Wnt信號通路的異常激活與腫瘤的發生密切相關,T細胞因子4(Tcf4)和β連環蛋白(β-catenin)是該通路中重要的信號傳遞因子。本文應用免疫組織化學染色檢測97例結直腸癌組織和40例正常黏膜組織中Tcf4、β-catenin和Wnt信號通路抑制因子分泌型卷曲相關蛋白1(SFRP1)的表達關系,探討其臨床意義及與預后的關系。結果顯示:在結直腸癌中,Tcf4及β-catenin異位表達顯著高于正常黏膜組織(P<0.01),SFRP1表達顯著低于正常黏膜組織(P<0.01);結直腸癌中SFRP1的表達與Tcf4和β-catenin異位表達呈負相關(r=－0.599,P<0.01;r=－0.250,P<0.05);Tcf4和β-catenin異位表達均與淋巴結轉移和Dukes分期有關(P<0.05),SFRP1表達與與腫瘤浸潤深度有關(P<0.05);Kaplan-Meier生存分析表明,Tcf4和β-catenin異位表達的患者生存率明顯低于陰性者(P<0.01),而SFRP1陽性表達的患者生存率明顯高于陰性者(P<0.01);多因素分析表明β-catenin異位表達和SFRP1的表達及Dukes分期是影響結直腸癌患者預后的獨立因素(P<0.05)。結果提示在結直腸癌中Wnt信號通路因子Tcf4和β-catenin異位表達,可能與SFRP1的表達下調或缺失有關;β-catenin在細胞核內積聚與Tcf4形成復合體是維持結直腸癌惡性表型的重要分子開關;三者聯合檢測可能對結直腸癌的進展及預后判斷有著重要意義,并為結直腸癌的基因治療提供新的分子靶點。
引用本文： 歐玉榮, 景桂英, 劉娟, 高杉, 承澤農, 董修芹. Wnt信號通路T細胞因子4、β-catenin與SFRP1在結直腸癌中表達及預后關系. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(4): 854-861. doi: 10.7507/1001-5515.20150153 復制
引言
目前結直腸癌已成為世界第三大常見的惡性腫瘤，近年來由于飲食結構、生活習慣和環境的改變，加上缺乏運動，在我國大腸癌的發病率也逐年上升。通過對散發性和遺傳性結直腸癌的研究顯示，Wnt信號傳導通路在其中扮演著核心的角色。β-catenin是此通路中重要的信號傳遞因子，也是重要的樞紐因子。Wnt信號通路可以通過發揮抑制細胞質內GSK-3β、Axin和APC的相互作用，防止細胞質內的β-catenin被降解，使穩定的β-catenin能夠轉移到細胞核內，與核內轉錄因子T細胞因子/淋巴細胞增強因子(T cell transcriptional factor/ lymphid enhancer factor,Tcf/Lef)結合，誘導多種相關靶基因的轉錄，從而控制胚胎發育及細胞生長、分化及凋亡等。目前研究認為，該Wnt信號通路的異常與結腸癌發生發展密切相關[1-2]，大約90%以上的結直腸癌存在Wnt/β-catenin信號轉導通路的異常激活[3]。T細胞因子4(T cell factor 4,Tcf4)是Tcf家族在人正常結腸上皮唯一表達的重要成員，Tcf4 mRNA也是在所有結腸癌細胞系中表達最強烈的，說明Tcf4基因在結腸癌的發生發展中起重要作用[4]。Tcf4/β-catenin復合體及下游靶基因的激活轉錄是結直腸癌細胞惡性轉化的一個標志[5]。作為Wnt信號通路中的分子開關[6-7],在調控細胞癌變過程中有雙重效應,Tcf4既能通過抑制細胞過度生長、防止腫瘤發生,又可促進細胞增殖分化。因而Wnt信號通過Tcf4的開關狀態不僅調控機體的生長、發育、分化等基本生理功能，還可對腫瘤的發生進行調控。
分泌型卷曲相關蛋白1(secreted frizzled related protein 1,SFRP1)是新近發現的與腫瘤發生相關的一個重要基因，被認為是一種抑癌基因[8]，它通過干擾Wnt糖蛋白(配體)與Frizzled受體間的相互作用而阻斷Wnt信號通路，是Wnt信號通路的負調控因子。研究發現[9]，SFRP1在結直腸腫瘤中mRNA表達水平下調，且由正常腸黏膜→腺瘤→結直腸癌下調水平呈上升趨勢，提示SFRP1作為Wnt通路的拮抗劑對防止結直腸腫瘤的發生、發展起一定作用。目前國內外關于SFRP1與Tcf4/β-catenin復合體在惡性腫瘤中的研究報道均較少，本實驗檢測97例結直腸癌及相應40例正常組織中Tcf4、β-catenin及SFRP1的表達情況，并分析其與結直腸癌患者臨床病理因素的關系，探討其在結直腸癌發生、發展中的作用及其預后關系。
1 材料與方法
1.1 研究對象和標本來源
收集蚌埠醫學院第一附屬醫院2005年1月－2006年12月，經手術切除的存檔石蠟包埋結直腸癌組織標本97例和及相對應正常結直腸黏膜組織40例(所有患者術前均未給予放療、化療及免疫治療，術后均經常規組織病理證實)，所有病例均有完整的臨床、病理及隨訪資料。所選病例隨訪至患者死亡或截止至2012年12月，隨訪時間為8～96個月。所有病例均無遺傳性結直腸腫瘤病史。97例患者年齡23~80歲，中位年齡60歲。其中男56例,女41例；結腸癌38例，直腸癌59例；按全國結直腸癌病理研究規范分類Dukes分期：A+B期58例、C+D期39例。組織分化程度：高分化腺癌24例、中分化腺癌48例、低分化腺癌25例。本研究信息采集得到了患者的知情同意，同時獲得了蚌埠醫學院附屬第一醫院倫理委員會批準。
1.2 主要試劑
