本研究旨在通過優化人β2微球蛋白在大腸桿菌中的表達條件并對重組蛋白進行純化,以期獲得可溶性好、純度高的重組人β2微球蛋白(rhβ2M)。通過檢測誘導劑IPTG濃度、誘導溫度和誘導時間對rhβ2M可溶性表達的影響,確定最佳的誘導條件為IPTG終濃度0.8 mmol/L,誘導溫度25℃,誘導時間6 h。在最佳誘導條件下進行發酵培養,獲得可溶性rhβ2M占菌體總可溶蛋白含量的63.7%。對可溶性蛋白進行Ni Sepharose 6 Fast Flow親和層析純化,可獲得純度達95%以上的rhβ2M。Western blot分析表明,該蛋白具有與抗人β2M抗體特異反應的抗原特性。
引用本文： 矯麗媛, 才蕾, 任艷娜, 趙曉妮, 王繼華. 人β2微球蛋白原核表達條件優化及純化. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(5): 1050-1055. doi: 10.7507/1001-5515.20150186 復制
引言
β2微球蛋白(β2-microglobulin，β2M)是由99個氨基酸組成的低分子量蛋白，相對分子質量為11.8 kD。該蛋白位于淋巴細胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)的輕鏈部分[1]，含有一對二硫鍵，從細胞膜脫落后存在于體液中[2]。近年來，β2M被認為是一種腎功能損傷新型標志物[3-4]。檢測血清或尿液中β2M水平升高，分別反映了腎小球濾過功能損傷或近端腎小管輕度損傷。對于白血病和實體瘤患者，其血清中β2M水平是極其重要的預后及預測腫瘤患者存活時間指標[5-7]。此外，β2M是癌細胞的生長因子和信號分子，也是調節血管內皮生長因子、雄性激素受體、脂肪酸合成酶等的一個多能性信號分子[2, 8]。因此，血液和尿液中β2M水平的檢測，在疾病的預防和篩查，藥物療效觀察以及預后等方面均具有重要意義。
應用基因工程技術原核表達人β2微球蛋白已有報道，但其表達的重組人β2微球蛋白(rhβ2M)都以包涵體形式為主[9-11]，如樸文花等[12]構建的rhβ2M表達載體，可溶性目的蛋白僅占總蛋白量的4%。雖然包涵體蛋白可以通過變性、復性方法最終獲得可溶性的rhβ2M，但是包涵體蛋白變性、復性過程復雜，同時大多數包涵體蛋白不能實現完全復性，有的復性率極低，影響了活性蛋白產量。因此，需要構建以可溶形式表達的重組蛋白。本研究通過優化人β2M在大腸桿菌中表達的基因序列，使用帶有促溶標簽的載體pET-32a(+)，用于表達可溶性、具有生物活性的rhβ2M，為β2M診斷試劑盒研發及其抗體的制備奠定基礎。
1 材料和方法
1.1 材料與試劑
質粒pET-32a(+)、大腸桿菌E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)為本實驗室保存；目的基因由Genewiz公司合成；人β2微球蛋白和抗人β2微球蛋白單克隆抗體(兔源和鼠源兩種)購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；限制性內切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ和T4 DNA 連接酶購自Takara公司；預染蛋白Marker購自Life公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和小量質粒提取試劑盒購自天根公司；氨芐青霉素、IPTG、PMSF購自Sigma公司，其他試劑均為國產分析純。
1.2 主要儀器
儀器設備主要有新芝超聲波細胞粉碎機、Thermo Legend RT+臺式低溫離心機、Bio-Rad PowerPac Basic電泳儀、Bio-Rad Gel Doc XR+凝膠成像儀以及GE AKTA Purifier 100蛋白質純化系統等。
1.3 方法
1.3.1 重組質粒pET32a(+)-β2M的構建
通過NCBI數據庫獲取人β2微球蛋白的編碼序列(AY187687)，去除該序列中編碼信號肽的序列，獲得成熟蛋白的編碼序列300 bp。根據大腸桿菌密碼子偏好性，應用密碼子優化工具(http://www.jcat.de/Start.jsp)優化序列，最后由Genewiz公司化學合成該蛋白質的編碼序列。在5′端和3′端分別設計加入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點，酶切位點兩側各加3個保護堿基。將上述合成片段和pET32a(+)載體分別進行雙酶切，回收目的片段并連接，構建重組質粒pET32a(+)-β2M，并轉化E.coli DH5α，通過質粒提取和質粒雙酶切驗證陽性克隆，最后選取陽性克隆進行測序。
