[7]。然而，這些SPIO用于腫瘤靶向顯影時也有諸多不足之處，主要問題在于：①腫瘤血管的無序性使得探針在腫瘤內分布不均勻；②由于腫瘤間質的阻礙，探針穿過腫瘤新生血管間隙后聚集在腫瘤新生血管周圍，很難通過腫瘤間質直接作用于腫瘤實質細胞。這些留存于間質中卻未能特異性結合在相應受體上的探針，將被單核巨噬系統吞噬并清除，導致檢測效能降低。因此，若選取能特異表達在腫瘤細胞表面及間質細胞的生物學標記作為靶點，則能夠增加靶向SPIO在腫瘤組織中的存留，從而在一定程度上解決這些問題。
尿激酶型纖溶酶原激活物受體(urokinase plasminogen activator receptor,uPAR)是一種與腫瘤增殖、轉移及血管生成相關的膜蛋白。uPAR不僅表達于腫瘤細胞表面，還表達在腫瘤間質的成纖維細胞、巨噬細胞和內皮細胞膜表面[8-10]。近年來，將uPAR作為靶點的正電子發射計算機斷層顯像/計算機斷層成像(positron emission tomography/computed tomography,PET/CT)以及MRI造影劑已在胰腺癌、膠質瘤、乳腺癌和前列腺癌中顯影成功[11-14]。病理研究顯示，結直腸癌腫瘤組織uPAR表達陽性，且在腫瘤微浸潤間質部分表達也明顯增高[15]，并提示不良預后。因此，本研究利用uPAR靶向的MRI探針作為顯影劑，通過建立腫瘤裸鼠模型，檢測該靶向探針在uPAR中度表達的結腸癌模型中的顯影特性。
1 材料與方法
1.1 材料
人宮頸癌Hela細胞、人結腸癌HT29細胞和Lovo細胞均獲贈于四川大學臨床醫學院信號傳導實驗室；實驗用裸鼠購自四川達碩實驗動物公司；胎牛血清購自Gibco公司；青霉素/鏈霉素雙抗、DMEM培養基和胰蛋白酶購自Hyclone公司；Matrigel基質膜基質購自B&D公司；流式細胞術uPAR單克隆抗體和小鼠IgG1同型對照(isotype control，ISO)購自eBioscience公司；普魯士藍染色試劑盒購自Solarbio公司；2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽(WST/CCK-8)購自同仁公司；異氟烷購自瑞沃德公司。
1.2 細胞系以及動物模型
Hela宮頸癌細胞系、HT29人結腸癌細胞系和Lovo人結腸癌細胞系均采用含100 mL/L胎牛血清、10 mL/L青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養基，放置于37 ℃、50 mL/L濃度CO2孵箱中培養。在體外試驗、探針靶向特異性實驗中，由于HT29抱團生長，不利于實驗的觀察，因此將Hela細胞作為陽性對照。所有動物實驗均為4~6周齡雌性裸鼠。取對數生長期的腫瘤細胞，2.5 g/L胰酶消化離心收集細胞，PBS配制細胞懸液且調整活細胞濃度2×107個/mL，并加入等體積的高濃度Matrigel，HT29細胞以及Lovo細胞均按照1×106個/只分別接種于裸鼠右下肢及左下肢皮下，腫瘤最大直徑達到8 mm時，進行MRI掃描。腫瘤直徑通過游標卡尺測量。
1.3 hATF-SPIO探針合成
人類氨基末端片段(human amino-terminal fragment，hATF)包含135 個氨基酸是uPAR天然受體尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator,uPA)的氨基酸末端片段，hATF包含的7個氨基酸構成的Ω環，是與uPAR高度親和的二級結構[16-18]，其解離常數值(Kd)低于1 nmol/L，并且能與uPA競爭結合腫瘤及內皮細胞上的uPAR，同時抑制腫瘤生長及血管的生成[19]。hATF-SPIO探針獲贈于Emory大學Lily Y教授實驗室，合成方法參照文獻[11]。10 nm鐵磁性核心包裹分子量為2 000的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)，再與重組蛋白hATF連接，形成水合粒徑約30 nm的靶向探針hATF-SPIO。
1.4 流式細胞術檢測uPAR的表達
20 g/L EDTA溶液消化貼壁腫瘤細胞，計數并收集1×106個活細胞，PBS溶液清洗3次，棄上清，加入300 μL PBS重懸細胞。將細胞懸液均分為3組，分別加入5 μL APC標記小鼠抗人uPAR抗體(eBioscience)、5 μL APC標記小鼠IgG1κ ISO或等量的PBS溶液，4 ℃避光孵育30 min。每組細胞加入適量PBS清洗1次并棄上清，300 μL PBS溶液重懸細胞，上機檢測(NAVIOS,BECKMAN COULTER)，并根據ISO熒光強度設置檢測閾值，每種細胞系至少重復檢測3次。
1.5 CCK-8 實驗檢測細胞存活率
