本研究旨在探究PTEN誘導激酶1短亞型(PINK1S)在細胞質中激酶活性調節機制。首先,通過免疫共沉淀篩選的方法證明PINK1S能夠和酪蛋白激酶2(CK2)蛋白復合體中的β亞基(CK2β)相互結合,但不與其他兩個催化亞基α1 (CK2α1)和α2 (CK2α2)結合。其次,同時過表達CK2β和PINK1S,利用免疫共沉淀的方法純化PINK1S,將得到的PINK1S用生物素標記的磷酸化蛋白檢測標簽(Phos-tagTM Biotin)檢測其磷酸化水平,發現CK2β能夠促進PINK1S的自我磷酸化。最后,利用RNA干擾技術,建立干擾CK2β的細胞株;在對照組和干擾CK2β的實驗組細胞內表達PINK1S,發現缺少CK2β表達導致PINK1S的磷酸化水平降低。本文研究表明:CK2β作為胞質PINK1S自我磷酸化的輔助亞基,對其活性起到正調節作用。
引用本文： 秦思月, 姜長安. CK2β促進PINK1S自我磷酸化. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(5): 1056-1060. doi: 10.7507/1001-5515.20150187 復制
引言
帕金森氏病是當今三大神經退行性疾病之一，其病因主要是多巴胺神經元的死亡[1]。PTEN誘導激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)是一種線粒體絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是遺傳性帕金森氏病的主要相關蛋白[2]。PINK1長亞型(PINK1 long isoform,PINK1L)會在跨膜電位下降的線粒體外膜上積累，促進損傷的線粒體通過自噬途徑清除[3]。另外，還會產生一種PINK1短亞型(PINK1 short isoform,PINK1S)，這種形式不穩定，由蛋白酶體降解，該亞型對線粒體也有保護作用[4]。據研究顯示，在線粒體功能失衡情況下，PINK1L在線粒體外膜聚集并通過自我磷酸化的方式增強自身活性，從而更有效地促進后續線粒體的自噬進程[5]。兩個PINK1分子之間能夠互相磷酸化，但是PINK1本身并不會主動相互結合，那么它們的相互催化作用必將有其他未知的輔助因子參與。本文旨在研究胞質中PINK1S的自我磷酸化調控機制。
酪蛋白激酶2(Casein kinase 2，CK2)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合體，廣泛分布于細胞中，參與細胞增殖分化調控。它由兩個催化亞基CK2α1和CK2α2，與兩個調節亞基CK2β組合而成[6]。此復合體中CK2β是作為一個中間的銜接亞基有效地連接兩個催化亞基，從而促進CK2對底物的識別和磷酸化[7-8]。另外，前人研究表明CK2β亞基還能在細胞質中游離存在，暗示其還具有其他重要功能。本研究發現，CK2β能夠與PINK1S相互作用，并促進其自我磷酸化從而增強胞質中PINK1S的活性。
1 材料與方法
1.1 材料
質粒提取試劑盒以及DNA膠回收試劑盒購自OMEGA BIO-TEK；限制性內切酶購自NEW England Biolabs；HEK293細胞株購自ATCC；DMEM培養基購自Hyclone；真核表達載體pcDNA3.1(+)購自Invitrogen；細胞培養胎牛血清購自Biowest；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜和蛋白G瓊脂糖凝膠購自Millipore；抗Flag、HA、Myc單克隆抗體均購自Prospect；Phos-tagTM Biotin購自WAKO；生物素結合蛋白偶聯二抗和蛋白酶抑制劑均購自Thermo Scientific；人類基因cDNA購自Addgene；轉染試劑MegaTran1.0購于Origene；其他生化試劑均為國產分析純。
1.2 方法
1.2.1 表達載體的構建
以目的基因cDNA為模板，兩端設計帶有限制性內切酶位點的上下游引物，通過聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)獲得目的基因片段，然后用相對應的兩種限制性內切酶酶切目的基因以及欲使用的帶有HA、Myc、Flag標簽的pcDNA3.1(+)載體。將回收到的片段和載體用T4連接酶于20 ℃連接。連接產物轉化到大腸桿菌感受態細胞DH5α中，42 ℃熱激后涂于相應抗性的LB固體培養基上，37 ℃過夜培養。挑選單菌落擴增培養，提取質粒。質粒用相應限制性內切酶切割鑒定是否連入目的基因，并測序確認。質粒構建中引物序列如表 1所示，由成都擎科梓熙生物技術公司合成。
表1
PCR擴增引物序列
Table1.