兔抗人Tcf4單克隆抗體(克隆號：EP2033Y，濃縮型，工作濃度為1∶100)及兔抗人SFRP1多克隆抗體(濃縮型，工作濃度為1∶50)購自abcam公司(美國)；鼠抗人β-catenin單克隆抗體(即用型)及ElivisionTM plus KIT-9903(A、B)檢測試劑盒、DAB(二氨基聯本胺)顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發有限公司。
1.3 免疫組化染色方法
免疫組化ElivisionTM plus兩步法按試劑盒說明書操作,高壓鍋煮沸抗原修復。PBS代替一抗作陰性對照,用已知相應蛋白陽性切片作陽性對照。
1.4 結果判斷
1.4.1 Tcf4染色結果判定
Tcf4陽性物質定位于細胞核，呈黃色或棕黃色反應。染色結果判斷標準參照Zhang等[10]方法，按陽性細胞數所占百分率和腫瘤細胞著色強度綜合判定，兩者相乘，0～1分為陰性(－)；≥2分為陽性(+)。
1.4.2 β-catenin
以細胞內出現棕黃色顆粒為陽性標志，陽性物質定位于細胞膜、細胞質和(或)細胞核，染色結果判斷標準參照Maruyama等[11]的方法。①細胞膜染色結果判定：>70%的細胞膜出現陽性表達為正常表達，反之為膜表達缺失；②細胞質和(或)細胞核染色結果判定：>10%的細胞出現陽性表達。細胞膜表達缺失及>10%細胞質和(或)細胞核陽性表達均為異位表達。
1.4.3 SFRP1
陽性反應定位于細胞膜和細胞質，呈棕黃色顆粒。染色結果判斷標準參照Lee等[12]綜合計分法,按陽性著色細胞所占百分數與細胞著色強度兩者結合起來計算，兩者相加，≤2分為陰性(－)，≥3為陽性(+)。
1.5 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件，分析Tcf4、β-catenin和SFRP1在各組間表達率的比較及臨床病理預后因素的關系采用χ2檢驗，等級資料兩變量相關關系采用Spearman相關分析。Kaplan-Meier和log-rank法分析三者表達陽性組與陰性組生存率差異，Cox多因素分析三者與臨床病理因素及預后之間的關系，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 Tcf4、β-catenin和SFRP1在結直腸癌及癌旁正常黏膜組織中的表達
Tcf4主要表達于正常腸隱窩的頂端，位于細胞核，如圖 1(a)所示，結直腸癌中Tcf4主要在細胞核表達，如圖 1(b)所示，細胞膜及細胞質未見表達。Tcf4在結直腸癌及癌旁正常黏膜組織中的陽性表達率分別為81.44%(79/97)和30.00%(12/40)，兩組間差異有統計學意義(P<0.01)；SFRP1如圖 1(c)、(d)所示在結直腸癌及癌旁正常黏膜組織中的陽性表達率分別為30.93%(30/97)和75.00%(30/40)，兩組間差異有統計學意義(P<0.01)；β-catenin在正常結直腸黏膜中幾乎全部定位于細胞膜，如圖 2(a)所示，極少數有細胞質表達，未見細胞核表達，而在結直腸癌中出現不同程度的細胞膜表達缺失及細胞質和(或)細胞核異位表達，如圖 2(b)、(c)、(d)所示，β-catenin在結直腸癌和癌旁正常黏膜組織中的異位表達率分別為73.20%(71/97)和2.50%(1/40)，兩組間差異有統計學意義(P<0.01)。
圖1
Tcf4和SFRP1在正常腸黏膜及結直腸癌中的表達(ElivisionTM×400)
(a)正常黏膜中Tcf4蛋白表達；(b)結直腸癌組織中Tcf4蛋白表達；(c)正常黏膜中SFRP1表達；(d)結直腸癌組織中SFRP1表達
Figure1. Expression of Tcf4 and SFRP1 in normal mucosa and colorectal carcinoma (ElivisionTM)(a) Tcf4 positive expression in normal mucosa; (b) Tcf4 positive expression in colorectal carcinoma; (c) SFRP1 positive expression in normal mucosa; (d) SFRP1 positive expression in colorectal carcinoma
圖2
正常黏膜及結直腸癌組織中β-catenin表達(ElivisionTM×400)
(a)正常黏膜細胞膜表達；(b)癌組織細胞膜表達；(c)癌組織細胞膜表達缺失；(d)癌組織胞質及胞核表達
Figure2. Expression of β-catenin in normal mucosa and colorectal carcinoma(ElivisionTM×400)(a) membranous expression in normal mucosa; (b) membranous expression in colorectal carcinoma; (c) reduced membranous expression in colorectal carcinoma; (d) cytoplasmic and nuclear expression in colorectal carcinoma
2.2 Tcf4、β-catenin和SFRP1在結直腸癌中表達的關系
在97例結直腸癌中，應用Spearman相關分析發現：79例Tcf4陽性表達中，出現63例β-catenin異位表達，經Spearman相關分析發現Tcf4與β-catenin異位表達之間呈正相關關系，而SFRP1與Tcf4和β-catenin異位表達間均存在負相關關系，如表 1所示。
表1
結直腸癌中Tcf4、β-catenin和SFRP1表達的關系
Table1.