取對數生長期腫瘤細胞接種于96孔培養板，2 000個/孔，輕搖混勻，置于37 ℃、50 mL/L濃度CO2孵箱中培養24 h。將35 μg/mL和70 μg/mL含Fe量的hATF-SPIO探針加入到對應試驗孔中，與細胞共同孵育，于不同時間點(4、24、48 h)，進行CCK-8試驗。CCK-8原液與培養液按1∶10比例配制預混液，每孔加100 μL混液，避光繼續孵育2～4 h。Micro-ELISA儀讀取吸光度，490 nm波長下測定各孔光吸收值A，計算細胞存活率：細胞存活率(％)＝(A加藥－A空白)/(A對照－A空白)×100%。
1.6 MRI掃描
1.6.1 細胞實驗
計數接種1×106個Lovo細胞和Hela細胞培養貼壁，分別與30 μg/mL和15 μg/mL含Fe量的hATF-SPIO探針共同孵育24 h，收集細胞，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗1次，棄上清，重懸于10 mg/mL瓊脂糖凝膠中，待凝膠固定后行MRI掃描。
1.6.2 動物實驗
荷瘤裸鼠固定后，采用異氟烷/氧氣(V/V，1∶1)氣體麻醉，待呼吸頻率穩定于20~30次/min時，鼠尾靜脈以400 pmol/只(即每只給予0.4 mg含Fe量的hATF-SPIO探針)濃度注入hATF-SPIO探針。每只實驗裸鼠于注入探針前及注入探針后12、24和48 h，7T MRI(Bruker Biospec)掃描。掃描采用T2 RARE序列：TR=3 000 ms;TE=45 ms;Matrix=256×256;FOV=30 mm;層厚=1 mm。SPIO探針為MRI的T2對比劑，因此選用T2WI觀測探針在體內的分析信號強度(signal intensity，SI)隨時間的變化。感興趣區(region of interest,ROI)選擇：ROI選擇在腫瘤最大層面，沿腫瘤邊界包繞整個腫瘤切面，且排除壞死區域，每層至少包含50 個像素[20]。
1.7 病理學檢測
1.7.1 細胞實驗
Hela和Lovo細胞以5 000個/孔接種于24孔板，以30 μg/mL含Fe量的hATF-SPIO探針共同孵育24 h后行普魯士藍染色。
1.7.2 動物實驗
所有荷瘤裸鼠MRI掃描后，頸椎脫臼法處死，分離腫瘤組織，以40 g/L多聚甲醛固定和石蠟包埋切片。HE染色觀察腫瘤情況以及普魯士藍染色檢測腫瘤組織中SPIO的分布。
1.8 統計學方法
本實驗數據均為重復3次以上的結果，計量結果采用均數±標準差表示，用SPSS 13.0軟件處理；兩組間均數比較采用t檢驗，多組間均數比較采用方差分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 荷瘤裸鼠模型的建立
荷瘤裸鼠寄養于四川大學華西臨床醫學院科技園動物實驗中心SPF級裸鼠飼養間。5只裸鼠接種腫瘤后均存活，2種腫瘤細胞系成瘤率為100%。
2.2 流式細胞術檢測
我們總共篩查了3種結腸癌細胞系，如圖 1所示，檢測了在不同細胞系中uPAR表達陽性的細胞占細胞總量的百分比，HT29細胞uPAR表達陽性率為21.89％±4.96%，與Lovo細胞表達率(0.055%±0.055%)比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。作為體外實驗的陽性對照細胞Hela，其uPAR表達陽性率為95.43％±0.726%，與Lovo細胞比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。因此，流式細胞術檢測顯示，Hela為uPAR強陽性表達細胞，Lovo為uPAR表達陰性細胞，而HT29為uPAR中度表達的細胞系，與之前文獻相符[21]。
圖1
流式細胞術檢測不同結腸癌細胞uPAR表達量
Figure1.
uPAR expression of different colon cancer cells measured with Flow cytometry
2.3 探針靶向性分析
35 μg/mL以及70 μg/mL含Fe濃度的hATF-SPIO分別與不同腫瘤細胞共同孵育4、24及48 h，細胞存活率均高于100%，如圖 2所示，且各組間差異不具有統計學意義(P＞0.05)。為了排除血清對探針結合受體的干擾，我們采用無血清培養基稀釋探針并與細胞孵育24 h。MRI顯示Lovo細胞在不同濃度都可查見信號值略低于空白對照組，但不同濃度之間并無明顯差異，Hela細胞在含Fe濃度為15 μg/mL的探針作用下時查見其MRI信號減低，隨著探針濃度的增加，信號降低更明顯，如圖 3所示。為了驗證hATF-SPIO在細胞內的分布，通過普魯士藍染色顯示30 μg/mL含Fe量的hATF-SPIO能靶向結合uPAR表達強陽性的Hela細胞，并且進入到Hela細胞胞質中，而uPAR表達陰性的Lovo細胞內并未查見鐵染顆粒，如圖 4所示。
圖2
CCK-8檢測不同濃度探針作用下腫瘤細胞存活率
Figure2.
Survival rate tests of tumor cells measured with CCK-8 incubated with different hATF-SPIO
圖3
不同腫瘤細胞hATF-SPIO孵育后的MRI檢測
Figure3.