Primers of cDNA PCR amplification
1.2.2 細胞培養與目的基因的表達
用DMEM基礎培養基配制HEK293細胞完全培養液(10% 胎牛血清、1% 非必須氨基酸、1% 青霉素和鏈霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺)，細胞培養于37 ℃、5% CO2培養箱。HEK293細胞培養于10 cm細胞培養皿中，胰酶消化細胞，按照24孔板12×104個/孔；6孔板50×104/孔，均勻接種于培養板，12 h以后進行表達載體的轉染。轉染方法均按照轉染試劑MegaTran1.0的使用說明進行。質粒與轉染試劑1∶3的比例，在DMEM培養基環境下轉染4~6 h后換成完全培養液，24 h后進行后續實驗。
1.2.3 免疫共沉淀實驗(Co-Immunoprecipitation，co-IP)
HEK293細胞按標準接種于6孔培養板中，37 ℃培養12 h后轉染表達載體，轉染后培養24 h，使蛋白質充分表達。棄培養液，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗3次，每個孔加入200 μL NP40細胞裂解液(1% NP40、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、1 mmol/L 蛋白酶抑制劑)冰上裂解30 min，將裂解產物收集在EP管中4 ℃，14 000 rpm離心15 min。離心后取上清10 μL為全細胞裂解液樣品，加入十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)上樣緩沖液(2% SDS、40 mmol/L Tris-HCl pH 6.8、2 mmol/L二硫蘇糖醇、4% 甘油、0.01% 溴酚藍)，剩余上清轉移至新的EP管加入2 μg抗Flag或抗HA單克隆抗體，4 ℃旋轉孵育2 h。然后每支樣品加入20 μL 蛋白G瓊脂糖凝膠，繼續于4 ℃旋轉孵育1 h。最后用NP40細胞裂解液漂洗蛋白G瓊脂糖凝膠3次，除去裂解液，加入適量SDS上樣緩沖液。以上蛋白樣品100 ℃煮5 min，用于western blot檢測。
1.2.4 Western blot實驗
蛋白樣品經10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再以濕轉法將凝膠上的蛋白質轉移至PVDF膜上，用含有0.2%吐溫的PBS(phosphate buffer saline and tween 20，PBST)配制5%脫脂奶粉，PVDF膜在牛奶中封閉1 h，然后在塑料膜中孵育一抗4 ℃旋轉過夜。回收一抗，PBST洗3次，室溫搖晃孵育二抗1 h，孵育結束后PBST洗3次，膜烘干。利用Li-Cor Odyssey 紅外激光成像系統檢測蛋白信號。Image J軟件分析蛋白條帶灰度，統計變化量。
1.2.5 CK2β沉默細胞株的建立
利用Invitrogen Block-iT miRNA system RNA干擾技術在HEK293細胞的基礎上建立沉默掉CK2β的細胞株。首先利用Invitrogen Block-iTRNAi Designer設計了CK2β干擾引物-CK2β392。CK2β392上游引物：TGCTGTTCACAGAAGAATTCATTGCCGT TTTGGCCACTGACTGACGGCAATGATCTTCT GTGAA；下游引物：CCTGTTCACAGAAGATCA TTGCCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGGCAATG AATTCTTCTGTGAAC。合成的DNA退火形成雙鏈DNA，克隆到pcDNA3.1(+)-EGFP-mi155載體。該載體能夠產生短發夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)，干擾CK2β表達。載體酶切鑒定正確后，轉染到HEK293細胞株內，篩選得到含有增強綠色熒光蛋白表達的細胞，通過western blot分析CK2 蛋白表達量。另外，轉染pcDNA3.1(+)-EGFP-mi155空載體篩選得到對照細胞株。