The relationship between Tcf4,β-catenin and SFRP1 expression in colorectal carcinoma
2.3 Tcf4、β-catenin和SFRP1表達與結直腸癌臨床病理特征的關系
Tcf4表達與腫瘤的浸潤深度、組織分化程度、淋巴結轉移和Dukes分期有關(P<0.05)，與其它臨床病理因素無關。β-catenin異位表達與腫瘤的淋巴結轉移、遠處轉移和Dukes分期有關(P<0.05)。SFRP1表達與腫瘤的浸潤深度有關，而與其它臨床病理因素均無關(P>0.05)，如表 2所示。
表2
Tcf4、β-catenin和SFRP1表達與結直腸癌臨床病理特征的關系
Table2.
The relationship between Tcf4,β-catenin and SFRP1 expression and clinicopathological factors
2.4 多因素預后分析
將患者性別(男與女)、年齡(>60歲組與≤60歲組)、腫瘤大小(>5.0 cm組與≤5.0 cm組)、浸潤深度(漿/外膜內浸潤組與漿/外膜外浸潤組)、分化程度(高分化組與中低分化組)、淋巴結轉移(轉移組與無轉移組)、遠處轉移(轉移組與無轉移組)、Dukes分期(A+B組與C+D組)、Tcf4表達(陰性組與陽性組)、β-catenin異位表達(陰性組與陽性組)和SFRP1表達(陰性組與陽性組)等因素引入Cox模型進行多因素預后分析，結果顯示SFRP1和β-catenin異位表達水平及Dukes分期是影響結直腸癌患者預后的獨立因素(P<0.05，如表 3所示)。
表3
97例結直腸癌患者Cox多因素分析
Table3.
Multivariate survival analysis of 97 patients with colorectal carcinoma
2.5 患者生存分析
在隨訪的97例結直腸癌患者中,5年總體生存率為46.39%(45/97)。Kaplan-Meier分析顯示Tcf4蛋白表達陰性組與陽性組患者生存率存在差異(Log-rank=12.114，P=0.001)，Tcf4陰性組中位生存時間78.6月，5年生存率為83.33%(15/18)；Tcf4表達陽性組中位生存時間49.9月，5年生存率為37.97%(30/79)。Log-rank分析β-catenin異位表達陰性組與陽性組患者生存率存在差異(Log-rank=10.235，P=0.001)，β-catenin異位表達陰性組中位生存時間70.6月，5年生存率為69.23%(18/26)，β-catenin異位表達陽性組中位生存時間49.6月，5年生存率為38.03%(27/71)。SFRP1表達陽性組與陰性組患者生存率存在差異(Log-rank=21.477，P<0.001)，SFRP1表達陰性組中位生存時間為46.1月，5年生存率為29.85%(20/67)；陽性組中位生存時間為76.5月,5年生存率為83.33%(25/30)。各組患者生存曲線如圖 3所示。
圖3
各組結直腸癌患者生存曲線
Figure3.
