為觀察剪切應力作用下麝香保心丸(SBP)對內皮祖細胞(EPCs)功能及其修復動物血管損傷模型的作用,本實驗采用密度梯度離心法分離傳代培養EPCs,待培養至第三代EPCs細胞貼壁長滿后,加入麝香保心丸干預24 h,再對其施加15 dyne/cm2剪切應力24 h,采用CCK-8法、Edu標記法、黏附實驗、boyden小室實驗及Matrigel法檢測EPCs增殖、黏附、遷移及體外微血管形成功能等指標;Western blot法檢測EPCs內皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表達;同時,建立血管損傷動物模型,分析EPCs細胞移植的血管損傷修復作用。結果顯示,與單純的SBP組比較,剪切應力作用下SBP明顯增強了EPCs細胞的增殖能力、細胞遷移率和黏附能力(P值均<0.01),EPCs的微血管形成功能亦顯著提高(P<0.01);Western blot條帶灰度分析顯示eNOS表達水平明顯升高(P<0.01);動物模型血管切片的免疫熒光染色結果顯示內皮再生率顯著增加。可見,剪切應力作用下麝香保心丸能夠顯著改善EPCs功能,有利于EPCs發揮血管損傷修復作用。
引用本文： 李剛, 陳旸, 吳江. 剪切應力作用下麝香保心丸促內皮祖細胞功能的研究. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(4): 847-853. doi: 10.7507/1001-5515.20150152 復制
引言
成體組織中，內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一種可增殖并分化成熟為血管內皮細胞的前體祖/干細胞[1]，具有修復損傷血管內皮和促進新生血管形成的功能。迄今為止動物研究及臨床前期實驗表明，EPCs能加速受損血管重新內皮化，抑制動脈粥樣硬化進展，提高缺血組織的血管新生能力[2]。現代祖國醫藥復方制劑——麝香保心丸不僅是第一個具有促進缺血心肌血管新生作用的中成藥,也是緩解胸悶胸痛起效最快的中成藥[3]。已有研究表明，麝香保心丸能夠通過改善EPCs功能及分泌一氧化氮(nitric oxide，NO)發揮其促血管形成、改善內皮功能等作用[4]。剪切應力是指在生物體內血流循環過程中血流對血管內皮接觸界面所產生的與血流方向一致的摩擦力，研究表明，剪切應力對EPCs內皮化以及其形態、功能均有一定的調控作用[5]。如果首先采用麝香保心丸改善EPCs功能，促進其分泌NO，在此化學因素的作用下再施加生理狀態下的剪切應力(15 dyne/cm2)，那么能否通過這種化學-力學因素協同干預，進一步促進EPCs的內皮修復功能呢？因此，本研究旨在探討剪切應力聯合麝香保心丸是否能明顯促進EPCs的功能及修復血管損傷的作用。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
實驗雄性SD大鼠，體重100~150 g，SPF級別(四川大學實驗動物中心)。
1.1.2 試劑儀器
麝香保心丸(購自上海和黃藥業有限公司，批號140808)；纖維粘連蛋白(Fibronectin，Fn)、細胞膜染料CM-Dil(購自德國Roche公司)；梯度離心液(Histopaque-1083)(購自美國Sigma公司)；M199培養基(購自美國Gibco公司)；胎牛血清(購自美國Hyclone公司)；血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)(購自美國Invitrogen公司)；Matrigel(購自美國BD公司)；CCK8(DOJINDO，日本)；酶標儀(Gene Company Limited，NO.20043，美國)；CO2培養箱(Thermo，美國)。
1.2 方法
1.2.1 大鼠骨髓EPCs的分離培養