1.3.2 rhβ2M在BL21(DE3)表達的優化
將測序正確的pET32a(+)-β2M重組質粒轉化E. coliBL21(DE3)，挑取單菌落，接種至5 mL含氨芐青霉素(50 μg/mL)的LB液體培養基中，37 ℃培養過夜，得到活化的種子液。之后，將活化種子液以1%接種量接種至LB液體培養基中，37 ℃培養至OD600達到0.8時，分別進行如下條件優化：
(1)誘導劑IPTG濃度對rhβ2M可溶性表達的影響：分別加入終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol/L的IPTG，30 ℃震蕩培養箱中培養4 h后取樣。
(2)誘導溫度對rhβ2M可溶性表達的影響：加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG，分別在15、20、25、30和37 ℃的震蕩培養箱中培養4 h后取樣。
(3)誘導時間對rhβ2M可溶性表達的影響：加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG，25 ℃震蕩培養箱中培養，分別于2、4、6、8、12和24 h后取樣。
1.3.3 rhβ2M可溶性分析和檢測
誘導結束后，分別取2 mL菌液離心收集菌體，以超聲破碎緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含100 mmol/L NaCl和1 mmol/L EDTA)重懸，超聲破碎(超聲時長3 min，超聲2 s，間斷4 s，功率200 W)處理，菌體破碎液低溫12 000 r/min離心，取上清進行SDS-PAGE電泳分析，Bio-Rad凝膠成像系統記錄電泳情況，并應用Image Lab 3.0軟件定量分析各樣品中上清表達的rhβ2M占可溶蛋白總量的百分數，從而確定rhβ2M可溶性表達的最佳誘導條件。
1.3.4 rhβ2M純化及鑒定
在優化后的rhβ2M表達最佳條件下，擴大培養細菌并誘導rhβ2M，收集菌體。以超聲破碎緩沖液重懸，加入終濃度為1 mmol/L PMSF，超聲裂解菌體，裂解菌液經過4 ℃，12 000 r/min離心20 min后，收集上清即為粗rhβ2M溶液。該粗蛋白液經Ni Sepharose 6 Fast Flow親和層析純化rhβ2M。配制濃度為12%的SDS-PAGE電泳膠，分別將誘導后、超聲上清與純化后的蛋白溶液進行上樣檢測，電泳后經考馬斯亮藍染色及脫色，Bio-Rad凝膠成像儀記錄電泳情況。
1.3.5 rhβ2M的Western blot檢測
為了檢測rhβ2M的特異性和靈敏度，將純化獲得的rhβ2M，經過SDS-PAGE分離后轉印到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉(溶于PBST緩沖液中)于4 ℃封閉過夜。之后將購買的商品化的抗人β2M單克隆抗體(兔源和鼠源兩種)作為一抗，分別用羊抗兔lgG-HRP和羊抗鼠lgG-HRP作為二抗，以購買的人β2M為對照，進行Western blot檢測分析。
2 結果
2.1 pET32a-β2M重組質粒的鑒定
提取獲得的重組質粒pET32a(+)-β2M用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ進行雙酶切，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示：經過酶切處理，分別在5 900 bp及300 bp處檢測到條帶，這與載體和基因片段大小吻合，如圖 1所示。之后，將該質粒測序結果與β2M優化序列進行DNA比對，結果顯示兩序列完全一致，如圖 2所示，說明重組質粒pET32a(+)-β2M構建成功。
圖1
表達質粒pET32a(+)-β2M的酶切鑒定
M：DL5000 DNA Ladder；1：質粒pET32a(+)-β2M；2：質粒pET32a(+)-β2M酶切產物
Figure1. Identification of plasmid pET32a(+)-β2MM： DL5000 DNA Ladder；1：plasmid pET32a(+)-β2M； 2： plasmid pET32a(+)-β2M digested with
圖2
β2M優化序列與質粒pET32a(+)-β2M測序結果的比對
Figure2.