Survival curves of colorectal carcinoma patients in different groups
3 討論
Wnt信號通路是一個復雜的調控網絡，一般提到Wnt信號通路主要指的是由β-catenin介導的經典Wnt信號通路，該通路中β-catenin是重要信號傳遞子和樞紐因子。正常細胞內大量的β-catenin與細胞膜黏附蛋白E-cadherin及α-catenin結合形成復合體，參與細胞間的黏附調控，防止細胞發生轉移；少部分游離的β-catenin在胞漿內被其降解復合體磷酸化后由泛素蛋白酶體識別并使之降解，以維持細胞內β-catenin的低水平狀態，使核內轉錄因子處于阻抑狀態[13]。激活后的Wnt途徑可使GSK-3β/Axin/APC復合體磷酸化而防止β-catenin被降解，穩定的β-catenin能夠轉移到細胞核內，與核內轉錄因子Tcf/Lef靶基因結合，誘導多種Tcf/Lef因子相關基因的轉錄，如細胞周期和凋亡相關基因c-myc和細胞周期蛋白D1(cyclinD1)，血管內皮生長因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)，參與腫瘤進展的基因基質金屬蛋白酶7(matrix metalloprotease7,MMP7)、MMP26和黏附因子CD44等，進而對人體正常細胞增殖起到調整促進作用[14]。異常Wnt信號通路致癌的關鍵就在于游離型β-catenin在細胞內的異位表達及Tcf/Lef依賴性靶基因的激活。顯然β-catenin在這條信號通路中扮演著極其重要的角色，是整條通路的關鍵樞紐分子。因此，β-catenin由胞漿向胞核的轉移被認為是該信號通路被激活后行使其功能的重要特征[15]，該信號通路的異常與結腸癌發生發展密切相關。
Tcf最初被確定為T和B淋巴細胞特異性轉錄因子，近年來研究證實其在腫瘤的發生、發展中發揮重要的作用[16]。Tcf家族包括Tcf1、Lef-1、Tcf3及Tcf4，研究認為Tcf4在結腸癌中呈高表達[4, 17]。Tcf4蛋白結構域的N端具有β-catenin結合結構域(β-catenin binding domain,CBD),研究表明Tcf4是具有雙向調節功能的轉錄因子[18]，當Wnt信號通路激活時，游離的β-catenin在細胞質內穩定、積累及進入細胞核，與Tcf4形成復合體激活下游靶癌基因；而在無Wnt信號時，Tcf4通過與多種抑制蛋白相互作用，特異性結合Wnt信號通路下游靶基因，保持靶基因關閉，發揮阻礙作用。因此，Tcf4/β-catenin復合體及下游靶基因的激活轉錄是結直腸癌細胞惡性轉化的重要標志，也是Wnt信號傳遞的重要步驟[5, 17]。本實驗研究發現，在正常大腸黏膜上皮細胞中β-catenin呈膜完整性表達，而在結直腸癌中出現不同程度細胞膜表達缺失或細胞質和細胞核的異位表達，經統計兩者的表達差異均有統計學意義(P<0.01)，可以推測在結直腸癌的發生發展中Wnt信號通路可能處于激活狀態。本研究觀察在正常大腸黏膜上皮中，Tcf4在腸隱窩頂端上皮細胞核中表達最高，到腸絨毛表達逐步下降，在結直腸癌細胞中呈現細胞核高表達。分析Tcf4表達與β-catenin異位表達的關系，發現79例Tcf4表達的結直腸癌組織中，63例呈現β-catenin的異位表達，提示Tcf4表達與β-catenin異位表達存在顯著的相關性(r=0.310,P=0.002)。本研究發現，Tcf4表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及Dukes分期相關，與Wang等[19]研究具有一致性；β-catenin異位表達與淋巴結轉移、遠處轉移及Dukes分期相關。本實驗研究提示Tcf4蛋白表達與β-catenin異位表達參與了結直腸癌的侵襲、轉移過程，是結直腸癌高侵襲性、高增殖活性及轉移潛能的因素之一。
在Wnt信號通路中，Frz胞外的N端有一個富含半胱氨酸的結構域(cysteine rich domain,CRD)，能與Wnt糖蛋白結合。SFRP結構上與Frz受體具有30%~50%相同序列的CRD，可與Frz結合或形成無功能復合物抑制Frz受體而抑制Wnt信號通路的活動。SFRP是Wnt信號上游抑制基因，而SFRP基因啟動子的甲基化或缺失導致基因表達下調或沉默后，對Wnt信號通路的抑制作用減弱，使Wnt信號通路持續存在，從而促進腫瘤的形成與發展，可見SFRP是Wnt途徑的負性調節因子。SFRP1是一種分泌性糖蛋白，是SFRPs家族重要成員之一。近年的研究表明，SFRP1通過啟動子的甲基化而失活[8, 20-21]，是一種新的腫瘤抑制基因。研究認為，當結直腸癌細胞中SFRP1功能重新恢復時，SFRP1不僅能減少Wnt信號通路的活動，且能減少Wnt信號通路下游突變的發生，從而抑制腫瘤進展。本實驗檢測97例結直腸癌及40例相應的癌旁組織中SFRP1的表達情況，結果顯示SFRP1在結直腸癌組織中的表達顯著低于正常大腸黏膜組織(P<0.01)，提示SFRP1可能在抑制大腸細胞惡性轉化和異常增生中發揮著重要作用。SFRP1在結直腸癌中表達降低，可能與其啟動子甲基化導致SFRP1基因的轉錄表達受到抑制有關，關于SFRP1基因啟動子甲基化水平情況，將在我們后續實驗中繼續研究。