本研究目的為構建攜帶針對大鼠環磷酸腺苷反應元件結合因子的結合蛋白(CBP)基因的siRNA重組慢病毒,感染原代海馬神經元并檢測其對乙酰化組蛋白表達的抑制作用。本文構建了4種siCBP,并檢測其對神經元中CBP表達的抑制作用,選擇效果最好的一種檢測神經元中HAT活性及乙酰化組蛋白Ac-H3、Ac-H4的表達。酶切及測序鑒定證實siCBP正確克隆至慢病毒質粒中,4種siCBP感染原代海馬神經元后CBP mRNA和蛋白表達有不同程度降低,效果最佳的GR806對神經元的HAT活性及Ac-H3、Ac-H4表達均有顯著抑制作用。本研究為后續應用siCBP闡明CBP依賴的組蛋白乙酰化對海馬區學習記憶功能調節的相關分子機制提供了實驗工具。
引用本文： 侯娜麗, 吳小鳳, 任蘭, 郭敏, 畢楊, 劉友學, 陳潔, 黃鴻眉, 李廷玉. siCBP慢病毒降低大鼠原代海馬神經元乙酰化組蛋白表達. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(4): 838-846. doi: 10.7507/1001-5515.20150151 復制
引言
組蛋白是真核生物染色體的基本結構蛋白，有五種類型：H1、H2A、H2B、H3、H4，它們富含帶正電荷的堿性氨基酸，能夠同DNA中帶負電荷的磷酸基團相互作用。每個組蛋白都有進化上保守的N端拖尾伸出核小體外，這些拖尾是許多信號通路的靶點，從而引起轉錄后修飾。該類修飾最常見的為組蛋白N端賴氨酸殘基的乙酰化修飾，這種修飾是在組蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferases,HATs)和去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)的作用下保持著動態平衡，并與染色質的轉錄活性狀態密切相關[1]。組蛋白乙酰化修飾在神經發育過程中扮演著重要角色，HATs/HDACs表達變化所致的組蛋白乙酰化修飾的異常可影響正常神經發育過程[2]。環磷酸腺苷反應元件結合因子的結合蛋白(CREB binding protein,CBP)是細胞中最常見的一種組蛋白乙酰轉移酶，具有HAT活性，能顯著提高組蛋白的乙酰化水平，HAT活性水平及組蛋白表達水平的降低會顯著抑制學習記憶等相關功能基因的表達，最終影響學習記憶等功能[3]。近年來關于表觀遺傳因素與神經精神病癥的研究廣泛開展，甚至認為CBP可能成為認知或神經退行性疾病的潛在治療靶點，進一步探明CBP相關信號與諸多影響因素的具體作用方式成為將來研究的重點[4]。我們的前期研究也表明大鼠體內海馬區CBP及乙酰化組蛋白表達的降低與學習記憶功能的下降密切相關，而這種組蛋白乙酰化水平及學習記憶能力的降低是否由CBP特異性介導尚不清楚，并且其在具體的病理生理狀態下受到哪些信號通路的調節及具體分子機制有待進一步探討。體外培養原代海馬神經元并對其進行相應干預是模擬體內變化以及研究神經元相關信號調節分子機制的重要手段，因此在體外培養原代海馬神經元的基礎上研究CBP特異性的信號變化，將有助于進一步揭示學習記憶功能障礙中CBP依賴的乙酰化組蛋白表達的相關因素及具體調控機制，為改善學習記憶功能提供新的思考方向。
沉默靶基因是研究分子信號通路的一種重要途徑。慢病毒是逆轉錄病毒的一種，具有逆轉錄病毒的基本結構和特征。利用慢病毒載體構建的shRNA表達載體，可以代替瞬時表達載體使用，并且經過包裝系統包裝后，感染的細胞種類更廣，可用于感染傳統轉染試劑難以轉染的細胞如原代細胞、懸浮細胞等，基因沉默的效果更好、更穩定，轉染效率更高，持續時間更長，因而應用更為廣泛。原代神經元屬非分裂期、難以轉染且對毒性反應敏感度非常高的細胞，而本研究擬進行CBP及其下游蛋白表達變化的檢測，所需作用時間相對較長，由于慢病毒載體免疫反應小，不容易導致細胞死亡，滴度更高，整合到基因組中能實現長時間的基因表達，因此能很好地滿足本實驗要求。本研究旨在通過構建siCBP篩選CBP基因RNAi的有效靶序列，感染原代海馬神經元后，檢測其對原代海馬神經元中乙酰化組蛋白表達的抑制效果，為進一步研究CBP介導的組蛋白乙酰化修飾在原代海馬神經元中對學習記憶相關上下游信號調節的具體分子機制提供有利工具。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
SPF級Wistar大鼠，雌、雄2∶1合籠。孕17~18 d胎鼠，雌雄不限，由重慶醫科大學兒童醫院動物中心提供。
1.2 主要材料