Alignment of β2M coding sequence with that in pET32a(+)-β2M construct
2.2 rhβ2M誘導表達的優化
2.2.1 IPTG誘導濃度對rhβ2M可溶性表達的影響
pET系列載體進行原核表達時，利用IPTG誘導lacⅠ啟動子過量表達RNA聚合酶，從而大量獲得目的蛋白。但IPTG本身具有毒性，對細菌生長代謝具有一定的抑制作用；同時，高濃度的IPTG容易使目標蛋白形成過快，來不及正確折疊，部分以包涵體形式存在。因此需要對誘導劑IPTG的添加量通過試驗進行優化。選取IPTG終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L的6個濃度梯度分別誘導rhβ2M表達，結果如圖 3所示，在其他誘導條件相同的情況下，當IPTG濃度達到0.8 mmol/L時，rhβ2M可溶表達量為最高，占菌體總可溶蛋白含量的58.1%。繼續增加IPTG濃度(1.0~1.2 mmol/L)，可溶性rhβ2M含量反而下降，基于此確定最佳的IPTG添加量為0.8 mmol/L。
圖3
誘導劑濃度對rhβ2M可溶性表達的影響
M：低分子量標準蛋白；0：未添加IPTG；1-6：IPTG的終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L
Figure3. Effect of IPTG concentration on the soluble expression level of rhβ2MM: protein M W marker; 0: control with no addition of IPTG; 1-6: rhβ2M were induced by final IPTG concentration of 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 mmol/L, respectively
2.2.2 誘導溫度對rhβ2M可溶性表達的影響
細菌生長代謝和外源蛋白表達是一系列相關酶作用的結果，誘導溫度關系著酶催化反應是否在最適溫度下進行，進而影響細菌生長和外源蛋白表達。37 ℃多為這些酶的最適溫度，常被選為誘導溫度。然而這些酶在最適溫度下，生物活性最高，使得目標蛋白的表達過快，從而導致包涵體蛋白的形成。反之，溫度過低雖然可以降低目的蛋白的形成速度，使其緩慢、正確的折疊，最終以可溶形式存在，但會降低蛋白的表達量。因此，最佳誘導溫度需要通過試驗優化來確定。通過15、20、25、30、37 ℃等5個溫度梯度，探究誘導溫度對rhβ2M可溶性表達的影響，結果如圖 4所示，在其他誘導條件相同的情況下，當誘導溫度為低溫(15 ℃)時rhβ2M表達量很低，僅占蛋白總量的27.3%，隨著溫度升高，rhβ2M可溶表達量增加，當誘導溫度為25 ℃時，rhβ2M可溶表達量為最高，占菌體總可溶蛋白含量的61.7%。繼續升高誘導溫度，可溶表達水平有降低趨勢，所以通過優化確定最佳的誘導溫度為25 ℃。
圖4
誘導溫度對rhβ2M可溶性表達的影響
M：低分子量標準蛋白；1-5：誘導溫度分別為15、20、25、30、37 ℃
Figure4. Effect of temperature on the soluble expression level of rhβ2MM: protein M W marker; 1-5: rhβ2M were induced under 15, 20, 25, 30, 37 ℃, respectively
2.2.3 誘導時間對rhβ2M可溶性表達的影響
對于固定的體系，外源蛋白并非隨誘導時間的增加而不斷產生，誘導時間延長會伴隨著細菌的衰老死亡、次級代謝產物的產生和釋放，不利于外源蛋白的穩定存在。因此需要通過試驗優化來確定最佳誘導時間。在25 ℃，IPTG終濃度為0.8 mmol/L條件下，誘導rhβ2M，并分別對2、4、6、8、12、24 h樣品進行電泳檢測。誘導時間對rhβ2M可溶性表達的影響，結果如圖 5所示，在其他誘導條件相同的情況下，rhβ2M可溶表達量隨著誘導時間的增加，rhβ2M可溶表達量增加，當誘導時間為6 h或時間更長時，rhβ2M可溶表達量趨于穩定，約占菌體總可溶蛋白含量的63.2%。繼續增加誘導時間，未見可溶表達水平提高，所以通過優化確定最佳的誘導時間為6 h。
圖5
誘導時間對rhβ2M可溶性表達的影響