本研究觀察SFRP1表達與Tcf4和β-catenin異位表達的關系，發現SFRP1表達下調的結直腸癌組織中，Tcf4和β-catenin異位表達明顯增高，經Spearman相關分析發現SFRP1與Tcf4和β-catenin異位表達間均存在負相關關系(r=－0.60,P<0.01；r=－0.57，P<0.01)，提示SFRP1表達缺失可能是引起β-catenin異位表達，形成β-Catenin/Tcf4蛋白復合體的機制之一，并可能通過Wnt/β-catenin信號通路的活化參與結直腸癌的發生。通過多因素分析顯示，SFRP1和β-catenin異位表達及Dukes分期是結直腸癌根治后患者的獨立預后因素。進一步生存分析顯示，Tcf4和β-catenin異位表達與患者低生存率有關，而SFRP1陽性組5年生存率則顯著高于陰性組，提示SFRP1作為Wnt通路抑制基因在結直腸癌組織中表達下調，可能引起Wnt通路激活，導致在結直腸癌組織中β-catenin異位表達、Tcf4出現高表達，促進了結直腸癌的發生、發展。如果能夠恢復SFRP1的表達，來拮抗Wnt/β-catenin信號通路，或開發針對β-catenin結合位點的生物小肽，競爭性抑制Tcf4/β-catenin復合體形成，從而阻斷Wnt下游靶基因的傳導，將會為結直腸癌的治療開辟新的途徑。
引言
目前結直腸癌已成為世界第三大常見的惡性腫瘤，近年來由于飲食結構、生活習慣和環境的改變，加上缺乏運動，在我國大腸癌的發病率也逐年上升。通過對散發性和遺傳性結直腸癌的研究顯示，Wnt信號傳導通路在其中扮演著核心的角色。β-catenin是此通路中重要的信號傳遞因子，也是重要的樞紐因子。Wnt信號通路可以通過發揮抑制細胞質內GSK-3β、Axin和APC的相互作用，防止細胞質內的β-catenin被降解，使穩定的β-catenin能夠轉移到細胞核內，與核內轉錄因子T細胞因子/淋巴細胞增強因子(T cell transcriptional factor/ lymphid enhancer factor,Tcf/Lef)結合，誘導多種相關靶基因的轉錄，從而控制胚胎發育及細胞生長、分化及凋亡等。目前研究認為，該Wnt信號通路的異常與結腸癌發生發展密切相關[1-2]，大約90%以上的結直腸癌存在Wnt/β-catenin信號轉導通路的異常激活[3]。T細胞因子4(T cell factor 4,Tcf4)是Tcf家族在人正常結腸上皮唯一表達的重要成員，Tcf4 mRNA也是在所有結腸癌細胞系中表達最強烈的，說明Tcf4基因在結腸癌的發生發展中起重要作用[4]。Tcf4/β-catenin復合體及下游靶基因的激活轉錄是結直腸癌細胞惡性轉化的一個標志[5]。作為Wnt信號通路中的分子開關[6-7],在調控細胞癌變過程中有雙重效應,Tcf4既能通過抑制細胞過度生長、防止腫瘤發生,又可促進細胞增殖分化。因而Wnt信號通過Tcf4的開關狀態不僅調控機體的生長、發育、分化等基本生理功能，還可對腫瘤的發生進行調控。
分泌型卷曲相關蛋白1(secreted frizzled related protein 1,SFRP1)是新近發現的與腫瘤發生相關的一個重要基因，被認為是一種抑癌基因[8]，它通過干擾Wnt糖蛋白(配體)與Frizzled受體間的相互作用而阻斷Wnt信號通路，是Wnt信號通路的負調控因子。研究發現[9]，SFRP1在結直腸腫瘤中mRNA表達水平下調，且由正常腸黏膜→腺瘤→結直腸癌下調水平呈上升趨勢，提示SFRP1作為Wnt通路的拮抗劑對防止結直腸腫瘤的發生、發展起一定作用。目前國內外關于SFRP1與Tcf4/β-catenin復合體在惡性腫瘤中的研究報道均較少，本實驗檢測97例結直腸癌及相應40例正常組織中Tcf4、β-catenin及SFRP1的表達情況，并分析其與結直腸癌患者臨床病理因素的關系，探討其在結直腸癌發生、發展中的作用及其預后關系。
1 材料與方法
1.1 研究對象和標本來源
收集蚌埠醫學院第一附屬醫院2005年1月－2006年12月，經手術切除的存檔石蠟包埋結直腸癌組織標本97例和及相對應正常結直腸黏膜組織40例(所有患者術前均未給予放療、化療及免疫治療，術后均經常規組織病理證實)，所有病例均有完整的臨床、病理及隨訪資料。所選病例隨訪至患者死亡或截止至2012年12月，隨訪時間為8～96個月。所有病例均無遺傳性結直腸腫瘤病史。97例患者年齡23~80歲，中位年齡60歲。其中男56例,女41例；結腸癌38例，直腸癌59例；按全國結直腸癌病理研究規范分類Dukes分期：A+B期58例、C+D期39例。組織分化程度：高分化腺癌24例、中分化腺癌48例、低分化腺癌25例。本研究信息采集得到了患者的知情同意，同時獲得了蚌埠醫學院附屬第一醫院倫理委員會批準。
1.2 主要試劑
兔抗人Tcf4單克隆抗體(克隆號：EP2033Y，濃縮型，工作濃度為1∶100)及兔抗人SFRP1多克隆抗體(濃縮型，工作濃度為1∶50)購自abcam公司(美國)；鼠抗人β-catenin單克隆抗體(即用型)及ElivisionTM plus KIT-9903(A、B)檢測試劑盒、DAB(二氨基聯本胺)顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發有限公司。
1.3 免疫組化染色方法