pLKD.UbiC.GFP.U6.shRNA載體、Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切(紐恩(上海))；Taq酶和dNTP、DH5a感受態細胞、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DL 2000 DNA Marker(TaKaRa)；T4 DNA連接酶、內切酶(NEB)；小抽試劑盒(Promega)；250 bp DNA ladder plus(捷瑞)；1 kb DNA ladder Marker(Fermentas)。4對RNAi及對照引物序列(上海英駿)，陽性克隆測序、GAPDH、CBP引物合成(北京華大基因)。DMEM/F12培養基、胰酶、neurobasal培養基、B27、L-谷氨酰胺、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、馬血清(horse serum,HS) (Gibco)，青/鏈霉素雙抗(Sigma)；293T細胞由本實驗室保存，DMEM培養基為本研究所配制。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天)，RT-PCR、real-time PCR試劑盒(TaKaRa)；RNA提取試劑盒、蛋白RIPA裂解液和蛋白定量試劑盒(百泰克)；核蛋白提取試劑盒(Invent Biotechnologies)，HAT活性檢測試劑盒(Biovision)。CBP一抗(Cell Signaling)、Ac-H3、Ac-H4一抗(Millipore)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、核蛋白內參LaminB一抗(Abcam)；鼠抗兔綠色熒光二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc)，HRP標記的羊抗兔、羊抗小鼠二抗(中杉金橋)，4＇,6＇-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Sigma)。
1.3 儀器
Bio-Rad梯度PCR儀、定量PCR儀、電泳儀、轉膜儀，G:Box凝膠成像系統、Sigma高速冷凍離心機、Sigma恒溫細胞培養箱、尼康倒置熒光顯微鏡、Eppendorf移液器等。
1.4 細胞培養及鑒定
1.4.1 大鼠原代海馬神經元的培養
將6孔板用多聚賴氨酸鋪板后，取孕17~18 d胎鼠，5%乙醇消毒后斷頭取腦，鈍性分離迅速取出海馬組織，輕輕剔除腦膜及血管后置于冰DMEM液中清洗2次。將海馬組織剪成約1 mm3小塊(以上操作在冰上進行)，轉入含10% HS、5% FBS及含1/100的青/鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基中。用巴氏吸管反復輕輕吹打，200目不銹鋼篩網過濾。取少量細胞懸液，血球計數板計數，以1.5×106個/孔密度種植于包被過多聚賴氨酸的6孔板內，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養。12 h后將培養液全部換成含0.5 mmol/L谷氨酰胺、2% B27的無血清neurobasal培養基，每3天半量換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。
1.4.2 NSE免疫熒光鑒定神經元純度
將原代神經元接種于預先用蓋玻片鋪底的6孔板內，于培養的第7天，吸棄培養基，甲醇∶冰乙酸(3∶1)－20 ℃固定，PBS清洗后5％胎牛血清白蛋白封閉；再次PBS洗滌后加入含0.2% Triton X-100的兔抗大鼠NSE抗體稀釋液(稀釋比為1/500)，4 ℃過夜；次日PBS洗滌后加入小鼠抗兔綠色熒光二抗，室溫避光孵育1 h；PBS洗滌后DAPI復染胞核，熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機取5個視野，攝像后利用SPOT3.4軟件計算每個視野中NSE表達陽性細胞數占該視野總細胞數的比例即為神經元純度。
1.5 實驗方法
1.5.1 CBP 基因RNA 干擾慢病毒載體制備及陽性克隆鑒定
目的基因Crebbp(NM_133381)即CBP靶基因序列，針對靶點合成的4對含干擾序列的DNA oligo，均委托紐恩(上海)生物科技有限公司設計，如表 1所示。DNA oligo(內含酶切位點)經退火形成雙鏈DNA，與經Age Ⅰ和EcoR I雙酶切后的pLKD.UbiC.GFP.U6.shRNA載體連接。經連接反應后，立刻轉化或凍存于-20℃以后轉化。將連接好的產物轉入細菌感受態細胞，用抗生素抗性篩選。挑取重組陽性克隆行PCR鑒定并行DNA測序。PCR鑒定陽性克隆的引物為：Primer(+)：5＇-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3＇；Primer (-)：5＇-TTCGTCTGACGTGGCAGCGCT-3＇。陽性條帶為380 bp、空載對照條帶為344 bp，PCR鑒定出的陽性重組子進一步測序，采用DNAStar的MegAlign軟件對插入片段與測序結果進行比對驗證，從而篩選出構建成功的siCBP慢病毒載體。對照序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT，在NCBI數據庫中，該對照序列只和斑馬魚的兩個基因有連續16個堿基的同源性，除此以外，該序列和基因組中的任何序列沒有連續16個堿基的同源性，因此可用做普適型陰性對照。對照克隆構建過程同干擾載體構建。
表1
大鼠CBP的siRNA序列
Table1.