MRI for different tumor cells incubated with hATF-SPIO
圖4
不同腫瘤細胞與30 μg/mL含Fe量hATF-SPIO孵育后普魯士藍檢測
Figure4.
Prussian blue staining for different tumor cells incubated with hATF-SPIO
2.4 MRI動物掃描
在注射探針之前，HT29腫瘤與Lovo腫瘤的SI值沒有明顯差異(P＞0.05)。探針注入后，兩種腫瘤SI值均有下降；在12 h與24 h時，HT29腫瘤的SI值較Lovo腫瘤的SI值更低，且差異均有統計學意義(P＜0.05)。在48 h時，兩種腫瘤SI值沒有明顯差異(P＞0.05，如表 1所示)。在T2WI圖像上，HT29移植瘤在12 h時出現局部低信號影，且一直持續到48 h，而Lovo移植瘤則沒有變化，如圖 5所示。hATF-SPIO注入裸鼠體內后，由于網狀內皮細胞的攝取，使得肝臟和脾臟在T2WI上的信號在30 min內出現明顯減低，持續至48 h，如圖 6所示。
圖5
hATF-SPIO注射后T2 RARE序列不同結腸癌組織MR圖像
紅色虛線：HT29腫瘤；綠色虛線：Lovo腫瘤
Figure5. T2 RARE weighted image of colon xenografts after injection of hATF-SPIOred dotted line: HT29 xenograft; green dotted line: Lovo xenograft
圖6
hATF-SPIO注射后T2 RARE序列脾臟MR圖像
黃色虛線：脾臟；藍色虛線：肝臟
Figure6. T2 RARE weighted image of spleen after injection of hATF-SPIOyellow dotted line: spleen; blue dotted line: liver
表1
T2WI序列不同腫瘤各時間點信號強度變化
Table1.
Changes in tumor signal intensity after probe injections in T2WI sequence
2.5 病理學分析
HE染色可見HT29皮下移植瘤呈巢團樣，且瘤體組織周圍被腫瘤間質包裹，以成纖維細胞為主，整個腫瘤組織內未見壞死區域；Lovo皮下移植瘤查見大量腫瘤實質細胞，瘤體內間質較HT29移植瘤更少，整個瘤體也未見壞死區域，但局部可見少量充血。通過普魯士藍染色，可以明確SPIO在腫瘤的分布情況。在uPAR表達陰性的Lovo皮下移植瘤內未查見SPIO的分布，HT29皮下移植瘤內可見鐵染色陽性，如圖 7所示。
圖7
不同腫瘤組織的普魯士藍及HE染色(200×)
Figure7.
HE stain and Prussian blue stain for tumor sections(200×)
3 討論
非靶向的SPIO作為血池造影劑顯影腫瘤組織時，由于腫瘤新生血管內皮的不連續性，使得血池中的SPIO能夠通過血管內皮間隙進入到腫瘤組織中，腫瘤組織缺乏淋巴回流系統，因此SPIO能夠在腫瘤中停留，此被動靶向的過程稱為高通透性和滯留效應(enhance permeability and retention effect,EPR)[22]。EPR效應是探針到達腫瘤局部的必要條件，然而腫瘤新生血管的無序性以及腫瘤間質的阻礙，不僅會影響SPIO的滲入，同時干擾了靶向SPIO與受體的結合，導致未能結合SPIO，很快被巨噬細胞吞噬清除，從而降低了顯影效能。連接靶向元件的SPIO靶向探針通過特異性結合特定受體，避免了單核巨噬細胞的清除作用，延長了在腫瘤局部的停留時間，在一定程度上解決了上述問題。目前文獻報道運用SPIO靶向顯影惡性腫瘤的分子靶點，如Her2、MUC1等，并不在腫瘤間質內及腫瘤新生血管表達[23-24]。這些受體在腫瘤局部表達量有限，導致靶向探針不能大量轉運到腫瘤實質內，未結合的SPIO又很快被清除。因此，為了優化靶向SPIO在特定腫瘤組織中的濃聚，增強其被網狀內皮系統吞噬和清除的抗性，增加信噪比，我們選用了uPAR作為分子靶點。uPAR不僅表達于腫瘤細胞，而且腫瘤間質細胞中的表達也明顯增高，并能夠很好地顯示腫瘤浸潤的部分以及腫瘤邊緣[14]。此外，uPAR的表達隨周圍環境的改變而不同。Krishnamachary等[25]以及Lester等[26]發現缺氧條件培養下結腸癌細胞系及乳腺癌細胞系uPAR表達會明顯增高。因此對于一些很小的腫瘤或者腫瘤乏氧區域，即使腫瘤實質內缺少腫瘤新生血管，依賴uPAR的靶向探針也能很好地顯示腫瘤[10]。