1.2.6 Phos-tagTM Biotin檢測細胞內磷酸化蛋白
Phos-tagTM Biotin即生物素標記的磷酸化蛋白檢測標簽，用于檢測PVDF膜上的磷酸化蛋白。首先配制含有吐溫的Tris-鹽酸緩沖液(Tris-buffered saline and tween 20，TBST)(20 mmol/L Tris-HCl pH7.5，500 mmol/L NaCl，0.2% 吐溫)，然后配制Phos-tagTM Biotin反應溶液(469 μL TBST、10 μL Phos-tagTM Biotin、20 μL 10 mmol/L Zn(NO3)2、1 μL生物素結合蛋白偶聯二抗)；室溫下避光靜置至少30 min；將反應溶液加入到離心型濾器中(標稱分子量限值=30 000)；14 000 g離心20 min；收集Phos-tagTM Biotin-Zn2+-生物素結合蛋白偶聯二抗復合物溶液；用TBST按照1∶10稀釋。電泳分離蛋白質并將蛋白轉移到PVDF膜上。PVDF膜先在TBST中孵育1 h，室溫下PVDF膜和Phos-tagTM Biotin-Zn2+-生物素結合蛋白偶聯二抗復合物孵育30 min。TBST洗膜兩次，每次5 min。Li-Cor Odyssey 紅外激光成像系統檢測蛋白信號。
1.2.7 統計學方法
每組實驗獨立重復3次，實驗數據用均數±標準差(
2 結果
2.1 表達載體的構建
PCR反應得到CK2α1、CK2α2、CK2β和PINK1S的cDNA片段，酶切后連接到帶有不同標簽的pcDNA3.1(+)載體上，擴增獲得表達載體。如圖 1所示，M代表DNA分子量標準，泳道1~5分別代表pcDNA3.1(+)-HA- CK2α1、pcDNA3.1(+)-HA- CK2α2、pcDNA3.1(+)-HA- CK2β、pcDNA3.1(+)-Myc-PINK1S、pcDNA3.1(+)-Flag-PINK1S酶切鑒定條帶，其中5 500 bp左右條帶為帶不同標簽的pcDNA3.1(+)載體，1 000 bp左右條帶為各個基因的cDNA片段。其中1 176 bp為CK2α1、 1 053 bp為 CK2α2、639 bp為CK2β、1 386 bp為PINK1S。
圖1
限制性內切核酸酶酶切檢測表達載體
Figure1.
Identification of expression plasmids by restriction endonuclease digestion
2.2 CK2β與PINK1S的相互作用
研究表明，PINK1的酶活力是通過自我磷酸化來調控的，但是具體的分子機制還不清楚。為了研究PINK1活力調控的輔助因子，本文進行小規模篩選，發現PINK1S能夠與CK2β相互作用。在HEK293細胞中共表達pcDNA3.1-HA和Myc-PINK1S為對照組，分別共表達HA-CK2α1和Myc-PINK1S，HA-CK2α2和Myc-PINK1S，HA-CK2β和Myc-PINK1S為實驗組，利用抗HA單克隆抗體進行co-IP，檢測CK2的3個亞基與PINK1S的相互作用情況。如圖 2所示，全細胞裂解液中CK2α1、CK2α2、CK2β和PINK1S均有表達，co-IP組中，用抗Myc單克隆抗體只能在同時過表達CK2β時才能檢測到PINK1S信號，表明只有CK2β能夠與PINK1S發生相互作用，而CK2α1和CK2α2和PINK1S均沒有相互作用。另據報道顯示，CK2β亞基除了在CK2激酶復合體中作為兩個催化亞基的中介亞基調節活性外，還能以游離的狀態廣泛地分布于細胞質內，暗示CK2β和有可能參與的細胞質內PINK1S的活力調控。
圖2
CK2β結合PINK1S
Figure2.