Sequences of siRNA for rat CBP
1.5.2 慢病毒包裝及其滴度測定
培養293T細胞株(20代以下)(DMEM+10% FBS+1%的青/鏈霉素)作為包裝細胞，待細胞融合度約為70%~80%后，將細胞分到12個150 mm培養皿中，每瓶加入約8×106個細胞。24 h后，細胞融合度為30%~40%，在每個培養瓶中添加氯喹，使其終濃度為25 μmol/L。取一個50 mL離心管，加入31.56 mL滅菌水、4.44 mL 2 mol/L的CaCl2、252 μg載體質粒、168 μg psPAX2包裝質粒和84 g VSV-G表達質粒pMD2.G(使用Qiagen Maxiprep進行高純度無內毒素抽提)，充分混勻后，將轉染液分別滴加至含氯喹的293T細胞中，每個培養皿加6 mL，繼續培養過夜。第2天更換新鮮的DMEM完全培養基，繼續培養48~50 h。轉染2~3 d后重組病毒顆粒包裝完成，并分泌到培養上清中。此時觀察轉染效果，即觀察細胞的熒光感染率。收集所有培養上清，500 g室溫離心10 min，除去細胞和大的碎片，再用0.45 μm濾膜過濾上清液。接著使用超速離心機100 000 g離心2 h，去掉上清，200 μL DMEM或 Opti-MEME溶解沉淀，并用0.22 μm濾膜過濾獲得的病毒，除去大的顆粒雜質，分裝后保存于－80℃。采用相對定量PCR的方法測定測試細胞中的病毒基因組的整合數，根據病毒加入的體積、感染時的細胞量從而推斷原始的病毒滴度，將收集到的濃縮病毒原做梯度稀釋(10至106倍)分組后感染293T細胞，用熒光鏡觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表達，測定并標定病毒滴度。按照公式計算滴度(integration units per mL,IU/mL)：IU/mL=(C·2N·D·1000)/V，C為每個基因組中整合的病毒數，2N為感染時基因組數(每個孔大約有2×105，故大約對應4×105的基因組)，D為病毒稀釋倍數，V為每孔中加入的病毒體積，不同濃度梯度的病毒測試結果取平均值。
1.5.3 siCBP對原代海馬神經元中CBP基因及蛋白表達的抑制效率
培養生長狀態良好的原代神經元，在培養的第6天，用獲得的4種siCBP分別進行感染，同時設置空載病毒對照組。感染3 d后熒光顯微鏡下觀察慢病毒上報告基因GFP表達情況，感染24 h采用real time-PCR的方法檢測CBP的mRNA表達情況。總RNA抽提、RNA逆轉錄獲得cDNA根據TaKaRa公司的試劑盒操作說明書進行。PCR擴增參數：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環；65 ℃ 30 s，每次在延伸階段讀取吸光值，制作溶解曲線，每次real time-PCR對照組和siCBP實驗組分別設置3個復孔，實驗重復兩次，進一步對兩組各6個數據進行統計分析，CBP及GAPDH內參引物如表 2所示；提取各組細胞的蛋白質，等量上樣，同時加蛋白質分子量標準作標識，6% SDS-PAGE凝膠電泳，按標準條帶位置分離目的蛋白后轉膜，封閉、洗膜后加入一抗(CBP稀釋比為1/500，LaminB稀釋比為1/8 000)，4 ℃過夜；次日洗膜后加入HRP標記的二抗(羊抗兔稀釋比為1/5 000，羊抗小鼠稀釋比為1/5 000)孵育，增強化學發光(enhanced chemiluminescence,ECL)以檢測蛋白質水平的表達，實驗重復3次，Image J軟件測定蛋白灰度值。
表2
Real-time PCR引物
Table2.