本實驗嚴格按照國際健康機構出版的關于實驗動物的使用和處理指南進行(出版號No.85-23，修改1996)，EPCs分離培養按照文獻報道方法加以改進[2]：采用頸椎脫臼法處死SD大鼠，立即無菌條件下分離大鼠股骨，5 mL注射器吸取1×PBS緩沖液，針頭自干骺端插入骨髓腔，反復沖洗髓腔至白色。收集骨髓細胞沖洗液離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，用含5%胎牛血清的M199培養液重懸細胞沉淀，以1∶1比例輕置于含梯度細胞分離液的離心管中，離心(2 000 r/min，30 min)，巴氏吸管輕輕吸取離心管中間白膜層細胞，加8 mL含5%胎牛血清的M199培養液洗滌2次(1 400 r/min離心5 min)，棄上清，用完全M199培養液(含15%胎牛血清，VEGF 10 μg/L及bFGF 5 μg/L)重懸細胞，將細胞懸液以1×106個/mL密度接種于50 mL培養瓶(預先包被有Fn)，置37 ℃含5% CO2培養箱靜態培養。細胞培養4 d后更換新鮮完全M199培養液，以后每隔3天換一次新鮮完全M199培養液。待細胞生長增殖至培養瓶80%融合時，用0.25%胰酶按照1∶2比例進行細胞傳代。采用傳至第三代的細胞進行EPCs鑒定，流式細胞術檢測vWF、CD31、VEGFR-2和VE-Cadherin特異性抗體陽性的細胞用于后續檢測實驗。
1.2.2 細胞爬片實驗
高壓滅菌后的載玻片置于細胞培養板中，吸取1 mL Fn緩慢覆蓋于載玻片上，37 ℃、5% CO2細胞培養箱中放置60 min，0.25%胰蛋白酶消化晚期EPCs細胞，收集細胞懸液將其均勻種在玻片上，待其長滿約80%時，將其分成4組：未加麝香保心丸和剪切應力的EPCs細胞為對照組(CON組)；加入含麝香保心丸(4 mg/mL)培養基培養24 h，為麝香保心丸組(SBP組)；加入含麝香保心丸(4 mg/mL)培養基培養24 h，然后于剪切應力裝置加載15 dyne/cm2 作用24 h，為剪切應力聯合麝香保心丸組(SS+SBP組)；不加麝香保心丸培養基培養24 h，然后于剪切應力裝置加載15 dyne/cm2 作用24 h，為剪切應力組(SS組)；0.25%胰酶消化收集各組EPCs細胞懸液，進行功能性實驗檢測。
1.2.3 細胞增殖檢測
0.25%胰酶收集4組EPCs細胞，重懸細胞，按照2×104個/mL的細胞密度接種于96孔板內(100 μL/孔)，37 ℃、5% CO2細胞培養箱培養，待細胞生長融合至80%左右，棄去各孔培養基，按照試劑盒說明書，加入CCK-8試劑和培養基的混合液(按1∶10比例)，在培養箱內孵育60 min，利用酶標儀測定各孔在450 nm波長的吸光度，記錄各孔吸光度值。
測定DNA合成是細胞增殖檢測的最準確方法之一，本實驗同時采用EdU法測定細胞增殖：同樣方法收集培養各組EPCs細胞，按照試劑盒說明書，每孔加入100 μL 50 μmol/L EdU培養基孵育2 h，棄培養基，PBS洗細胞1~2次，每次5 min，4%多聚甲醛室溫固定30 min，每孔加入100 μL滲透劑(0.5% TritonX-100的PBS)，孵育10 min，細胞膜通透處理后，每孔加入100 μL的1X Apollo?染色液、避光、孵育30 min后，棄染色反應液。OLYMPUSIX81熒光顯微鏡下對細胞熒光染色結果進行拍照，采用Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics,USA)軟件分析染色強度。
1.2.4 細胞劃痕遷移實驗
收集4組EPCs細胞，按100 μL (2×104個/mL)細胞懸液加入boyden小室的上室，下室加入完全培養基，37 ℃、5% CO2細胞培養箱中8 h，取出濾膜，棉簽擦去未遷移細胞，4%多聚甲醛固定，DAPI染核，熒光顯微鏡下隨機選擇6個視野計數。
1.2.5 細胞黏附實驗