Interaction of CK2β with PINK1S
2.3 CK2β促進PINK1S自我磷酸化
由于PINK1能夠自我磷酸化，而兩個PINK1分子本身并不會相互結合，因此猜測具有蛋白質連接功能的CK2β是PINK1自我磷酸化的中介。為了證實這一推論，在HEK 293細胞內共表達空載體pcDNA3.1(+)-HA和Flag-PINK1S為對照組，共表達HA-CK2β和Flag-PINK1S為實驗組。利用抗Flag單克隆抗體，通過co-IP從細胞中純化出PINK1S蛋白，然后用Phos-tagTM Biotin檢測對照組和實驗組中PINK1S的磷酸化水平。如圖 3所示，純化得到的PINK1S蛋白，western blot后經Phos-tagTM Biotin檢測的信號為磷酸化的PINK1S，而抗Flag單克隆抗體檢測的信號為總PINK1S。實驗組和對照組中磷酸化PINK1S 的水平均用Phos-tagTM Biotin信號強度除以Flag-PINK1S信號強度來表示，統計后發現相比于對照組PINK1S的磷酸化水平，過表達CK2β能夠使PINK1S自我磷酸化的水平升高到150%(*P＜0.05，與對照組比較)。
圖3
CK2β促進PINK1S自我磷酸化
Figure3.
Auto-phosphorylation of PINK1S enhanced by CK2β
2.4 細胞缺失CK2β抑制PINK1S自我磷酸化
以上實驗證實CK2β作為一種連接亞基能夠連接PINK1S，并促進其自我磷酸化。為了進一步驗證CK2β對PINK1S激酶活力的調控作用，我們將shRNA載體轉染到細胞，篩選出對照細胞株(shControl)和CK2β表達降低的細胞株(shCK2β)。如圖 4(a)所示，與shControl細胞株相比，shCK2β細胞株中CK2β表達量明顯下降。由于shCK2β細胞株為多克隆細胞株，為了更加精確地研究CK2β對PINK1S活力的調控作用，我們在shCK2β細胞株的基礎上篩選得到CK2β沉默的單克隆細胞株，shCK2β#1和shCK2β#2。在shControl、shCK2β#1、shCK2β#2細胞株內分別過表達Flag-PINK1S，用抗Flag單克隆抗體進行co-IP，從細胞中純化出PINK1S，再用Phos-tagTM Biotin檢測PINK1S的磷酸化水平。如圖 4(b)所示，PINK1S磷酸化水平用Phos-tagTM Biotin信號強度除以Flag-PINK1S信號強度來表示，相比于shControl細胞株，shCK2β#1和shCK2β#2細胞內PINK1S自我磷酸化水平分別下降了33%和66%。
圖4
缺失CK2β抑制PINK1S自我磷酸化
(a)Western blot實驗檢測shControl和shCK2β細胞內CK2β蛋白水平；(b)Phos-tagTM Biotin方法檢測不同細胞內PINK1S的磷酸化水平。
Figure4. PINK1S auto-phosphorylation of PINK1S by CK2β with reducing the efficiency(a)Western blot analysis of CK2β in shControl and shCKβ cell lines;(b)Detection of phosp-PINK1S in different cell lines by Phos-tagTM Biotin
3 討論
本研究發現，CK2β作為一種蛋白質的連接亞基，參與了胞質中PINK1S的自我磷酸化過程。由于CK2β并無催化活性，它在這一過程中扮演了PINK1S相互結合的媒介。缺少CK2β的細胞株內，PINK1S的自我磷酸化水平明顯降低，如圖 5所示。
目前研究結果表明，PINK1突變導致的線粒體損傷是誘發家族性帕金森氏癥的重要因素之一[9-11]。作為細胞內重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，PINK1活力的調控決定了下游信號通路的激活與否，因此闡明其激酶活力的調控機制將為帕金森氏發病的治療提供理論基礎。自我磷酸化激活是激酶調控自身活力的最普遍方式之一[12-13]。和其他的激酶不同，PINK1S蛋白分子之間并不能直接相互結合，暗示PINK1的活力調節可能還有其他蛋白參與。從結構上看，CK2β通過銜接兩個CK2 催化亞基，進而活化整個激酶復合體，并且能夠幫助兩個催化亞基識別底物[14-15]。本研究中指出，CK2β能夠促進兩個PINK1分子之間的相互磷酸化，但是還不清楚是否也協助識別PINK1S的底物。下一步將深入探討CK2β是否能夠促進PINK1S和其底物的相互作用。
圖5
CK2β促進PINK1S二聚化和自我磷酸化
Figure5.