Primers for real-time PCR
1.5.4 siCBP對原代海馬神經元中HAT活性及乙酰化組蛋白的抑制效果
于神經元生長的第6天，選擇對CBP基因和蛋白表達抑制效果最佳的一種siCBP感染神經元，同時設置慢病毒對照組，感染72 h后收集細胞，按Invent Biotechnologies公司提供的方法提取各組細胞的核蛋白，檢測HAT活性按照Biovision公司操作說明進行。兩組各設置3個復孔，實驗重復兩次，用分光光度計于440 nm下讀取吸光度數值，HAT活性表示為“相對OD值/微克核蛋白”，進一步對兩組各6個數據進行統計分析。提取各組細胞的核蛋白，等量上樣，加蛋白質分子量標準作標識，16% tris-tricine PAGE凝膠電泳，剩余步驟與上述檢測CBP蛋白的方法相同，其中一抗Ac-H3稀釋比為1/4 000，Ac-H4稀釋比為1/2 000，LaminB稀釋比為1/8 000。
1.5.5 統計學分析
數據用
2 結果
2.1 陽性克隆的PCR電泳及測序鑒定
如圖 1(a)所示，電泳結果顯示CBP vshRNA片段已經成功插入質粒，且vshRNA片段大小與我們預期一致。其中GR805的2、4、5、7、8、9號陽性；GR806的1、2、3、10號陽性；GR807的8號陽性；GR808的2、7號陽性。挑選的陽性克隆菌液(GR805的2號、GR806的1號、GR807的8號、GR808的7號)測序結果均有一段與設計合成的靶向鏈完全一致，GR807、GR808因為本身的莖環結構，導致測序反應提前終止，這是正常現象，如圖 1(b)所示。說明已將合成的雙鏈DNA oligo插入到vshRNA表達載體中，成功構建了RNAi慢病毒載體。
圖1
siCBP質粒的構建與鑒定
(a)4對siCBP重組慢病毒的構建；N:陰性對照；M：標準；1-10:1-10號轉化子；(b)4種siCBP重組慢病毒的測序結果
Figure1. Construction and identification of four pairs of siCBP lentivirus recombinants(a) construction of four pairs of siCBP lentivirus recombinants; N: Negative control; M: Marker; 1-10: transformants 1-10; (b) sequencing results of four pairs of siCBP lentivirus recombinants
2.2 慢病毒包裝及滴度測定
4種siCBP轉染293 T細胞24 h后，融合的多核細胞開始出現，大多數細胞仍然呈貼壁狀態，熒光顯微鏡觀察可見超過95%細胞帶有GFP。測定siCBP-GR805、GR806、GR807、GR808的滴度分別為1.29×108 TU/mL、1.95×108 TU/mL、1.14×108 TU/mL、1.84×108 TU/mL，對照的滴度為1.57×108 TU/mL，可用于體外實驗的研究。
2.3 siCBP感染大鼠原代海馬神經元情況
原代海馬神經元經培養后突觸逐漸增長形成相互連接，如圖 2(a)所示，于培養的第6天，經原代神經元免疫熒光鑒定，NSE陽性率>90%，如圖 2(b)所示，純度滿足實驗要求。4種siCBP感染原代海馬神經元情況如圖 3所示，GR807感染率約為50%，GR805、GR806、GR808達到70~80%。
圖2
大鼠原代海馬神經元培養及鑒定
(a)D1、D4、D6：原代海馬神經元培養第1、4、6天形態圖；(b)原代神經元NSE免疫熒光圖(200×)。BT：明場
Figure2. Identification of the primarily cultured hippocampal neurons(a) the morphology of the primary cultured hippocampal neurons. D1,D4,D6: at the first,fourth and sixth day of the neurons,respectively; (b) immunofluorescence staining of neuronal marker NSE in the primary cultured neurons (original magnification: 200×). BT: bright light