收集4組EPCs細胞，按照2×104個/mL的細胞密度，接種于12孔板(預先包被有Fn)，37 ℃、5% CO2培養箱孵育培養1 h，吸棄培養液，更換PBS液，輕輕反復漂洗3次，每次2 min，置于倒置相差顯微鏡高倍鏡(20×)下，隨機取5個視野，計數每孔貼壁細胞數，表征細胞黏附能力。
1.2.6 體外成血管實驗
按照100 μL/孔基質膠濃度加入96孔板，37 ℃、5% CO2培養箱孵育培養1 h后，收集4組EPCs，以2×104個/mL的細胞密度接種于基質膠，8 h后，倒置顯微鏡下拍照觀察。利用圖像分析軟件Image-Pro Plus (Media Cybernetics,USA)分析形成管腔的數量及面積。
1.2.7 內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)檢測
參照蛋白提取說明書提取EPCs蛋白，采用Western blot法測定eNOS蛋白表達，并分析其灰度值。
1.2.8 大鼠頸動脈損傷模型建立和治療
應用3%戊巴比妥鈉按0.3 mL/100 g麻醉成年SD雄性大鼠(350～400 g)，手術暴露其左側頸動脈。將Forgety2F導管(Edwards Lifesciences，Unterschleissheim，Germany)通過頸外動脈插入頸總動脈，充盈球囊后，左右各轉動3次，損傷頸總動脈。手術結束后，將CM-DIL標記4組EPCs注入損傷部位，一周后，麻醉并處死大鼠，分離頸動脈，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照，計算修復面積比。
1.2.9 統計學處理
實驗數據以均數±標準差表示，采用SPSS 13.0進行統計分析。組間差異采用單因素方差分析，P<0.05認為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs增殖能力的影響
如圖 1所示，分別以EdU標記法(a、b)和CCK-8(c)檢測細胞增殖，未施加剪切應力干預時，SBP組EPCS增殖能力明顯強于CON組(P<0.01)；施加剪切應力干預后，SS+SBP組EPCs增殖能力則明顯強于SS組(P<0.01)和SBP組(P<0.01)。
圖1
剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs增殖能力的影響
(a),(b) EdU法測定細胞增殖結果；(c) CCK-8檢測結果
Figure1. Effects of shear stress combined with SBP on promoting EPCs proliferation(a),(b) EdU assay; (c) CCK-8 assay
2.2 剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs遷移能力的影響
如圖 2所示，未施加剪切應力時，SBP組遷移能力強于CON組，差異具有統計學意義(P<0.01)；施加剪切應力干預后，SS+SBP組EPCs遷移能力要強于SS組(P<0.01)和SBP組(P<0.05)，差異均具有統計學意義。
圖2
剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs遷移能力的影響
Figure2.
Effects of shear stress combined with SBP on promoting EPCs migration
2.3 剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs黏附能力的影響
如圖 3所示，未施加剪切應力時，SBP組黏附能力強于CON組，差異具有統計學意義(P<0.01)；施加剪切應力干預后，SS+SBP組EPCs黏附能力要強于SS組(P<0.01)和SBP組(P<0.05)，差異均具有統計學意義。
圖3
剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs黏附能力的影響
Figure3.