M：低分子量標準蛋白；1-6：誘導時間分別為2、4、6、8、12、24小時
Figure5. Effect of different time on the soluble expression level of rhβ2MLane M: protein M W marker; Lane 1-6: induced time of rhβ2M were 2, 4, 6, 8, 12, 24 h, respectively
2.3 rhβ2M純化結果
在優化確定的rhβ2M表達最佳條件下，擴大培養細菌，誘導劑IPTG添加終濃度為0.8 mmol/L，25℃條件下誘導培養6 h，最后收集菌體，超聲破碎后，取上清純化。rhβ2M純化的SDS-PAGE檢測結果如圖 6所示。凝膠掃描成像Bio-Rad軟件分析顯示rhβ2M表達量可達細菌總蛋白的39.2%，其可溶表達量占菌體總可溶蛋白含量的63.7%。通過Ni親和層析純化后，可獲得純度達95%以上的rhβ2M。
圖6
β2M表達產物及其純化后蛋白的SDS-PAGE分析
M：低分子量標準蛋白；1：未誘導菌體；2：誘導菌體；3：菌體超聲破碎后的可溶蛋白；4-5：純化后rhβ2M
Figure6. SDS-PAGE analysis of rhβ2M products and purified proteinM: protein M W marker; 1: uninduced expression of β2M in
2.4 rhβ2M的Western blot結果
rhβ2M的生物學活性檢測選用鼠/兔抗人β2M單克隆抗體對rhβ2M進行免疫學鑒定。將純化后的rhβ2M和購買的人β2M進行SDS-PAGE，并轉印到硝酸纖維素膜上，進行免疫印跡分析，以人β2M為正對照，結果如圖 7所示。目的蛋白rhβ2M可與鼠/兔抗人β2M單克隆抗體反應，約在30 kD(含標簽的融合蛋白)處出現一條清晰的條帶，大小與SDS-PAGE中檢測的條帶吻合。同時，人β2M在12 KDa附近的單一顯色條帶可以作為陽性對照。以上結果可知：原核表達獲得的rhβ2M可與抗人β2M抗體特異性結合，條帶唯一，特異性良好，具有生物學活性。
圖7
rhβ2M免疫印跡檢測結果
(a)SDS-PAGE檢測結果；(b)一抗1：抗人β2M單克隆抗體(鼠源)；(c)一抗2：抗人β2M單克隆抗體(兔源)。M：預染蛋白標準；1：rhβ2M；2：人β2M
Figure7. Western blot analysis of rhβ2M(a) SDS-PAGE Analysis; (b) primary antibody 1： anti-β2M antibody (mouse monoclonal); (c) primary antibody 2： anti-β2M antibody (rabbit monoclonal). M： protein M W marker； 1： rhβ2M； 2： human β2M
3 討論
基于β2M作為主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ類分子的輕鏈部分[13]，及其在腎臟損傷和某些腫瘤患者臨床檢測中的廣泛應用。獲得高生物活性、高純度的β2M是制備MHC四聚體分子和研發β2M檢測試劑盒所需抗原不可或缺的前提條件。重組表達人β2M的研究已有報道，但是經過原核表達獲得的重組蛋白多為包涵體，構建以可溶形式表達的rhβ2M成為研究的關鍵。本研究通過NCBI數據庫獲得人β2M氨基酸序列，通過對β2M密碼子進行優化，獲得E.coli慣用的密碼子序列，之后化學合成β2M基因序列。選用帶有促溶標簽(硫氧還蛋白融合蛋白和多肽，Trx-tag)的載體pET32a(+)，構建重組質粒pET32a(+)-β2M并轉入BL21(DE3)。該載體在進行基因表達時，硫氧還原蛋白有助于目的蛋白的正確折疊，促進有活性蛋白的產物形成，提高目的蛋白可溶表達量，并可以抵御蛋白酶的降解作用。
研究證實，外源基因在細菌中高效表達，可以通過調節宿主菌生長和代謝與外源基因表達速率之間的關系來實現，因此，對外源蛋白誘導條件的優化成為一個重要環節。外源蛋白表達的常規因素包括誘導劑IPTG濃度、誘導溫度、誘導時間等[14-15]，每個因素的變化均會影響宿主菌的生長代謝和外源蛋白的表達。本研究以rhβ2M可溶表達量來優化誘導條件，在優化過程中發現，誘導溫度變化對rhβ2M可溶表達量有顯著影響；誘導時間不宜過長，rhβ2M可溶表達量趨于穩定即可。在最佳誘導條件下，rhβ2M表達量可達細菌總蛋白的39.2%，可溶蛋白表達量占菌體總可溶蛋白含量的63.7%，實現了人β2M在E.coli中高效地可溶性表達。經過大量發酵培養，Ni2+螯合親和層析柱純化蛋白，其純度可以達95%以上，最終獲得高純度rhβ2M。