圖3
熒光顯微鏡觀察siCBP感染原代海馬神經元效果圖(200×)
BT：明場
Figure3. Images of the primarily cultured hippocampal neurons infected with siCBP under fluorescent microscope (200×)BT: bright light
2.4 CBP mRNA及蛋白的表達變化
感染了4種siCBP后，原代海馬神經元中CBP的mRNA表達與感染空載體細胞的對照組相比都有明顯下降，其中P805、P807均<0.05，P806、P808均<0.01，差異具有統計學意義，GR805、GR807、GR808感染神經元后CBP mRNA的抑制率約為50%，GR806感染神經元后CBP mRNA的抑制率約為80%；CBP蛋白表達與感染空載體細胞組相比也有不同程度下降，P值均<0.001，差異均具有統計學意義。其中GR805、GR807、GR808感染神經元后CBP蛋白的抑制率約分別為40%、30%、60%，GR806的CBP蛋白沉默效果最為明顯，干擾效率約為70%。
2.5 HAT活性及乙酰化組蛋白Ac-H3、Ac-H4的表達變化
用對CBP mRNA和蛋白抑制效率最高的GR806感染原代海馬神經元后，神經元的HAT活性與空載體感染的對照組相比下降明顯(P<0.05)，如圖 5(a)所示；Ac-H3、Ac-H4蛋白的表達與感染空載體細胞組相比均有明顯下調，如圖 5(b)所示。
圖4
CBP mRNA及蛋白表達的變化
siCBP組與對照組比較，*
siCBP group compared with control group,*
圖5
HAT活性及Ac-H3、Ac-H4蛋白的表達變化
(a)siCBP感染神經元后HAT活性變化(
(a) the HATs activity in neurons after siCBP infection (
3 討論
CBP是HATs家族的重要成員，具有轉錄激活和調節相關的各種功能。CBP蛋白除可以作為DNA結合轉錄因子和基礎轉錄機制元件之間的分子橋外，其HAT活性還可以與其它相關蛋白形成轉錄輔激活因子以增加組蛋白的乙酰化水平，釋放周圍結合的DNA序列的染色質結構，從而促進調節基因表達轉錄因子的功能成熟[4]。通過CBP基因敲除或轉基因動物的大量研究證實，一些神經退行性疾病與CBP調控的HAT活性和組蛋白乙酰化水平的降低密切相關。乙酰化水平的恢復，主要是通過藥理手段，可以部分逆轉神經病理特征[4-9]；H3、H4是CBP的代表性組蛋白底物，HAT活性的增高能夠增加乙酰化組蛋白Ac-H3、Ac-H4的表達水平，而HAT活性水平及組蛋白表達水平的降低會顯著抑制學習記憶等相關功能基因的表達，最終影響學習記憶等腦功能[3]，并且CBP相關的組蛋白乙酰化這一表觀遺傳改變又受到營養、環境等諸多因素的調節，因而關注HAT活性及其下游Ac-H3、Ac-H4的表達是驗證CBP功能、揭示其具體調節模式的重要方向。
目前對CBP進行體外特異性沉默或過表達的研究，多在血管平滑肌細胞[10-12]或者癌細胞[13]等非神經細胞中進行；僅有的用其對神經元的研究大多集中在海洋軟體動物海兔[14]或哺乳動物的皮層神經元[15-17]。而海馬區是大腦參與學習記憶功能的重要組織之一，也是眾多認知功能退行性疾病或精神神經綜合征的主要病灶之一，為了能在細胞水平和分子水平深入研究CBP及其依賴的組蛋白乙酰化在海馬神經元中發揮作用的分子基礎，我們從基因沉默的角度研究CBP對原代海馬神經元細胞HAT活性及組蛋白乙酰化水平的影響。本研究根據CBP的基因信息，成功構建了4對siCBP慢病毒載體；轉染293T細胞包裝生產了高滴度的siCBP慢病毒顆粒。將其感染大鼠原代培養海馬神經元后，PCR、western blot檢測結果提示GR806和GR808對CBP的表達水平有較為顯著的抑制效果；進一步以抑制效果最佳的GR806感染海馬神經元后，神經元的HAT活性和Ac-H3、Ac-H4蛋白的表達水平均降低明顯。這些結果表明，本研究構建的重組慢病毒siCBP能高效、特異地抑制原代海馬神經元內CBP、HAT活性及Ac-H3、Ac-H4的表達，為后續應用siCBP進一步闡明CBP依賴的組蛋白乙酰化對海馬區學習記憶功能影響及上下游調節的相關分子機制提供了實驗基礎。