Effects of shear stress combined with SBP on promoting EPCs adhesion
2.4 剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs體外微血管形成能力影響
體外成血管實驗顯示，4組細胞均可在基質膠中形成官腔清晰、樹枝樣的微血管，如圖 4所示。未施加剪切應力時，CON組管腔數量少，但較為粗大；SBP組管腔數量多，細胞連接較為緊密；施加剪切應力干預后，SS+SBP組形成的微血管管腔較粗大，細胞連接比較緊密，管腔數量較多。圖像及統計學分析結果提示，SS+SBP組微血管的長度(P<0.01)和面積值(P<0.01)均明顯高于SS組。
圖4
剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs體外微血管形成能力的影響
(a)兩組微血管形成圖像采集結果；(b)管腔長度；(c)管腔面積
Figure4. Effects of shear stress combined with SBP on promoting EPCs angiogenesis in vitro assay(a) EPCs angiogenesis in vitro assay; (b) length of complete tube; (c) area of complete tube
2.5 剪切應力聯合麝香保心丸對eNOS表達的影響
如圖 5所示，未施加剪切應力時，SBP組eNOS表達量明顯高于CON組，差異具有統計學意義(P<0.01)；相較于SBP組和SS組，SS+SBP組eNOS表達量也明顯增加，組間比較，差異均具有統計學意義(P<0.01，P<0.01)。
圖5
剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs eNOS蛋白表達的影響
(a)電泳結果;(b)分析結果
Figure5. Effects of shear stress combined with SBP on promoting eNOS protein level of EPCs(a) eNOS protein gel electrophoresis image; (b) gel electrophoresis assay
2.6 剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs血管損傷修復作用的影響
實驗結果顯示，球囊擴張后，相比于CON組，各實驗組標本可見不同程度的內膜增厚，血管腔面凹凸不平，如圖 6(a)所示。圖像分析結果顯示，SBP組內膜面積高于CON組(P<0.05)，施加剪切應力干預后，SS+SBP組內膜面積高于SS組(P<0.05)；CM-Dil標記的EPCs在SS+SBP組受損頸動脈的分布面積要大于SS組(P<0.01)，如圖 6(b)所示，表明SS+SBP組EPCs的再內皮化強于SS組。
圖6
剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs血管損傷修復作用的影響
(a)血管切片免疫熒光染色結果(紅色熒光示CM-Dil標記的EPCs);(b)分析結果
Figure6. Effects of Shear stress combined with SBP on promoting EPCs to repair vascular injury(a) immunofluorescence dyeing of vascular sections (red fluorescent display CM-Dil labeled EPCs); (b) assay result
3 討論
血管內皮損傷是心血管疾病如動脈粥樣硬化、高血壓等發病的共同病理生理基礎，血管內皮功能損傷被認為是動脈粥樣硬化形成早期的始動環節，損傷血管內皮局部趨化炎性細胞，造成血管壁硬化及再狹窄，使得血管內皮細胞修復障礙；同時，動脈粥樣硬化患者外周血中EPCs細胞數量減少，EPCs功能障礙(包括細胞增殖、遷移、黏附及微血管形成能力下降等)，提示EPCs修復血管內皮損傷能力降低。因此，如何重建損傷血管內皮功能、促進EPCs內皮修復功能是防治心血管損傷性疾病的難題。近年來，祖國醫學在抑制血管炎癥、重建內皮功能、促進血管新生等方面取得了一定進展。麝香保心丸是以麝香、人參提取物、牛黃、肉桂等為組方的一種中藥復方制劑，其有效中藥成分如麝香酮、人參皂苷及其他萜類等發揮重要的藥理作用，起到擴張動脈、降低血液粘稠度、強心以及改善血液微循環等功能[6]。研究表明，麝香保心丸可促進EPCs的增殖、遷移、黏附和體外微血管形成，呈現劑量效應；且麝香保心丸能夠促進eNOS基因表達、提高NO的分泌水平，進而起到保護血管內皮的作用[7-8]。動脈粥樣硬化發生的重要因素之一為NO釋放功能障礙導致內皮依賴性的舒血管反應降低，麝香保心丸改善高脂模型動物EPCs功能并促進分泌NO，從而發揮擴張冠脈、改善內皮功能、促進血管新生等作用[9]。