生物活性方面，使用免疫學方法Western blot鑒定rhβ2M的抗原特性，以購買的人β2M為對照，該蛋白和構建的rhβ2M均出現單一條帶，且條帶分子量大小正確，說明rhβ2M能與抗人β2M單克隆抗體結合，具有較高特異性，進而證明該蛋白具有抗原的特性，為MHC四聚體分子制備研究以及β2M臨床檢測應用奠定基礎。
引言
β2微球蛋白(β2-microglobulin，β2M)是由99個氨基酸組成的低分子量蛋白，相對分子質量為11.8 kD。該蛋白位于淋巴細胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)的輕鏈部分[1]，含有一對二硫鍵，從細胞膜脫落后存在于體液中[2]。近年來，β2M被認為是一種腎功能損傷新型標志物[3-4]。檢測血清或尿液中β2M水平升高，分別反映了腎小球濾過功能損傷或近端腎小管輕度損傷。對于白血病和實體瘤患者，其血清中β2M水平是極其重要的預后及預測腫瘤患者存活時間指標[5-7]。此外，β2M是癌細胞的生長因子和信號分子，也是調節血管內皮生長因子、雄性激素受體、脂肪酸合成酶等的一個多能性信號分子[2, 8]。因此，血液和尿液中β2M水平的檢測，在疾病的預防和篩查，藥物療效觀察以及預后等方面均具有重要意義。
應用基因工程技術原核表達人β2微球蛋白已有報道，但其表達的重組人β2微球蛋白(rhβ2M)都以包涵體形式為主[9-11]，如樸文花等[12]構建的rhβ2M表達載體，可溶性目的蛋白僅占總蛋白量的4%。雖然包涵體蛋白可以通過變性、復性方法最終獲得可溶性的rhβ2M，但是包涵體蛋白變性、復性過程復雜，同時大多數包涵體蛋白不能實現完全復性，有的復性率極低，影響了活性蛋白產量。因此，需要構建以可溶形式表達的重組蛋白。本研究通過優化人β2M在大腸桿菌中表達的基因序列，使用帶有促溶標簽的載體pET-32a(+)，用于表達可溶性、具有生物活性的rhβ2M，為β2M診斷試劑盒研發及其抗體的制備奠定基礎。
1 材料和方法
1.1 材料與試劑
質粒pET-32a(+)、大腸桿菌E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)為本實驗室保存；目的基因由Genewiz公司合成；人β2微球蛋白和抗人β2微球蛋白單克隆抗體(兔源和鼠源兩種)購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；限制性內切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ和T4 DNA 連接酶購自Takara公司；預染蛋白Marker購自Life公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和小量質粒提取試劑盒購自天根公司；氨芐青霉素、IPTG、PMSF購自Sigma公司，其他試劑均為國產分析純。
1.2 主要儀器
儀器設備主要有新芝超聲波細胞粉碎機、Thermo Legend RT+臺式低溫離心機、Bio-Rad PowerPac Basic電泳儀、Bio-Rad Gel Doc XR+凝膠成像儀以及GE AKTA Purifier 100蛋白質純化系統等。
1.3 方法
1.3.1 重組質粒pET32a(+)-β2M的構建
通過NCBI數據庫獲取人β2微球蛋白的編碼序列(AY187687)，去除該序列中編碼信號肽的序列，獲得成熟蛋白的編碼序列300 bp。根據大腸桿菌密碼子偏好性，應用密碼子優化工具(http://www.jcat.de/Start.jsp)優化序列，最后由Genewiz公司化學合成該蛋白質的編碼序列。在5′端和3′端分別設計加入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點，酶切位點兩側各加3個保護堿基。將上述合成片段和pET32a(+)載體分別進行雙酶切，回收目的片段并連接，構建重組質粒pET32a(+)-β2M，并轉化E.coli DH5α，通過質粒提取和質粒雙酶切驗證陽性克隆，最后選取陽性克隆進行測序。