前期研究發現SPIO高濃度作用于細胞時，會被細胞溶酶體降解，釋放出鐵離子，鐵離子與細胞內的過氧化氫作用產生活性氧物質(reactive oxide species,ROS)，后者破壞細胞膜完整性或者損傷DNA，從而使細胞生存率下降[27-28]。本研究細胞生存實驗顯示30 μg/mL及70 μg/mL hATF-SPIO探針與細胞共同孵育至72 h，細胞存活率均大于100 %，以此證實探針在使用濃度下對細胞生存幾乎無影響。其可能原因為PEG包被的SPIO在溶酶體內降解時，PEG會阻止鐵離子的釋放，減少了細胞內鐵離子濃度，從而減少了由于鐵離子與過氧化氫作用產生的ROS[29]。當hATF-SPIO與細胞孵育后，普魯士藍染色顯示相對于Lovo細胞，Hela細胞中可查見明顯的鐵染顆粒；MRI掃描顯示Hela細胞較Lovo細胞信號值明顯降低，由此證實探針不僅能夠結合細胞膜上uPAR并由受體介導進入細胞質，而且能有效改變弛豫時間，引起T2WI上信號改變。探針的靶向性與探針在體內作用時鑒別診斷的能力關系密切，探針靶向性越好，體內在靶向部位結合和聚集的能力就越高。
我們通過流式細胞術檢測證實HT29結腸癌細胞系是一種中度表達uPAR的腺癌細胞，與之前報道的文獻結果相符[21-30]，前期文獻利用MRI靶向uPAR顯影均采用uPAR強陽性腫瘤[11-12]，對于uPAR表達量相對較低的腫瘤并未進行深入研究。中度表達uPAR的HT29移植瘤只在PET研究中成功顯影[21, 30]。本研究顯示，當hATF-SPIO作用于體內時，探針注入12 h及24 h后，HT29腫瘤信號值較Lovo移植瘤明顯降低，差異具有統計學意義，T2WI相上也觀察到HT29移植瘤從探針注入后12 h到48 h呈明顯暗信號。與PERSSON等[21]采用64Cu-DOTA-AE105顯影HT29腫瘤(靶向核素信號在1 h時明顯增高，信號增強在4.5 h時達到平臺期，且持續至22 h)相比較，hATF-SPIO探針靶向成像作用時間更長。利用核素成像系統對HT29移植瘤分子影像研究中，研究者利用了線性短肽AE105作為靶向元件，其優勢在于線性短肽分子量小，易于大量合成[31]，但是AE105與uPAR結合的能力以及與uPA競爭結合uPAR的能力均不及hATF，hATF與uPAR的離解常數低于1 nmol/L[19]。因此hATF一方面能夠與天然配體uPA競爭結合細胞表面的uPAR受體，避免了uPA的占位效應，增加探針結合uPAR的概率;另一方面，hATF與uPAR結合后穩定，不易從細胞膜上脫離，增加了探針與受體結合后的穩定性。hATF-SPIO還可以通過uPAR受體介導，進入到腫瘤細胞或間質細胞內，避免探針被巨噬細胞吞噬清除，以此保證了HT29腫瘤局部探針的聚集。病理學驗證表明，hATF-SPIO能夠順利進入HT29腫瘤組織，并在組織內存留，與影像結果一致。因此，我們利用hATF-SPIO成功顯影了uPAR中度表達的HT29結腸癌移植瘤，且觀察到利用該探針的有效靶向成像時間為探針注入后12～24 h。
由于SPIO是T2對比劑，我們的研究采用了T2 RARE序列進行MRI掃描，采用該序列即使在局部SPIO較低濃度狀態下，也能發生圖像信號的變化，即具有成像檢測的敏感性。但SPIO在T2加權像上呈負性對比，因此可能會造成信號的丟失或者不能有效區分靶向組織與背景區域；除此之外，T2加權像在不同組織的交界面上易產生“開花效應”(blooming effect)，即在不同組織交界面會產生磁敏感性偽影，使得腫瘤邊界顯示不清，導致定位及感興趣區域勾畫不準確[32]。Robson等[33]和Zhang等[34]利用超短回波時間(ultrashort echo time,UTE)序列，使得SPIO在UTE序列圖像上呈現高信號表現，一方面維持了原有SPIO的檢測靈敏性，另一方面解決了負性對比劑帶來的諸多問題，我們也將類似序列納入后期研究中。
綜上所述，我們利用hATF-SPIO靶向顯影uPAR中度表達的結腸癌模型，一方面進一步驗證了探針的顯影效能，同時為該探針用于不同uPAR表達情況的腫瘤顯影提供了理論依據；一方面提供了探針細胞生物安全性的信息。但是探針體內安全信息仍缺乏，以及成像序列仍存在部分問題，我們將在后期實驗中進一步改善。
引言
結直腸癌是消化道惡性腫瘤的一種，發病率及病死率在所有惡性腫瘤中排名第三。然而，研究表明非遠端轉移的結直腸癌患者5年生存率可達70%～90%[1]，因此有效的早期篩查能夠使結直腸癌患者生存獲益。眾多成像系統中，核磁共振成像(magnetic resonance image，MRI)具有良好的組織分辨率及解析率，能夠探測深部組織病變，同時沒有潛在的放射性損傷，因此廣泛用于腫瘤檢測。近年來，隨著納米技術的發展，很多新型納米材料已用于分子影像，使分子影像技術的特異性及靈敏度均得以提高[2-3]。以MRI作為成像系統，采用超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide particle，SPIO)的靶向探針已在多種腫瘤診斷和治療中得到應用[4-6]。這些靶向腫瘤的SPIO作為MRI的T2造影劑不僅能夠提高MRI檢測微小病變及轉移灶的靈敏度，而且還能作為載物平臺，攜帶藥物或者核酸進入目的組織，提高療效[7]。然而，這些SPIO用于腫瘤靶向顯影時也有諸多不足之處，主要問題在于：①腫瘤血管的無序性使得探針在腫瘤內分布不均勻；②由于腫瘤間質的阻礙，探針穿過腫瘤新生血管間隙后聚集在腫瘤新生血管周圍，很難通過腫瘤間質直接作用于腫瘤實質細胞。這些留存于間質中卻未能特異性結合在相應受體上的探針，將被單核巨噬系統吞噬并清除，導致檢測效能降低。因此，若選取能特異表達在腫瘤細胞表面及間質細胞的生物學標記作為靶點，則能夠增加靶向SPIO在腫瘤組織中的存留，從而在一定程度上解決這些問題。