A model for CK2β-induced dimerization and auto-phosphorylation of PINK1S
本研究從生化和細胞層面證明，CK2β能夠調節PINK1S的激酶活力，不僅豐富了PINK1S活力調控的機理，而且也闡明了CK2β在其他激酶復合體中的重要功能，提示CK2β突變也可能是誘發帕金森氏病的又一原因。
引言
帕金森氏病是當今三大神經退行性疾病之一，其病因主要是多巴胺神經元的死亡[1]。PTEN誘導激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)是一種線粒體絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是遺傳性帕金森氏病的主要相關蛋白[2]。PINK1長亞型(PINK1 long isoform,PINK1L)會在跨膜電位下降的線粒體外膜上積累，促進損傷的線粒體通過自噬途徑清除[3]。另外，還會產生一種PINK1短亞型(PINK1 short isoform,PINK1S)，這種形式不穩定，由蛋白酶體降解，該亞型對線粒體也有保護作用[4]。據研究顯示，在線粒體功能失衡情況下，PINK1L在線粒體外膜聚集并通過自我磷酸化的方式增強自身活性，從而更有效地促進后續線粒體的自噬進程[5]。兩個PINK1分子之間能夠互相磷酸化，但是PINK1本身并不會主動相互結合，那么它們的相互催化作用必將有其他未知的輔助因子參與。本文旨在研究胞質中PINK1S的自我磷酸化調控機制。
酪蛋白激酶2(Casein kinase 2，CK2)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合體，廣泛分布于細胞中，參與細胞增殖分化調控。它由兩個催化亞基CK2α1和CK2α2，與兩個調節亞基CK2β組合而成[6]。此復合體中CK2β是作為一個中間的銜接亞基有效地連接兩個催化亞基，從而促進CK2對底物的識別和磷酸化[7-8]。另外，前人研究表明CK2β亞基還能在細胞質中游離存在，暗示其還具有其他重要功能。本研究發現，CK2β能夠與PINK1S相互作用，并促進其自我磷酸化從而增強胞質中PINK1S的活性。
1 材料與方法
1.1 材料
質粒提取試劑盒以及DNA膠回收試劑盒購自OMEGA BIO-TEK；限制性內切酶購自NEW England Biolabs；HEK293細胞株購自ATCC；DMEM培養基購自Hyclone；真核表達載體pcDNA3.1(+)購自Invitrogen；細胞培養胎牛血清購自Biowest；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜和蛋白G瓊脂糖凝膠購自Millipore；抗Flag、HA、Myc單克隆抗體均購自Prospect；Phos-tagTM Biotin購自WAKO；生物素結合蛋白偶聯二抗和蛋白酶抑制劑均購自Thermo Scientific；人類基因cDNA購自Addgene；轉染試劑MegaTran1.0購于Origene；其他生化試劑均為國產分析純。
1.2 方法
1.2.1 表達載體的構建
以目的基因cDNA為模板，兩端設計帶有限制性內切酶位點的上下游引物，通過聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)獲得目的基因片段，然后用相對應的兩種限制性內切酶酶切目的基因以及欲使用的帶有HA、Myc、Flag標簽的pcDNA3.1(+)載體。將回收到的片段和載體用T4連接酶于20 ℃連接。連接產物轉化到大腸桿菌感受態細胞DH5α中，42 ℃熱激后涂于相應抗性的LB固體培養基上，37 ℃過夜培養。挑選單菌落擴增培養，提取質粒。質粒用相應限制性內切酶切割鑒定是否連入目的基因，并測序確認。質粒構建中引物序列如表 1所示，由成都擎科梓熙生物技術公司合成。
表1
PCR擴增引物序列
Table1.