1.3.2 rhβ2M在BL21(DE3)表達的優化
將測序正確的pET32a(+)-β2M重組質粒轉化E. coliBL21(DE3)，挑取單菌落，接種至5 mL含氨芐青霉素(50 μg/mL)的LB液體培養基中，37 ℃培養過夜，得到活化的種子液。之后，將活化種子液以1%接種量接種至LB液體培養基中，37 ℃培養至OD600達到0.8時，分別進行如下條件優化：
(1)誘導劑IPTG濃度對rhβ2M可溶性表達的影響：分別加入終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol/L的IPTG，30 ℃震蕩培養箱中培養4 h后取樣。
(2)誘導溫度對rhβ2M可溶性表達的影響：加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG，分別在15、20、25、30和37 ℃的震蕩培養箱中培養4 h后取樣。
(3)誘導時間對rhβ2M可溶性表達的影響：加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG，25 ℃震蕩培養箱中培養，分別于2、4、6、8、12和24 h后取樣。
1.3.3 rhβ2M可溶性分析和檢測
誘導結束后，分別取2 mL菌液離心收集菌體，以超聲破碎緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，含100 mmol/L NaCl和1 mmol/L EDTA)重懸，超聲破碎(超聲時長3 min，超聲2 s，間斷4 s，功率200 W)處理，菌體破碎液低溫12 000 r/min離心，取上清進行SDS-PAGE電泳分析，Bio-Rad凝膠成像系統記錄電泳情況，并應用Image Lab 3.0軟件定量分析各樣品中上清表達的rhβ2M占可溶蛋白總量的百分數，從而確定rhβ2M可溶性表達的最佳誘導條件。
1.3.4 rhβ2M純化及鑒定
在優化后的rhβ2M表達最佳條件下，擴大培養細菌并誘導rhβ2M，收集菌體。以超聲破碎緩沖液重懸，加入終濃度為1 mmol/L PMSF，超聲裂解菌體，裂解菌液經過4 ℃，12 000 r/min離心20 min后，收集上清即為粗rhβ2M溶液。該粗蛋白液經Ni Sepharose 6 Fast Flow親和層析純化rhβ2M。配制濃度為12%的SDS-PAGE電泳膠，分別將誘導后、超聲上清與純化后的蛋白溶液進行上樣檢測，電泳后經考馬斯亮藍染色及脫色，Bio-Rad凝膠成像儀記錄電泳情況。
1.3.5 rhβ2M的Western blot檢測
為了檢測rhβ2M的特異性和靈敏度，將純化獲得的rhβ2M，經過SDS-PAGE分離后轉印到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉(溶于PBST緩沖液中)于4 ℃封閉過夜。之后將購買的商品化的抗人β2M單克隆抗體(兔源和鼠源兩種)作為一抗，分別用羊抗兔lgG-HRP和羊抗鼠lgG-HRP作為二抗，以購買的人β2M為對照，進行Western blot檢測分析。
2 結果
2.1 pET32a-β2M重組質粒的鑒定
提取獲得的重組質粒pET32a(+)-β2M用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ進行雙酶切，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示：經過酶切處理，分別在5 900 bp及300 bp處檢測到條帶，這與載體和基因片段大小吻合，如圖 1所示。之后，將該質粒測序結果與β2M優化序列進行DNA比對，結果顯示兩序列完全一致，如圖 2所示，說明重組質粒pET32a(+)-β2M構建成功。
圖1
表達質粒pET32a(+)-β2M的酶切鑒定
M：DL5000 DNA Ladder；1：質粒pET32a(+)-β2M；2：質粒pET32a(+)-β2M酶切產物
Figure1. Identification of plasmid pET32a(+)-β2MM： DL5000 DNA Ladder；1：plasmid pET32a(+)-β2M； 2： plasmid pET32a(+)-β2M digested with
圖2
β2M優化序列與質粒pET32a(+)-β2M測序結果的比對
Figure2.