尿激酶型纖溶酶原激活物受體(urokinase plasminogen activator receptor,uPAR)是一種與腫瘤增殖、轉移及血管生成相關的膜蛋白。uPAR不僅表達于腫瘤細胞表面，還表達在腫瘤間質的成纖維細胞、巨噬細胞和內皮細胞膜表面[8-10]。近年來，將uPAR作為靶點的正電子發射計算機斷層顯像/計算機斷層成像(positron emission tomography/computed tomography,PET/CT)以及MRI造影劑已在胰腺癌、膠質瘤、乳腺癌和前列腺癌中顯影成功[11-14]。病理研究顯示，結直腸癌腫瘤組織uPAR表達陽性，且在腫瘤微浸潤間質部分表達也明顯增高[15]，并提示不良預后。因此，本研究利用uPAR靶向的MRI探針作為顯影劑，通過建立腫瘤裸鼠模型，檢測該靶向探針在uPAR中度表達的結腸癌模型中的顯影特性。
1 材料與方法
1.1 材料
人宮頸癌Hela細胞、人結腸癌HT29細胞和Lovo細胞均獲贈于四川大學臨床醫學院信號傳導實驗室；實驗用裸鼠購自四川達碩實驗動物公司；胎牛血清購自Gibco公司；青霉素/鏈霉素雙抗、DMEM培養基和胰蛋白酶購自Hyclone公司；Matrigel基質膜基質購自B&D公司；流式細胞術uPAR單克隆抗體和小鼠IgG1同型對照(isotype control，ISO)購自eBioscience公司；普魯士藍染色試劑盒購自Solarbio公司；2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽(WST/CCK-8)購自同仁公司；異氟烷購自瑞沃德公司。
1.2 細胞系以及動物模型
Hela宮頸癌細胞系、HT29人結腸癌細胞系和Lovo人結腸癌細胞系均采用含100 mL/L胎牛血清、10 mL/L青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養基，放置于37 ℃、50 mL/L濃度CO2孵箱中培養。在體外試驗、探針靶向特異性實驗中，由于HT29抱團生長，不利于實驗的觀察，因此將Hela細胞作為陽性對照。所有動物實驗均為4~6周齡雌性裸鼠。取對數生長期的腫瘤細胞，2.5 g/L胰酶消化離心收集細胞，PBS配制細胞懸液且調整活細胞濃度2×107個/mL，并加入等體積的高濃度Matrigel，HT29細胞以及Lovo細胞均按照1×106個/只分別接種于裸鼠右下肢及左下肢皮下，腫瘤最大直徑達到8 mm時，進行MRI掃描。腫瘤直徑通過游標卡尺測量。
1.3 hATF-SPIO探針合成
人類氨基末端片段(human amino-terminal fragment，hATF)包含135 個氨基酸是uPAR天然受體尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator,uPA)的氨基酸末端片段，hATF包含的7個氨基酸構成的Ω環，是與uPAR高度親和的二級結構[16-18]，其解離常數值(Kd)低于1 nmol/L，并且能與uPA競爭結合腫瘤及內皮細胞上的uPAR，同時抑制腫瘤生長及血管的生成[19]。hATF-SPIO探針獲贈于Emory大學Lily Y教授實驗室，合成方法參照文獻[11]。10 nm鐵磁性核心包裹分子量為2 000的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)，再與重組蛋白hATF連接，形成水合粒徑約30 nm的靶向探針hATF-SPIO。
1.4 流式細胞術檢測uPAR的表達
20 g/L EDTA溶液消化貼壁腫瘤細胞，計數并收集1×106個活細胞，PBS溶液清洗3次，棄上清，加入300 μL PBS重懸細胞。將細胞懸液均分為3組，分別加入5 μL APC標記小鼠抗人uPAR抗體(eBioscience)、5 μL APC標記小鼠IgG1κ ISO或等量的PBS溶液，4 ℃避光孵育30 min。每組細胞加入適量PBS清洗1次并棄上清，300 μL PBS溶液重懸細胞，上機檢測(NAVIOS,BECKMAN COULTER)，并根據ISO熒光強度設置檢測閾值，每種細胞系至少重復檢測3次。
1.5 CCK-8 實驗檢測細胞存活率