免疫組化ElivisionTM plus兩步法按試劑盒說明書操作,高壓鍋煮沸抗原修復。PBS代替一抗作陰性對照,用已知相應蛋白陽性切片作陽性對照。
1.4 結果判斷
1.4.1 Tcf4染色結果判定
Tcf4陽性物質定位于細胞核，呈黃色或棕黃色反應。染色結果判斷標準參照Zhang等[10]方法，按陽性細胞數所占百分率和腫瘤細胞著色強度綜合判定，兩者相乘，0～1分為陰性(－)；≥2分為陽性(+)。
1.4.2 β-catenin
以細胞內出現棕黃色顆粒為陽性標志，陽性物質定位于細胞膜、細胞質和(或)細胞核，染色結果判斷標準參照Maruyama等[11]的方法。①細胞膜染色結果判定：>70%的細胞膜出現陽性表達為正常表達，反之為膜表達缺失；②細胞質和(或)細胞核染色結果判定：>10%的細胞出現陽性表達。細胞膜表達缺失及>10%細胞質和(或)細胞核陽性表達均為異位表達。
1.4.3 SFRP1
陽性反應定位于細胞膜和細胞質，呈棕黃色顆粒。染色結果判斷標準參照Lee等[12]綜合計分法,按陽性著色細胞所占百分數與細胞著色強度兩者結合起來計算，兩者相加，≤2分為陰性(－)，≥3為陽性(+)。
1.5 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件，分析Tcf4、β-catenin和SFRP1在各組間表達率的比較及臨床病理預后因素的關系采用χ2檢驗，等級資料兩變量相關關系采用Spearman相關分析。Kaplan-Meier和log-rank法分析三者表達陽性組與陰性組生存率差異，Cox多因素分析三者與臨床病理因素及預后之間的關系，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 Tcf4、β-catenin和SFRP1在結直腸癌及癌旁正常黏膜組織中的表達
Tcf4主要表達于正常腸隱窩的頂端，位于細胞核，如圖 1(a)所示，結直腸癌中Tcf4主要在細胞核表達，如圖 1(b)所示，細胞膜及細胞質未見表達。Tcf4在結直腸癌及癌旁正常黏膜組織中的陽性表達率分別為81.44%(79/97)和30.00%(12/40)，兩組間差異有統計學意義(P<0.01)；SFRP1如圖 1(c)、(d)所示在結直腸癌及癌旁正常黏膜組織中的陽性表達率分別為30.93%(30/97)和75.00%(30/40)，兩組間差異有統計學意義(P<0.01)；β-catenin在正常結直腸黏膜中幾乎全部定位于細胞膜，如圖 2(a)所示，極少數有細胞質表達，未見細胞核表達，而在結直腸癌中出現不同程度的細胞膜表達缺失及細胞質和(或)細胞核異位表達，如圖 2(b)、(c)、(d)所示，β-catenin在結直腸癌和癌旁正常黏膜組織中的異位表達率分別為73.20%(71/97)和2.50%(1/40)，兩組間差異有統計學意義(P<0.01)。
圖1
Tcf4和SFRP1在正常腸黏膜及結直腸癌中的表達(ElivisionTM×400)
(a)正常黏膜中Tcf4蛋白表達；(b)結直腸癌組織中Tcf4蛋白表達；(c)正常黏膜中SFRP1表達；(d)結直腸癌組織中SFRP1表達
Figure1. Expression of Tcf4 and SFRP1 in normal mucosa and colorectal carcinoma (ElivisionTM)(a) Tcf4 positive expression in normal mucosa; (b) Tcf4 positive expression in colorectal carcinoma; (c) SFRP1 positive expression in normal mucosa; (d) SFRP1 positive expression in colorectal carcinoma
圖2
正常黏膜及結直腸癌組織中β-catenin表達(ElivisionTM×400)
(a)正常黏膜細胞膜表達；(b)癌組織細胞膜表達；(c)癌組織細胞膜表達缺失；(d)癌組織胞質及胞核表達
Figure2. Expression of β-catenin in normal mucosa and colorectal carcinoma(ElivisionTM×400)(a) membranous expression in normal mucosa; (b) membranous expression in colorectal carcinoma; (c) reduced membranous expression in colorectal carcinoma; (d) cytoplasmic and nuclear expression in colorectal carcinoma
2.2 Tcf4、β-catenin和SFRP1在結直腸癌中表達的關系
在97例結直腸癌中，應用Spearman相關分析發現：79例Tcf4陽性表達中，出現63例β-catenin異位表達，經Spearman相關分析發現Tcf4與β-catenin異位表達之間呈正相關關系，而SFRP1與Tcf4和β-catenin異位表達間均存在負相關關系，如表 1所示。
表1
結直腸癌中Tcf4、β-catenin和SFRP1表達的關系
Table1.