血管內皮細胞襯于血管壁的內表面，在血管內的機械應力反應對血管內皮功能具有重要意義，而作為血管內皮細胞的前體細胞，EPCs同樣受到流體剪切應力的作用[10]。研究證實，麝香保心丸可以增加EPCs數量[7]，而麝香保心丸在改善EPCs功能的同時勢必也會受到血管內流體剪切應力的作用。Yang等[11]對頸動脈內膜剝落的裸鼠注射15 dyn/cm2的層流剪切應力預處理的EPCs，熒光檢測顯示，移植的EPCs結合到動脈的損傷部位，剪切應力增強了在EPCs在損傷部位再內膜化的能力，并且可以在一定程度恢復老齡化導致的EPCs內膜化功能降低。本研究發現，麝香保心丸預處理后，剪切應力明顯增強EPCs增殖、遷移、黏附和體外成血管能力，動物損傷修復模型研究顯示，剪切應力干預后，EPCs修復內皮損傷周期縮短，擴散面積增加，進一步改善內皮功能，促進血管形成。本研究Western blot結果顯示，eNOS蛋白表達水平明顯增強，提示麝香保心丸預處理后，剪切應力作用可促進NO分泌，從而顯著增加EPCs數量并改善其增殖、黏附、遷移和體外微血管形成能力。
綜上所述，本研究證實，麝香保心丸預處理后，剪切應力能夠顯著改善EPCs功能并促進其分泌NO，有利于EPCs發揮血管損傷修復作用。當然，究竟是麝香保心丸還是剪切應力在促EPCs功能方面起著主導作用，二者之間是否具有協同或疊加效應，以及作用的具體分子機制，仍有待于我們通過進一步深入研究來闡明。
引言
成體組織中，內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一種可增殖并分化成熟為血管內皮細胞的前體祖/干細胞[1]，具有修復損傷血管內皮和促進新生血管形成的功能。迄今為止動物研究及臨床前期實驗表明，EPCs能加速受損血管重新內皮化，抑制動脈粥樣硬化進展，提高缺血組織的血管新生能力[2]。現代祖國醫藥復方制劑——麝香保心丸不僅是第一個具有促進缺血心肌血管新生作用的中成藥,也是緩解胸悶胸痛起效最快的中成藥[3]。已有研究表明，麝香保心丸能夠通過改善EPCs功能及分泌一氧化氮(nitric oxide，NO)發揮其促血管形成、改善內皮功能等作用[4]。剪切應力是指在生物體內血流循環過程中血流對血管內皮接觸界面所產生的與血流方向一致的摩擦力，研究表明，剪切應力對EPCs內皮化以及其形態、功能均有一定的調控作用[5]。如果首先采用麝香保心丸改善EPCs功能，促進其分泌NO，在此化學因素的作用下再施加生理狀態下的剪切應力(15 dyne/cm2)，那么能否通過這種化學-力學因素協同干預，進一步促進EPCs的內皮修復功能呢？因此，本研究旨在探討剪切應力聯合麝香保心丸是否能明顯促進EPCs的功能及修復血管損傷的作用。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
實驗雄性SD大鼠，體重100~150 g，SPF級別(四川大學實驗動物中心)。
1.1.2 試劑儀器
麝香保心丸(購自上海和黃藥業有限公司，批號140808)；纖維粘連蛋白(Fibronectin，Fn)、細胞膜染料CM-Dil(購自德國Roche公司)；梯度離心液(Histopaque-1083)(購自美國Sigma公司)；M199培養基(購自美國Gibco公司)；胎牛血清(購自美國Hyclone公司)；血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)(購自美國Invitrogen公司)；Matrigel(購自美國BD公司)；CCK8(DOJINDO，日本)；酶標儀(Gene Company Limited，NO.20043，美國)；CO2培養箱(Thermo，美國)。
1.2 方法
1.2.1 大鼠骨髓EPCs的分離培養