取對數生長期腫瘤細胞接種于96孔培養板，2 000個/孔，輕搖混勻，置于37 ℃、50 mL/L濃度CO2孵箱中培養24 h。將35 μg/mL和70 μg/mL含Fe量的hATF-SPIO探針加入到對應試驗孔中，與細胞共同孵育，于不同時間點(4、24、48 h)，進行CCK-8試驗。CCK-8原液與培養液按1∶10比例配制預混液，每孔加100 μL混液，避光繼續孵育2～4 h。Micro-ELISA儀讀取吸光度，490 nm波長下測定各孔光吸收值A，計算細胞存活率：細胞存活率(％)＝(A加藥－A空白)/(A對照－A空白)×100%。
1.6 MRI掃描
1.6.1 細胞實驗
計數接種1×106個Lovo細胞和Hela細胞培養貼壁，分別與30 μg/mL和15 μg/mL含Fe量的hATF-SPIO探針共同孵育24 h，收集細胞，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗1次，棄上清，重懸于10 mg/mL瓊脂糖凝膠中，待凝膠固定后行MRI掃描。
1.6.2 動物實驗
荷瘤裸鼠固定后，采用異氟烷/氧氣(V/V，1∶1)氣體麻醉，待呼吸頻率穩定于20~30次/min時，鼠尾靜脈以400 pmol/只(即每只給予0.4 mg含Fe量的hATF-SPIO探針)濃度注入hATF-SPIO探針。每只實驗裸鼠于注入探針前及注入探針后12、24和48 h，7T MRI(Bruker Biospec)掃描。掃描采用T2 RARE序列：TR=3 000 ms;TE=45 ms;Matrix=256×256;FOV=30 mm;層厚=1 mm。SPIO探針為MRI的T2對比劑，因此選用T2WI觀測探針在體內的分析信號強度(signal intensity，SI)隨時間的變化。感興趣區(region of interest,ROI)選擇：ROI選擇在腫瘤最大層面，沿腫瘤邊界包繞整個腫瘤切面，且排除壞死區域，每層至少包含50 個像素[20]。
1.7 病理學檢測
1.7.1 細胞實驗
Hela和Lovo細胞以5 000個/孔接種于24孔板，以30 μg/mL含Fe量的hATF-SPIO探針共同孵育24 h后行普魯士藍染色。
1.7.2 動物實驗
所有荷瘤裸鼠MRI掃描后，頸椎脫臼法處死，分離腫瘤組織，以40 g/L多聚甲醛固定和石蠟包埋切片。HE染色觀察腫瘤情況以及普魯士藍染色檢測腫瘤組織中SPIO的分布。
1.8 統計學方法
本實驗數據均為重復3次以上的結果，計量結果采用均數±標準差表示，用SPSS 13.0軟件處理；兩組間均數比較采用t檢驗，多組間均數比較采用方差分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 荷瘤裸鼠模型的建立
荷瘤裸鼠寄養于四川大學華西臨床醫學院科技園動物實驗中心SPF級裸鼠飼養間。5只裸鼠接種腫瘤后均存活，2種腫瘤細胞系成瘤率為100%。
2.2 流式細胞術檢測
我們總共篩查了3種結腸癌細胞系，如圖 1所示，檢測了在不同細胞系中uPAR表達陽性的細胞占細胞總量的百分比，HT29細胞uPAR表達陽性率為21.89％±4.96%，與Lovo細胞表達率(0.055%±0.055%)比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。作為體外實驗的陽性對照細胞Hela，其uPAR表達陽性率為95.43％±0.726%，與Lovo細胞比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。因此，流式細胞術檢測顯示，Hela為uPAR強陽性表達細胞，Lovo為uPAR表達陰性細胞，而HT29為uPAR中度表達的細胞系，與之前文獻相符[21]。
圖1
流式細胞術檢測不同結腸癌細胞uPAR表達量
Figure1.
uPAR expression of different colon cancer cells measured with Flow cytometry
2.3 探針靶向性分析
35 μg/mL以及70 μg/mL含Fe濃度的hATF-SPIO分別與不同腫瘤細胞共同孵育4、24及48 h，細胞存活率均高于100%，如圖 2所示，且各組間差異不具有統計學意義(P＞0.05)。為了排除血清對探針結合受體的干擾，我們采用無血清培養基稀釋探針并與細胞孵育24 h。MRI顯示Lovo細胞在不同濃度都可查見信號值略低于空白對照組，但不同濃度之間并無明顯差異，Hela細胞在含Fe濃度為15 μg/mL的探針作用下時查見其MRI信號減低，隨著探針濃度的增加，信號降低更明顯，如圖 3所示。為了驗證hATF-SPIO在細胞內的分布，通過普魯士藍染色顯示30 μg/mL含Fe量的hATF-SPIO能靶向結合uPAR表達強陽性的Hela細胞，并且進入到Hela細胞胞質中，而uPAR表達陰性的Lovo細胞內并未查見鐵染顆粒，如圖 4所示。
圖2
CCK-8檢測不同濃度探針作用下腫瘤細胞存活率
Figure2.