Primers of cDNA PCR amplification
1.2.2 細胞培養與目的基因的表達
用DMEM基礎培養基配制HEK293細胞完全培養液(10% 胎牛血清、1% 非必須氨基酸、1% 青霉素和鏈霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺)，細胞培養于37 ℃、5% CO2培養箱。HEK293細胞培養于10 cm細胞培養皿中，胰酶消化細胞，按照24孔板12×104個/孔；6孔板50×104/孔，均勻接種于培養板，12 h以后進行表達載體的轉染。轉染方法均按照轉染試劑MegaTran1.0的使用說明進行。質粒與轉染試劑1∶3的比例，在DMEM培養基環境下轉染4~6 h后換成完全培養液，24 h后進行后續實驗。
1.2.3 免疫共沉淀實驗(Co-Immunoprecipitation，co-IP)
HEK293細胞按標準接種于6孔培養板中，37 ℃培養12 h后轉染表達載體，轉染后培養24 h，使蛋白質充分表達。棄培養液，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗3次，每個孔加入200 μL NP40細胞裂解液(1% NP40、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、1 mmol/L 蛋白酶抑制劑)冰上裂解30 min，將裂解產物收集在EP管中4 ℃，14 000 rpm離心15 min。離心后取上清10 μL為全細胞裂解液樣品，加入十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)上樣緩沖液(2% SDS、40 mmol/L Tris-HCl pH 6.8、2 mmol/L二硫蘇糖醇、4% 甘油、0.01% 溴酚藍)，剩余上清轉移至新的EP管加入2 μg抗Flag或抗HA單克隆抗體，4 ℃旋轉孵育2 h。然后每支樣品加入20 μL 蛋白G瓊脂糖凝膠，繼續于4 ℃旋轉孵育1 h。最后用NP40細胞裂解液漂洗蛋白G瓊脂糖凝膠3次，除去裂解液，加入適量SDS上樣緩沖液。以上蛋白樣品100 ℃煮5 min，用于western blot檢測。
1.2.4 Western blot實驗
蛋白樣品經10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再以濕轉法將凝膠上的蛋白質轉移至PVDF膜上，用含有0.2%吐溫的PBS(phosphate buffer saline and tween 20，PBST)配制5%脫脂奶粉，PVDF膜在牛奶中封閉1 h，然后在塑料膜中孵育一抗4 ℃旋轉過夜。回收一抗，PBST洗3次，室溫搖晃孵育二抗1 h，孵育結束后PBST洗3次，膜烘干。利用Li-Cor Odyssey 紅外激光成像系統檢測蛋白信號。Image J軟件分析蛋白條帶灰度，統計變化量。
1.2.5 CK2β沉默細胞株的建立
利用Invitrogen Block-iT miRNA system RNA干擾技術在HEK293細胞的基礎上建立沉默掉CK2β的細胞株。首先利用Invitrogen Block-iTRNAi Designer設計了CK2β干擾引物-CK2β392。CK2β392上游引物：TGCTGTTCACAGAAGAATTCATTGCCGT TTTGGCCACTGACTGACGGCAATGATCTTCT GTGAA；下游引物：CCTGTTCACAGAAGATCA TTGCCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGGCAATG AATTCTTCTGTGAAC。合成的DNA退火形成雙鏈DNA，克隆到pcDNA3.1(+)-EGFP-mi155載體。該載體能夠產生短發夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)，干擾CK2β表達。載體酶切鑒定正確后，轉染到HEK293細胞株內，篩選得到含有增強綠色熒光蛋白表達的細胞，通過western blot分析CK2 蛋白表達量。另外，轉染pcDNA3.1(+)-EGFP-mi155空載體篩選得到對照細胞株。
1.2.6 Phos-tagTM Biotin檢測細胞內磷酸化蛋白