本實驗嚴格按照國際健康機構出版的關于實驗動物的使用和處理指南進行(出版號No.85-23，修改1996)，EPCs分離培養按照文獻報道方法加以改進[2]：采用頸椎脫臼法處死SD大鼠，立即無菌條件下分離大鼠股骨，5 mL注射器吸取1×PBS緩沖液，針頭自干骺端插入骨髓腔，反復沖洗髓腔至白色。收集骨髓細胞沖洗液離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，用含5%胎牛血清的M199培養液重懸細胞沉淀，以1∶1比例輕置于含梯度細胞分離液的離心管中，離心(2 000 r/min，30 min)，巴氏吸管輕輕吸取離心管中間白膜層細胞，加8 mL含5%胎牛血清的M199培養液洗滌2次(1 400 r/min離心5 min)，棄上清，用完全M199培養液(含15%胎牛血清，VEGF 10 μg/L及bFGF 5 μg/L)重懸細胞，將細胞懸液以1×106個/mL密度接種于50 mL培養瓶(預先包被有Fn)，置37 ℃含5% CO2培養箱靜態培養。細胞培養4 d后更換新鮮完全M199培養液，以后每隔3天換一次新鮮完全M199培養液。待細胞生長增殖至培養瓶80%融合時，用0.25%胰酶按照1∶2比例進行細胞傳代。采用傳至第三代的細胞進行EPCs鑒定，流式細胞術檢測vWF、CD31、VEGFR-2和VE-Cadherin特異性抗體陽性的細胞用于后續檢測實驗。
1.2.2 細胞爬片實驗
高壓滅菌后的載玻片置于細胞培養板中，吸取1 mL Fn緩慢覆蓋于載玻片上，37 ℃、5% CO2細胞培養箱中放置60 min，0.25%胰蛋白酶消化晚期EPCs細胞，收集細胞懸液將其均勻種在玻片上，待其長滿約80%時，將其分成4組：未加麝香保心丸和剪切應力的EPCs細胞為對照組(CON組)；加入含麝香保心丸(4 mg/mL)培養基培養24 h，為麝香保心丸組(SBP組)；加入含麝香保心丸(4 mg/mL)培養基培養24 h，然后于剪切應力裝置加載15 dyne/cm2 作用24 h，為剪切應力聯合麝香保心丸組(SS+SBP組)；不加麝香保心丸培養基培養24 h，然后于剪切應力裝置加載15 dyne/cm2 作用24 h，為剪切應力組(SS組)；0.25%胰酶消化收集各組EPCs細胞懸液，進行功能性實驗檢測。
1.2.3 細胞增殖檢測
0.25%胰酶收集4組EPCs細胞，重懸細胞，按照2×104個/mL的細胞密度接種于96孔板內(100 μL/孔)，37 ℃、5% CO2細胞培養箱培養，待細胞生長融合至80%左右，棄去各孔培養基，按照試劑盒說明書，加入CCK-8試劑和培養基的混合液(按1∶10比例)，在培養箱內孵育60 min，利用酶標儀測定各孔在450 nm波長的吸光度，記錄各孔吸光度值。
測定DNA合成是細胞增殖檢測的最準確方法之一，本實驗同時采用EdU法測定細胞增殖：同樣方法收集培養各組EPCs細胞，按照試劑盒說明書，每孔加入100 μL 50 μmol/L EdU培養基孵育2 h，棄培養基，PBS洗細胞1~2次，每次5 min，4%多聚甲醛室溫固定30 min，每孔加入100 μL滲透劑(0.5% TritonX-100的PBS)，孵育10 min，細胞膜通透處理后，每孔加入100 μL的1X Apollo?染色液、避光、孵育30 min后，棄染色反應液。OLYMPUSIX81熒光顯微鏡下對細胞熒光染色結果進行拍照，采用Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics,USA)軟件分析染色強度。
1.2.4 細胞劃痕遷移實驗
收集4組EPCs細胞，按100 μL (2×104個/mL)細胞懸液加入boyden小室的上室，下室加入完全培養基，37 ℃、5% CO2細胞培養箱中8 h，取出濾膜，棉簽擦去未遷移細胞，4%多聚甲醛固定，DAPI染核，熒光顯微鏡下隨機選擇6個視野計數。
1.2.5 細胞黏附實驗
收集4組EPCs細胞，按照2×104個/mL的細胞密度，接種于12孔板(預先包被有Fn)，37 ℃、5% CO2培養箱孵育培養1 h，吸棄培養液，更換PBS液，輕輕反復漂洗3次，每次2 min，置于倒置相差顯微鏡高倍鏡(20×)下，隨機取5個視野，計數每孔貼壁細胞數，表征細胞黏附能力。
1.2.6 體外成血管實驗
按照100 μL/孔基質膠濃度加入96孔板，37 ℃、5% CO2培養箱孵育培養1 h后，收集4組EPCs，以2×104個/mL的細胞密度接種于基質膠，8 h后，倒置顯微鏡下拍照觀察。利用圖像分析軟件Image-Pro Plus (Media Cybernetics,USA)分析形成管腔的數量及面積。
1.2.7 內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)檢測
參照蛋白提取說明書提取EPCs蛋白，采用Western blot法測定eNOS蛋白表達，并分析其灰度值。
1.2.8 大鼠頸動脈損傷模型建立和治療