Survival rate tests of tumor cells measured with CCK-8 incubated with different hATF-SPIO
圖3
不同腫瘤細胞hATF-SPIO孵育后的MRI檢測
Figure3.
MRI for different tumor cells incubated with hATF-SPIO
圖4
不同腫瘤細胞與30 μg/mL含Fe量hATF-SPIO孵育后普魯士藍檢測
Figure4.
Prussian blue staining for different tumor cells incubated with hATF-SPIO
2.4 MRI動物掃描
在注射探針之前，HT29腫瘤與Lovo腫瘤的SI值沒有明顯差異(P＞0.05)。探針注入后，兩種腫瘤SI值均有下降；在12 h與24 h時，HT29腫瘤的SI值較Lovo腫瘤的SI值更低，且差異均有統計學意義(P＜0.05)。在48 h時，兩種腫瘤SI值沒有明顯差異(P＞0.05，如表 1所示)。在T2WI圖像上，HT29移植瘤在12 h時出現局部低信號影，且一直持續到48 h，而Lovo移植瘤則沒有變化，如圖 5所示。hATF-SPIO注入裸鼠體內后，由于網狀內皮細胞的攝取，使得肝臟和脾臟在T2WI上的信號在30 min內出現明顯減低，持續至48 h，如圖 6所示。
圖5
hATF-SPIO注射后T2 RARE序列不同結腸癌組織MR圖像
紅色虛線：HT29腫瘤；綠色虛線：Lovo腫瘤
Figure5. T2 RARE weighted image of colon xenografts after injection of hATF-SPIOred dotted line: HT29 xenograft; green dotted line: Lovo xenograft
圖6
hATF-SPIO注射后T2 RARE序列脾臟MR圖像
黃色虛線：脾臟；藍色虛線：肝臟
Figure6. T2 RARE weighted image of spleen after injection of hATF-SPIOyellow dotted line: spleen; blue dotted line: liver
表1
T2WI序列不同腫瘤各時間點信號強度變化
Table1.
Changes in tumor signal intensity after probe injections in T2WI sequence
2.5 病理學分析
HE染色可見HT29皮下移植瘤呈巢團樣，且瘤體組織周圍被腫瘤間質包裹，以成纖維細胞為主，整個腫瘤組織內未見壞死區域；Lovo皮下移植瘤查見大量腫瘤實質細胞，瘤體內間質較HT29移植瘤更少，整個瘤體也未見壞死區域，但局部可見少量充血。通過普魯士藍染色，可以明確SPIO在腫瘤的分布情況。在uPAR表達陰性的Lovo皮下移植瘤內未查見SPIO的分布，HT29皮下移植瘤內可見鐵染色陽性，如圖 7所示。
圖7
不同腫瘤組織的普魯士藍及HE染色(200×)
Figure7.
HE stain and Prussian blue stain for tumor sections(200×)
3 討論
非靶向的SPIO作為血池造影劑顯影腫瘤組織時，由于腫瘤新生血管內皮的不連續性，使得血池中的SPIO能夠通過血管內皮間隙進入到腫瘤組織中，腫瘤組織缺乏淋巴回流系統，因此SPIO能夠在腫瘤中停留，此被動靶向的過程稱為高通透性和滯留效應(enhance permeability and retention effect,EPR)[22]。EPR效應是探針到達腫瘤局部的必要條件，然而腫瘤新生血管的無序性以及腫瘤間質的阻礙，不僅會影響SPIO的滲入，同時干擾了靶向SPIO與受體的結合，導致未能結合SPIO，很快被巨噬細胞吞噬清除，從而降低了顯影效能。連接靶向元件的SPIO靶向探針通過特異性結合特定受體，避免了單核巨噬細胞的清除作用，延長了在腫瘤局部的停留時間，在一定程度上解決了上述問題。目前文獻報道運用SPIO靶向顯影惡性腫瘤的分子靶點，如Her2、MUC1等，并不在腫瘤間質內及腫瘤新生血管表達[23-24]。這些受體在腫瘤局部表達量有限，導致靶向探針不能大量轉運到腫瘤實質內，未結合的SPIO又很快被清除。因此，為了優化靶向SPIO在特定腫瘤組織中的濃聚，增強其被網狀內皮系統吞噬和清除的抗性，增加信噪比，我們選用了uPAR作為分子靶點。uPAR不僅表達于腫瘤細胞，而且腫瘤間質細胞中的表達也明顯增高，并能夠很好地顯示腫瘤浸潤的部分以及腫瘤邊緣[14]。此外，uPAR的表達隨周圍環境的改變而不同。Krishnamachary等[25]以及Lester等[26]發現缺氧條件培養下結腸癌細胞系及乳腺癌細胞系uPAR表達會明顯增高。因此對于一些很小的腫瘤或者腫瘤乏氧區域，即使腫瘤實質內缺少腫瘤新生血管，依賴uPAR的靶向探針也能很好地顯示腫瘤[10]。