Phos-tagTM Biotin即生物素標記的磷酸化蛋白檢測標簽，用于檢測PVDF膜上的磷酸化蛋白。首先配制含有吐溫的Tris-鹽酸緩沖液(Tris-buffered saline and tween 20，TBST)(20 mmol/L Tris-HCl pH7.5，500 mmol/L NaCl，0.2% 吐溫)，然后配制Phos-tagTM Biotin反應溶液(469 μL TBST、10 μL Phos-tagTM Biotin、20 μL 10 mmol/L Zn(NO3)2、1 μL生物素結合蛋白偶聯二抗)；室溫下避光靜置至少30 min；將反應溶液加入到離心型濾器中(標稱分子量限值=30 000)；14 000 g離心20 min；收集Phos-tagTM Biotin-Zn2+-生物素結合蛋白偶聯二抗復合物溶液；用TBST按照1∶10稀釋。電泳分離蛋白質并將蛋白轉移到PVDF膜上。PVDF膜先在TBST中孵育1 h，室溫下PVDF膜和Phos-tagTM Biotin-Zn2+-生物素結合蛋白偶聯二抗復合物孵育30 min。TBST洗膜兩次，每次5 min。Li-Cor Odyssey 紅外激光成像系統檢測蛋白信號。
1.2.7 統計學方法
每組實驗獨立重復3次，實驗數據用均數±標準差(
2 結果
2.1 表達載體的構建
PCR反應得到CK2α1、CK2α2、CK2β和PINK1S的cDNA片段，酶切后連接到帶有不同標簽的pcDNA3.1(+)載體上，擴增獲得表達載體。如圖 1所示，M代表DNA分子量標準，泳道1~5分別代表pcDNA3.1(+)-HA- CK2α1、pcDNA3.1(+)-HA- CK2α2、pcDNA3.1(+)-HA- CK2β、pcDNA3.1(+)-Myc-PINK1S、pcDNA3.1(+)-Flag-PINK1S酶切鑒定條帶，其中5 500 bp左右條帶為帶不同標簽的pcDNA3.1(+)載體，1 000 bp左右條帶為各個基因的cDNA片段。其中1 176 bp為CK2α1、 1 053 bp為 CK2α2、639 bp為CK2β、1 386 bp為PINK1S。
圖1
限制性內切核酸酶酶切檢測表達載體
Figure1.
Identification of expression plasmids by restriction endonuclease digestion
2.2 CK2β與PINK1S的相互作用
研究表明，PINK1的酶活力是通過自我磷酸化來調控的，但是具體的分子機制還不清楚。為了研究PINK1活力調控的輔助因子，本文進行小規模篩選，發現PINK1S能夠與CK2β相互作用。在HEK293細胞中共表達pcDNA3.1-HA和Myc-PINK1S為對照組，分別共表達HA-CK2α1和Myc-PINK1S，HA-CK2α2和Myc-PINK1S，HA-CK2β和Myc-PINK1S為實驗組，利用抗HA單克隆抗體進行co-IP，檢測CK2的3個亞基與PINK1S的相互作用情況。如圖 2所示，全細胞裂解液中CK2α1、CK2α2、CK2β和PINK1S均有表達，co-IP組中，用抗Myc單克隆抗體只能在同時過表達CK2β時才能檢測到PINK1S信號，表明只有CK2β能夠與PINK1S發生相互作用，而CK2α1和CK2α2和PINK1S均沒有相互作用。另據報道顯示，CK2β亞基除了在CK2激酶復合體中作為兩個催化亞基的中介亞基調節活性外，還能以游離的狀態廣泛地分布于細胞質內，暗示CK2β和有可能參與的細胞質內PINK1S的活力調控。
圖2
CK2β結合PINK1S
Figure2.
Interaction of CK2β with PINK1S
2.3 CK2β促進PINK1S自我磷酸化
由于PINK1能夠自我磷酸化，而兩個PINK1分子本身并不會相互結合，因此猜測具有蛋白質連接功能的CK2β是PINK1自我磷酸化的中介。為了證實這一推論，在HEK 293細胞內共表達空載體pcDNA3.1(+)-HA和Flag-PINK1S為對照組，共表達HA-CK2β和Flag-PINK1S為實驗組。利用抗Flag單克隆抗體，通過co-IP從細胞中純化出PINK1S蛋白，然后用Phos-tagTM Biotin檢測對照組和實驗組中PINK1S的磷酸化水平。如圖 3所示，純化得到的PINK1S蛋白，western blot后經Phos-tagTM Biotin檢測的信號為磷酸化的PINK1S，而抗Flag單克隆抗體檢測的信號為總PINK1S。實驗組和對照組中磷酸化PINK1S 的水平均用Phos-tagTM Biotin信號強度除以Flag-PINK1S信號強度來表示，統計后發現相比于對照組PINK1S的磷酸化水平，過表達CK2β能夠使PINK1S自我磷酸化的水平升高到150%(*P＜0.05，與對照組比較)。
圖3
CK2β促進PINK1S自我磷酸化
Figure3.