The relationship between Tcf4,β-catenin and SFRP1 expression in colorectal carcinoma
2.3 Tcf4、β-catenin和SFRP1表達與結直腸癌臨床病理特征的關系
Tcf4表達與腫瘤的浸潤深度、組織分化程度、淋巴結轉移和Dukes分期有關(P<0.05)，與其它臨床病理因素無關。β-catenin異位表達與腫瘤的淋巴結轉移、遠處轉移和Dukes分期有關(P<0.05)。SFRP1表達與腫瘤的浸潤深度有關，而與其它臨床病理因素均無關(P>0.05)，如表 2所示。
表2
Tcf4、β-catenin和SFRP1表達與結直腸癌臨床病理特征的關系
Table2.
The relationship between Tcf4,β-catenin and SFRP1 expression and clinicopathological factors
2.4 多因素預后分析
將患者性別(男與女)、年齡(>60歲組與≤60歲組)、腫瘤大小(>5.0 cm組與≤5.0 cm組)、浸潤深度(漿/外膜內浸潤組與漿/外膜外浸潤組)、分化程度(高分化組與中低分化組)、淋巴結轉移(轉移組與無轉移組)、遠處轉移(轉移組與無轉移組)、Dukes分期(A+B組與C+D組)、Tcf4表達(陰性組與陽性組)、β-catenin異位表達(陰性組與陽性組)和SFRP1表達(陰性組與陽性組)等因素引入Cox模型進行多因素預后分析，結果顯示SFRP1和β-catenin異位表達水平及Dukes分期是影響結直腸癌患者預后的獨立因素(P<0.05，如表 3所示)。
表3
97例結直腸癌患者Cox多因素分析
Table3.
Multivariate survival analysis of 97 patients with colorectal carcinoma
2.5 患者生存分析
在隨訪的97例結直腸癌患者中,5年總體生存率為46.39%(45/97)。Kaplan-Meier分析顯示Tcf4蛋白表達陰性組與陽性組患者生存率存在差異(Log-rank=12.114，P=0.001)，Tcf4陰性組中位生存時間78.6月，5年生存率為83.33%(15/18)；Tcf4表達陽性組中位生存時間49.9月，5年生存率為37.97%(30/79)。Log-rank分析β-catenin異位表達陰性組與陽性組患者生存率存在差異(Log-rank=10.235，P=0.001)，β-catenin異位表達陰性組中位生存時間70.6月，5年生存率為69.23%(18/26)，β-catenin異位表達陽性組中位生存時間49.6月，5年生存率為38.03%(27/71)。SFRP1表達陽性組與陰性組患者生存率存在差異(Log-rank=21.477，P<0.001)，SFRP1表達陰性組中位生存時間為46.1月，5年生存率為29.85%(20/67)；陽性組中位生存時間為76.5月,5年生存率為83.33%(25/30)。各組患者生存曲線如圖 3所示。
圖3
各組結直腸癌患者生存曲線
Figure3.
Survival curves of colorectal carcinoma patients in different groups
3 討論
Wnt信號通路是一個復雜的調控網絡，一般提到Wnt信號通路主要指的是由β-catenin介導的經典Wnt信號通路，該通路中β-catenin是重要信號傳遞子和樞紐因子。正常細胞內大量的β-catenin與細胞膜黏附蛋白E-cadherin及α-catenin結合形成復合體，參與細胞間的黏附調控，防止細胞發生轉移；少部分游離的β-catenin在胞漿內被其降解復合體磷酸化后由泛素蛋白酶體識別并使之降解，以維持細胞內β-catenin的低水平狀態，使核內轉錄因子處于阻抑狀態[13]。激活后的Wnt途徑可使GSK-3β/Axin/APC復合體磷酸化而防止β-catenin被降解，穩定的β-catenin能夠轉移到細胞核內，與核內轉錄因子Tcf/Lef靶基因結合，誘導多種Tcf/Lef因子相關基因的轉錄，如細胞周期和凋亡相關基因c-myc和細胞周期蛋白D1(cyclinD1)，血管內皮生長因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)，參與腫瘤進展的基因基質金屬蛋白酶7(matrix metalloprotease7,MMP7)、MMP26和黏附因子CD44等，進而對人體正常細胞增殖起到調整促進作用[14]。異常Wnt信號通路致癌的關鍵就在于游離型β-catenin在細胞內的異位表達及Tcf/Lef依賴性靶基因的激活。顯然β-catenin在這條信號通路中扮演著極其重要的角色，是整條通路的關鍵樞紐分子。因此，β-catenin由胞漿向胞核的轉移被認為是該信號通路被激活后行使其功能的重要特征[15]，該信號通路的異常與結腸癌發生發展密切相關。