Alignment of β2M coding sequence with that in pET32a(+)-β2M construct
2.2 rhβ2M誘導表達的優化
2.2.1 IPTG誘導濃度對rhβ2M可溶性表達的影響
pET系列載體進行原核表達時，利用IPTG誘導lacⅠ啟動子過量表達RNA聚合酶，從而大量獲得目的蛋白。但IPTG本身具有毒性，對細菌生長代謝具有一定的抑制作用；同時，高濃度的IPTG容易使目標蛋白形成過快，來不及正確折疊，部分以包涵體形式存在。因此需要對誘導劑IPTG的添加量通過試驗進行優化。選取IPTG終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L的6個濃度梯度分別誘導rhβ2M表達，結果如圖 3所示，在其他誘導條件相同的情況下，當IPTG濃度達到0.8 mmol/L時，rhβ2M可溶表達量為最高，占菌體總可溶蛋白含量的58.1%。繼續增加IPTG濃度(1.0~1.2 mmol/L)，可溶性rhβ2M含量反而下降，基于此確定最佳的IPTG添加量為0.8 mmol/L。
圖3
誘導劑濃度對rhβ2M可溶性表達的影響
M：低分子量標準蛋白；0：未添加IPTG；1-6：IPTG的終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L
Figure3. Effect of IPTG concentration on the soluble expression level of rhβ2MM: protein M W marker; 0: control with no addition of IPTG; 1-6: rhβ2M were induced by final IPTG concentration of 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 mmol/L, respectively
2.2.2 誘導溫度對rhβ2M可溶性表達的影響
細菌生長代謝和外源蛋白表達是一系列相關酶作用的結果，誘導溫度關系著酶催化反應是否在最適溫度下進行，進而影響細菌生長和外源蛋白表達。37 ℃多為這些酶的最適溫度，常被選為誘導溫度。然而這些酶在最適溫度下，生物活性最高，使得目標蛋白的表達過快，從而導致包涵體蛋白的形成。反之，溫度過低雖然可以降低目的蛋白的形成速度，使其緩慢、正確的折疊，最終以可溶形式存在，但會降低蛋白的表達量。因此，最佳誘導溫度需要通過試驗優化來確定。通過15、20、25、30、37 ℃等5個溫度梯度，探究誘導溫度對rhβ2M可溶性表達的影響，結果如圖 4所示，在其他誘導條件相同的情況下，當誘導溫度為低溫(15 ℃)時rhβ2M表達量很低，僅占蛋白總量的27.3%，隨著溫度升高，rhβ2M可溶表達量增加，當誘導溫度為25 ℃時，rhβ2M可溶表達量為最高，占菌體總可溶蛋白含量的61.7%。繼續升高誘導溫度，可溶表達水平有降低趨勢，所以通過優化確定最佳的誘導溫度為25 ℃。
圖4
誘導溫度對rhβ2M可溶性表達的影響
M：低分子量標準蛋白；1-5：誘導溫度分別為15、20、25、30、37 ℃
Figure4. Effect of temperature on the soluble expression level of rhβ2MM: protein M W marker; 1-5: rhβ2M were induced under 15, 20, 25, 30, 37 ℃, respectively
2.2.3 誘導時間對rhβ2M可溶性表達的影響
對于固定的體系，外源蛋白并非隨誘導時間的增加而不斷產生，誘導時間延長會伴隨著細菌的衰老死亡、次級代謝產物的產生和釋放，不利于外源蛋白的穩定存在。因此需要通過試驗優化來確定最佳誘導時間。在25 ℃，IPTG終濃度為0.8 mmol/L條件下，誘導rhβ2M，并分別對2、4、6、8、12、24 h樣品進行電泳檢測。誘導時間對rhβ2M可溶性表達的影響，結果如圖 5所示，在其他誘導條件相同的情況下，rhβ2M可溶表達量隨著誘導時間的增加，rhβ2M可溶表達量增加，當誘導時間為6 h或時間更長時，rhβ2M可溶表達量趨于穩定，約占菌體總可溶蛋白含量的63.2%。繼續增加誘導時間，未見可溶表達水平提高，所以通過優化確定最佳的誘導時間為6 h。
圖5
誘導時間對rhβ2M可溶性表達的影響
M：低分子量標準蛋白；1-6：誘導時間分別為2、4、6、8、12、24小時
Figure5. Effect of different time on the soluble expression level of rhβ2MLane M: protein M W marker; Lane 1-6: induced time of rhβ2M were 2, 4, 6, 8, 12, 24 h, respectively