前期研究發現SPIO高濃度作用于細胞時，會被細胞溶酶體降解，釋放出鐵離子，鐵離子與細胞內的過氧化氫作用產生活性氧物質(reactive oxide species,ROS)，后者破壞細胞膜完整性或者損傷DNA，從而使細胞生存率下降[27-28]。本研究細胞生存實驗顯示30 μg/mL及70 μg/mL hATF-SPIO探針與細胞共同孵育至72 h，細胞存活率均大于100 %，以此證實探針在使用濃度下對細胞生存幾乎無影響。其可能原因為PEG包被的SPIO在溶酶體內降解時，PEG會阻止鐵離子的釋放，減少了細胞內鐵離子濃度，從而減少了由于鐵離子與過氧化氫作用產生的ROS[29]。當hATF-SPIO與細胞孵育后，普魯士藍染色顯示相對于Lovo細胞，Hela細胞中可查見明顯的鐵染顆粒；MRI掃描顯示Hela細胞較Lovo細胞信號值明顯降低，由此證實探針不僅能夠結合細胞膜上uPAR并由受體介導進入細胞質，而且能有效改變弛豫時間，引起T2WI上信號改變。探針的靶向性與探針在體內作用時鑒別診斷的能力關系密切，探針靶向性越好，體內在靶向部位結合和聚集的能力就越高。
我們通過流式細胞術檢測證實HT29結腸癌細胞系是一種中度表達uPAR的腺癌細胞，與之前報道的文獻結果相符[21-30]，前期文獻利用MRI靶向uPAR顯影均采用uPAR強陽性腫瘤[11-12]，對于uPAR表達量相對較低的腫瘤并未進行深入研究。中度表達uPAR的HT29移植瘤只在PET研究中成功顯影[21, 30]。本研究顯示，當hATF-SPIO作用于體內時，探針注入12 h及24 h后，HT29腫瘤信號值較Lovo移植瘤明顯降低，差異具有統計學意義，T2WI相上也觀察到HT29移植瘤從探針注入后12 h到48 h呈明顯暗信號。與PERSSON等[21]采用64Cu-DOTA-AE105顯影HT29腫瘤(靶向核素信號在1 h時明顯增高，信號增強在4.5 h時達到平臺期，且持續至22 h)相比較，hATF-SPIO探針靶向成像作用時間更長。利用核素成像系統對HT29移植瘤分子影像研究中，研究者利用了線性短肽AE105作為靶向元件，其優勢在于線性短肽分子量小，易于大量合成[31]，但是AE105與uPAR結合的能力以及與uPA競爭結合uPAR的能力均不及hATF，hATF與uPAR的離解常數低于1 nmol/L[19]。因此hATF一方面能夠與天然配體uPA競爭結合細胞表面的uPAR受體，避免了uPA的占位效應，增加探針結合uPAR的概率;另一方面，hATF與uPAR結合后穩定，不易從細胞膜上脫離，增加了探針與受體結合后的穩定性。hATF-SPIO還可以通過uPAR受體介導，進入到腫瘤細胞或間質細胞內，避免探針被巨噬細胞吞噬清除，以此保證了HT29腫瘤局部探針的聚集。病理學驗證表明，hATF-SPIO能夠順利進入HT29腫瘤組織，并在組織內存留，與影像結果一致。因此，我們利用hATF-SPIO成功顯影了uPAR中度表達的HT29結腸癌移植瘤，且觀察到利用該探針的有效靶向成像時間為探針注入后12～24 h。
由于SPIO是T2對比劑，我們的研究采用了T2 RARE序列進行MRI掃描，采用該序列即使在局部SPIO較低濃度狀態下，也能發生圖像信號的變化，即具有成像檢測的敏感性。但SPIO在T2加權像上呈負性對比，因此可能會造成信號的丟失或者不能有效區分靶向組織與背景區域；除此之外，T2加權像在不同組織的交界面上易產生“開花效應”(blooming effect)，即在不同組織交界面會產生磁敏感性偽影，使得腫瘤邊界顯示不清，導致定位及感興趣區域勾畫不準確[32]。Robson等[33]和Zhang等[34]利用超短回波時間(ultrashort echo time,UTE)序列，使得SPIO在UTE序列圖像上呈現高信號表現，一方面維持了原有SPIO的檢測靈敏性，另一方面解決了負性對比劑帶來的諸多問題，我們也將類似序列納入后期研究中。
綜上所述，我們利用hATF-SPIO靶向顯影uPAR中度表達的結腸癌模型，一方面進一步驗證了探針的顯影效能，同時為該探針用于不同uPAR表達情況的腫瘤顯影提供了理論依據；一方面提供了探針細胞生物安全性的信息。但是探針體內安全信息仍缺乏，以及成像序列仍存在部分問題，我們將在后期實驗中進一步改善。