應用3%戊巴比妥鈉按0.3 mL/100 g麻醉成年SD雄性大鼠(350～400 g)，手術暴露其左側頸動脈。將Forgety2F導管(Edwards Lifesciences，Unterschleissheim，Germany)通過頸外動脈插入頸總動脈，充盈球囊后，左右各轉動3次，損傷頸總動脈。手術結束后，將CM-DIL標記4組EPCs注入損傷部位，一周后，麻醉并處死大鼠，分離頸動脈，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照，計算修復面積比。
1.2.9 統計學處理
實驗數據以均數±標準差表示，采用SPSS 13.0進行統計分析。組間差異采用單因素方差分析，P<0.05認為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs增殖能力的影響
如圖 1所示，分別以EdU標記法(a、b)和CCK-8(c)檢測細胞增殖，未施加剪切應力干預時，SBP組EPCS增殖能力明顯強于CON組(P<0.01)；施加剪切應力干預后，SS+SBP組EPCs增殖能力則明顯強于SS組(P<0.01)和SBP組(P<0.01)。
圖1
剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs增殖能力的影響
(a),(b) EdU法測定細胞增殖結果；(c) CCK-8檢測結果
Figure1. Effects of shear stress combined with SBP on promoting EPCs proliferation(a),(b) EdU assay; (c) CCK-8 assay
2.2 剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs遷移能力的影響
如圖 2所示，未施加剪切應力時，SBP組遷移能力強于CON組，差異具有統計學意義(P<0.01)；施加剪切應力干預后，SS+SBP組EPCs遷移能力要強于SS組(P<0.01)和SBP組(P<0.05)，差異均具有統計學意義。
圖2
剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs遷移能力的影響
Figure2.
Effects of shear stress combined with SBP on promoting EPCs migration
2.3 剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs黏附能力的影響
如圖 3所示，未施加剪切應力時，SBP組黏附能力強于CON組，差異具有統計學意義(P<0.01)；施加剪切應力干預后，SS+SBP組EPCs黏附能力要強于SS組(P<0.01)和SBP組(P<0.05)，差異均具有統計學意義。
圖3
剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs黏附能力的影響
Figure3.
Effects of shear stress combined with SBP on promoting EPCs adhesion
2.4 剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs體外微血管形成能力影響
體外成血管實驗顯示，4組細胞均可在基質膠中形成官腔清晰、樹枝樣的微血管，如圖 4所示。未施加剪切應力時，CON組管腔數量少，但較為粗大；SBP組管腔數量多，細胞連接較為緊密；施加剪切應力干預后，SS+SBP組形成的微血管管腔較粗大，細胞連接比較緊密，管腔數量較多。圖像及統計學分析結果提示，SS+SBP組微血管的長度(P<0.01)和面積值(P<0.01)均明顯高于SS組。
圖4
剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs體外微血管形成能力的影響
(a)兩組微血管形成圖像采集結果；(b)管腔長度；(c)管腔面積
Figure4. Effects of shear stress combined with SBP on promoting EPCs angiogenesis in vitro assay(a) EPCs angiogenesis in vitro assay; (b) length of complete tube; (c) area of complete tube
2.5 剪切應力聯合麝香保心丸對eNOS表達的影響
如圖 5所示，未施加剪切應力時，SBP組eNOS表達量明顯高于CON組，差異具有統計學意義(P<0.01)；相較于SBP組和SS組，SS+SBP組eNOS表達量也明顯增加，組間比較，差異均具有統計學意義(P<0.01，P<0.01)。