Tcf最初被確定為T和B淋巴細胞特異性轉錄因子，近年來研究證實其在腫瘤的發生、發展中發揮重要的作用[16]。Tcf家族包括Tcf1、Lef-1、Tcf3及Tcf4，研究認為Tcf4在結腸癌中呈高表達[4, 17]。Tcf4蛋白結構域的N端具有β-catenin結合結構域(β-catenin binding domain,CBD),研究表明Tcf4是具有雙向調節功能的轉錄因子[18]，當Wnt信號通路激活時，游離的β-catenin在細胞質內穩定、積累及進入細胞核，與Tcf4形成復合體激活下游靶癌基因；而在無Wnt信號時，Tcf4通過與多種抑制蛋白相互作用，特異性結合Wnt信號通路下游靶基因，保持靶基因關閉，發揮阻礙作用。因此，Tcf4/β-catenin復合體及下游靶基因的激活轉錄是結直腸癌細胞惡性轉化的重要標志，也是Wnt信號傳遞的重要步驟[5, 17]。本實驗研究發現，在正常大腸黏膜上皮細胞中β-catenin呈膜完整性表達，而在結直腸癌中出現不同程度細胞膜表達缺失或細胞質和細胞核的異位表達，經統計兩者的表達差異均有統計學意義(P<0.01)，可以推測在結直腸癌的發生發展中Wnt信號通路可能處于激活狀態。本研究觀察在正常大腸黏膜上皮中，Tcf4在腸隱窩頂端上皮細胞核中表達最高，到腸絨毛表達逐步下降，在結直腸癌細胞中呈現細胞核高表達。分析Tcf4表達與β-catenin異位表達的關系，發現79例Tcf4表達的結直腸癌組織中，63例呈現β-catenin的異位表達，提示Tcf4表達與β-catenin異位表達存在顯著的相關性(r=0.310,P=0.002)。本研究發現，Tcf4表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及Dukes分期相關，與Wang等[19]研究具有一致性；β-catenin異位表達與淋巴結轉移、遠處轉移及Dukes分期相關。本實驗研究提示Tcf4蛋白表達與β-catenin異位表達參與了結直腸癌的侵襲、轉移過程，是結直腸癌高侵襲性、高增殖活性及轉移潛能的因素之一。
在Wnt信號通路中，Frz胞外的N端有一個富含半胱氨酸的結構域(cysteine rich domain,CRD)，能與Wnt糖蛋白結合。SFRP結構上與Frz受體具有30%~50%相同序列的CRD，可與Frz結合或形成無功能復合物抑制Frz受體而抑制Wnt信號通路的活動。SFRP是Wnt信號上游抑制基因，而SFRP基因啟動子的甲基化或缺失導致基因表達下調或沉默后，對Wnt信號通路的抑制作用減弱，使Wnt信號通路持續存在，從而促進腫瘤的形成與發展，可見SFRP是Wnt途徑的負性調節因子。SFRP1是一種分泌性糖蛋白，是SFRPs家族重要成員之一。近年的研究表明，SFRP1通過啟動子的甲基化而失活[8, 20-21]，是一種新的腫瘤抑制基因。研究認為，當結直腸癌細胞中SFRP1功能重新恢復時，SFRP1不僅能減少Wnt信號通路的活動，且能減少Wnt信號通路下游突變的發生，從而抑制腫瘤進展。本實驗檢測97例結直腸癌及40例相應的癌旁組織中SFRP1的表達情況，結果顯示SFRP1在結直腸癌組織中的表達顯著低于正常大腸黏膜組織(P<0.01)，提示SFRP1可能在抑制大腸細胞惡性轉化和異常增生中發揮著重要作用。SFRP1在結直腸癌中表達降低，可能與其啟動子甲基化導致SFRP1基因的轉錄表達受到抑制有關，關于SFRP1基因啟動子甲基化水平情況，將在我們后續實驗中繼續研究。本研究觀察SFRP1表達與Tcf4和β-catenin異位表達的關系，發現SFRP1表達下調的結直腸癌組織中，Tcf4和β-catenin異位表達明顯增高，經Spearman相關分析發現SFRP1與Tcf4和β-catenin異位表達間均存在負相關關系(r=－0.60,P<0.01；r=－0.57，P<0.01)，提示SFRP1表達缺失可能是引起β-catenin異位表達，形成β-Catenin/Tcf4蛋白復合體的機制之一，并可能通過Wnt/β-catenin信號通路的活化參與結直腸癌的發生。通過多因素分析顯示，SFRP1和β-catenin異位表達及Dukes分期是結直腸癌根治后患者的獨立預后因素。進一步生存分析顯示，Tcf4和β-catenin異位表達與患者低生存率有關，而SFRP1陽性組5年生存率則顯著高于陰性組，提示SFRP1作為Wnt通路抑制基因在結直腸癌組織中表達下調，可能引起Wnt通路激活，導致在結直腸癌組織中β-catenin異位表達、Tcf4出現高表達，促進了結直腸癌的發生、發展。如果能夠恢復SFRP1的表達，來拮抗Wnt/β-catenin信號通路，或開發針對β-catenin結合位點的生物小肽，競爭性抑制Tcf4/β-catenin復合體形成，從而阻斷Wnt下游靶基因的傳導，將會為結直腸癌的治療開辟新的途徑。