2.3 rhβ2M純化結果
在優化確定的rhβ2M表達最佳條件下，擴大培養細菌，誘導劑IPTG添加終濃度為0.8 mmol/L，25℃條件下誘導培養6 h，最后收集菌體，超聲破碎后，取上清純化。rhβ2M純化的SDS-PAGE檢測結果如圖 6所示。凝膠掃描成像Bio-Rad軟件分析顯示rhβ2M表達量可達細菌總蛋白的39.2%，其可溶表達量占菌體總可溶蛋白含量的63.7%。通過Ni親和層析純化后，可獲得純度達95%以上的rhβ2M。
圖6
β2M表達產物及其純化后蛋白的SDS-PAGE分析
M：低分子量標準蛋白；1：未誘導菌體；2：誘導菌體；3：菌體超聲破碎后的可溶蛋白；4-5：純化后rhβ2M
Figure6. SDS-PAGE analysis of rhβ2M products and purified proteinM: protein M W marker; 1: uninduced expression of β2M in
2.4 rhβ2M的Western blot結果
rhβ2M的生物學活性檢測選用鼠/兔抗人β2M單克隆抗體對rhβ2M進行免疫學鑒定。將純化后的rhβ2M和購買的人β2M進行SDS-PAGE，并轉印到硝酸纖維素膜上，進行免疫印跡分析，以人β2M為正對照，結果如圖 7所示。目的蛋白rhβ2M可與鼠/兔抗人β2M單克隆抗體反應，約在30 kD(含標簽的融合蛋白)處出現一條清晰的條帶，大小與SDS-PAGE中檢測的條帶吻合。同時，人β2M在12 KDa附近的單一顯色條帶可以作為陽性對照。以上結果可知：原核表達獲得的rhβ2M可與抗人β2M抗體特異性結合，條帶唯一，特異性良好，具有生物學活性。
圖7
rhβ2M免疫印跡檢測結果
(a)SDS-PAGE檢測結果；(b)一抗1：抗人β2M單克隆抗體(鼠源)；(c)一抗2：抗人β2M單克隆抗體(兔源)。M：預染蛋白標準；1：rhβ2M；2：人β2M
Figure7. Western blot analysis of rhβ2M(a) SDS-PAGE Analysis; (b) primary antibody 1： anti-β2M antibody (mouse monoclonal); (c) primary antibody 2： anti-β2M antibody (rabbit monoclonal). M： protein M W marker； 1： rhβ2M； 2： human β2M
3 討論
基于β2M作為主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ類分子的輕鏈部分[13]，及其在腎臟損傷和某些腫瘤患者臨床檢測中的廣泛應用。獲得高生物活性、高純度的β2M是制備MHC四聚體分子和研發β2M檢測試劑盒所需抗原不可或缺的前提條件。重組表達人β2M的研究已有報道，但是經過原核表達獲得的重組蛋白多為包涵體，構建以可溶形式表達的rhβ2M成為研究的關鍵。本研究通過NCBI數據庫獲得人β2M氨基酸序列，通過對β2M密碼子進行優化，獲得E.coli慣用的密碼子序列，之后化學合成β2M基因序列。選用帶有促溶標簽(硫氧還蛋白融合蛋白和多肽，Trx-tag)的載體pET32a(+)，構建重組質粒pET32a(+)-β2M并轉入BL21(DE3)。該載體在進行基因表達時，硫氧還原蛋白有助于目的蛋白的正確折疊，促進有活性蛋白的產物形成，提高目的蛋白可溶表達量，并可以抵御蛋白酶的降解作用。
研究證實，外源基因在細菌中高效表達，可以通過調節宿主菌生長和代謝與外源基因表達速率之間的關系來實現，因此，對外源蛋白誘導條件的優化成為一個重要環節。外源蛋白表達的常規因素包括誘導劑IPTG濃度、誘導溫度、誘導時間等[14-15]，每個因素的變化均會影響宿主菌的生長代謝和外源蛋白的表達。本研究以rhβ2M可溶表達量來優化誘導條件，在優化過程中發現，誘導溫度變化對rhβ2M可溶表達量有顯著影響；誘導時間不宜過長，rhβ2M可溶表達量趨于穩定即可。在最佳誘導條件下，rhβ2M表達量可達細菌總蛋白的39.2%，可溶蛋白表達量占菌體總可溶蛋白含量的63.7%，實現了人β2M在E.coli中高效地可溶性表達。經過大量發酵培養，Ni2+螯合親和層析柱純化蛋白，其純度可以達95%以上，最終獲得高純度rhβ2M。
生物活性方面，使用免疫學方法Western blot鑒定rhβ2M的抗原特性，以購買的人β2M為對照，該蛋白和構建的rhβ2M均出現單一條帶，且條帶分子量大小正確，說明rhβ2M能與抗人β2M單克隆抗體結合，具有較高特異性，進而證明該蛋白具有抗原的特性，為MHC四聚體分子制備研究以及β2M臨床檢測應用奠定基礎。