圖5
剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs eNOS蛋白表達的影響
(a)電泳結果;(b)分析結果
Figure5. Effects of shear stress combined with SBP on promoting eNOS protein level of EPCs(a) eNOS protein gel electrophoresis image; (b) gel electrophoresis assay
2.6 剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs血管損傷修復作用的影響
實驗結果顯示，球囊擴張后，相比于CON組，各實驗組標本可見不同程度的內膜增厚，血管腔面凹凸不平，如圖 6(a)所示。圖像分析結果顯示，SBP組內膜面積高于CON組(P<0.05)，施加剪切應力干預后，SS+SBP組內膜面積高于SS組(P<0.05)；CM-Dil標記的EPCs在SS+SBP組受損頸動脈的分布面積要大于SS組(P<0.01)，如圖 6(b)所示，表明SS+SBP組EPCs的再內皮化強于SS組。
圖6
剪切應力聯合麝香保心丸對EPCs血管損傷修復作用的影響
(a)血管切片免疫熒光染色結果(紅色熒光示CM-Dil標記的EPCs);(b)分析結果
Figure6. Effects of Shear stress combined with SBP on promoting EPCs to repair vascular injury(a) immunofluorescence dyeing of vascular sections (red fluorescent display CM-Dil labeled EPCs); (b) assay result
3 討論
血管內皮損傷是心血管疾病如動脈粥樣硬化、高血壓等發病的共同病理生理基礎，血管內皮功能損傷被認為是動脈粥樣硬化形成早期的始動環節，損傷血管內皮局部趨化炎性細胞，造成血管壁硬化及再狹窄，使得血管內皮細胞修復障礙；同時，動脈粥樣硬化患者外周血中EPCs細胞數量減少，EPCs功能障礙(包括細胞增殖、遷移、黏附及微血管形成能力下降等)，提示EPCs修復血管內皮損傷能力降低。因此，如何重建損傷血管內皮功能、促進EPCs內皮修復功能是防治心血管損傷性疾病的難題。近年來，祖國醫學在抑制血管炎癥、重建內皮功能、促進血管新生等方面取得了一定進展。麝香保心丸是以麝香、人參提取物、牛黃、肉桂等為組方的一種中藥復方制劑，其有效中藥成分如麝香酮、人參皂苷及其他萜類等發揮重要的藥理作用，起到擴張動脈、降低血液粘稠度、強心以及改善血液微循環等功能[6]。研究表明，麝香保心丸可促進EPCs的增殖、遷移、黏附和體外微血管形成，呈現劑量效應；且麝香保心丸能夠促進eNOS基因表達、提高NO的分泌水平，進而起到保護血管內皮的作用[7-8]。動脈粥樣硬化發生的重要因素之一為NO釋放功能障礙導致內皮依賴性的舒血管反應降低，麝香保心丸改善高脂模型動物EPCs功能并促進分泌NO，從而發揮擴張冠脈、改善內皮功能、促進血管新生等作用[9]。
血管內皮細胞襯于血管壁的內表面，在血管內的機械應力反應對血管內皮功能具有重要意義，而作為血管內皮細胞的前體細胞，EPCs同樣受到流體剪切應力的作用[10]。研究證實，麝香保心丸可以增加EPCs數量[7]，而麝香保心丸在改善EPCs功能的同時勢必也會受到血管內流體剪切應力的作用。Yang等[11]對頸動脈內膜剝落的裸鼠注射15 dyn/cm2的層流剪切應力預處理的EPCs，熒光檢測顯示，移植的EPCs結合到動脈的損傷部位，剪切應力增強了在EPCs在損傷部位再內膜化的能力，并且可以在一定程度恢復老齡化導致的EPCs內膜化功能降低。本研究發現，麝香保心丸預處理后，剪切應力明顯增強EPCs增殖、遷移、黏附和體外成血管能力，動物損傷修復模型研究顯示，剪切應力干預后，EPCs修復內皮損傷周期縮短，擴散面積增加，進一步改善內皮功能，促進血管形成。本研究Western blot結果顯示，eNOS蛋白表達水平明顯增強，提示麝香保心丸預處理后，剪切應力作用可促進NO分泌，從而顯著增加EPCs數量并改善其增殖、黏附、遷移和體外微血管形成能力。
綜上所述，本研究證實，麝香保心丸預處理后，剪切應力能夠顯著改善EPCs功能并促進其分泌NO，有利于EPCs發揮血管損傷修復作用。當然，究竟是麝香保心丸還是剪切應力在促EPCs功能方面起著主導作用，二者之間是否具有協同或疊加效應，以及作用的具體分子機制，仍有待于我們通過進一步深入研究來闡明。