Auto-phosphorylation of PINK1S enhanced by CK2β
2.4 細胞缺失CK2β抑制PINK1S自我磷酸化
以上實驗證實CK2β作為一種連接亞基能夠連接PINK1S，并促進其自我磷酸化。為了進一步驗證CK2β對PINK1S激酶活力的調控作用，我們將shRNA載體轉染到細胞，篩選出對照細胞株(shControl)和CK2β表達降低的細胞株(shCK2β)。如圖 4(a)所示，與shControl細胞株相比，shCK2β細胞株中CK2β表達量明顯下降。由于shCK2β細胞株為多克隆細胞株，為了更加精確地研究CK2β對PINK1S活力的調控作用，我們在shCK2β細胞株的基礎上篩選得到CK2β沉默的單克隆細胞株，shCK2β#1和shCK2β#2。在shControl、shCK2β#1、shCK2β#2細胞株內分別過表達Flag-PINK1S，用抗Flag單克隆抗體進行co-IP，從細胞中純化出PINK1S，再用Phos-tagTM Biotin檢測PINK1S的磷酸化水平。如圖 4(b)所示，PINK1S磷酸化水平用Phos-tagTM Biotin信號強度除以Flag-PINK1S信號強度來表示，相比于shControl細胞株，shCK2β#1和shCK2β#2細胞內PINK1S自我磷酸化水平分別下降了33%和66%。
圖4
缺失CK2β抑制PINK1S自我磷酸化
(a)Western blot實驗檢測shControl和shCK2β細胞內CK2β蛋白水平；(b)Phos-tagTM Biotin方法檢測不同細胞內PINK1S的磷酸化水平。
Figure4. PINK1S auto-phosphorylation of PINK1S by CK2β with reducing the efficiency(a)Western blot analysis of CK2β in shControl and shCKβ cell lines;(b)Detection of phosp-PINK1S in different cell lines by Phos-tagTM Biotin
3 討論
本研究發現，CK2β作為一種蛋白質的連接亞基，參與了胞質中PINK1S的自我磷酸化過程。由于CK2β并無催化活性，它在這一過程中扮演了PINK1S相互結合的媒介。缺少CK2β的細胞株內，PINK1S的自我磷酸化水平明顯降低，如圖 5所示。
目前研究結果表明，PINK1突變導致的線粒體損傷是誘發家族性帕金森氏癥的重要因素之一[9-11]。作為細胞內重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，PINK1活力的調控決定了下游信號通路的激活與否，因此闡明其激酶活力的調控機制將為帕金森氏發病的治療提供理論基礎。自我磷酸化激活是激酶調控自身活力的最普遍方式之一[12-13]。和其他的激酶不同，PINK1S蛋白分子之間并不能直接相互結合，暗示PINK1的活力調節可能還有其他蛋白參與。從結構上看，CK2β通過銜接兩個CK2 催化亞基，進而活化整個激酶復合體，并且能夠幫助兩個催化亞基識別底物[14-15]。本研究中指出，CK2β能夠促進兩個PINK1分子之間的相互磷酸化，但是還不清楚是否也協助識別PINK1S的底物。下一步將深入探討CK2β是否能夠促進PINK1S和其底物的相互作用。
圖5
CK2β促進PINK1S二聚化和自我磷酸化
Figure5.
A model for CK2β-induced dimerization and auto-phosphorylation of PINK1S
本研究從生化和細胞層面證明，CK2β能夠調節PINK1S的激酶活力，不僅豐富了PINK1S活力調控的機理，而且也闡明了CK2β在其他激酶復合體中的重要功能，提示CK2β突變也可能是誘發帕金森氏病的又一原因。