引言
組蛋白是真核生物染色體的基本結構蛋白，有五種類型：H1、H2A、H2B、H3、H4，它們富含帶正電荷的堿性氨基酸，能夠同DNA中帶負電荷的磷酸基團相互作用。每個組蛋白都有進化上保守的N端拖尾伸出核小體外，這些拖尾是許多信號通路的靶點，從而引起轉錄后修飾。該類修飾最常見的為組蛋白N端賴氨酸殘基的乙酰化修飾，這種修飾是在組蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferases,HATs)和去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)的作用下保持著動態平衡，并與染色質的轉錄活性狀態密切相關[1]。組蛋白乙酰化修飾在神經發育過程中扮演著重要角色，HATs/HDACs表達變化所致的組蛋白乙酰化修飾的異常可影響正常神經發育過程[2]。環磷酸腺苷反應元件結合因子的結合蛋白(CREB binding protein,CBP)是細胞中最常見的一種組蛋白乙酰轉移酶，具有HAT活性，能顯著提高組蛋白的乙酰化水平，HAT活性水平及組蛋白表達水平的降低會顯著抑制學習記憶等相關功能基因的表達，最終影響學習記憶等功能[3]。近年來關于表觀遺傳因素與神經精神病癥的研究廣泛開展，甚至認為CBP可能成為認知或神經退行性疾病的潛在治療靶點，進一步探明CBP相關信號與諸多影響因素的具體作用方式成為將來研究的重點[4]。我們的前期研究也表明大鼠體內海馬區CBP及乙酰化組蛋白表達的降低與學習記憶功能的下降密切相關，而這種組蛋白乙酰化水平及學習記憶能力的降低是否由CBP特異性介導尚不清楚，并且其在具體的病理生理狀態下受到哪些信號通路的調節及具體分子機制有待進一步探討。體外培養原代海馬神經元并對其進行相應干預是模擬體內變化以及研究神經元相關信號調節分子機制的重要手段，因此在體外培養原代海馬神經元的基礎上研究CBP特異性的信號變化，將有助于進一步揭示學習記憶功能障礙中CBP依賴的乙酰化組蛋白表達的相關因素及具體調控機制，為改善學習記憶功能提供新的思考方向。
沉默靶基因是研究分子信號通路的一種重要途徑。慢病毒是逆轉錄病毒的一種，具有逆轉錄病毒的基本結構和特征。利用慢病毒載體構建的shRNA表達載體，可以代替瞬時表達載體使用，并且經過包裝系統包裝后，感染的細胞種類更廣，可用于感染傳統轉染試劑難以轉染的細胞如原代細胞、懸浮細胞等，基因沉默的效果更好、更穩定，轉染效率更高，持續時間更長，因而應用更為廣泛。原代神經元屬非分裂期、難以轉染且對毒性反應敏感度非常高的細胞，而本研究擬進行CBP及其下游蛋白表達變化的檢測，所需作用時間相對較長，由于慢病毒載體免疫反應小，不容易導致細胞死亡，滴度更高，整合到基因組中能實現長時間的基因表達，因此能很好地滿足本實驗要求。本研究旨在通過構建siCBP篩選CBP基因RNAi的有效靶序列，感染原代海馬神經元后，檢測其對原代海馬神經元中乙酰化組蛋白表達的抑制效果，為進一步研究CBP介導的組蛋白乙酰化修飾在原代海馬神經元中對學習記憶相關上下游信號調節的具體分子機制提供有利工具。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
SPF級Wistar大鼠，雌、雄2∶1合籠。孕17~18 d胎鼠，雌雄不限，由重慶醫科大學兒童醫院動物中心提供。
1.2 主要材料
pLKD.UbiC.GFP.U6.shRNA載體、Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切(紐恩(上海))；Taq酶和dNTP、DH5a感受態細胞、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DL 2000 DNA Marker(TaKaRa)；T4 DNA連接酶、內切酶(NEB)；小抽試劑盒(Promega)；250 bp DNA ladder plus(捷瑞)；1 kb DNA ladder Marker(Fermentas)。4對RNAi及對照引物序列(上海英駿)，陽性克隆測序、GAPDH、CBP引物合成(北京華大基因)。DMEM/F12培養基、胰酶、neurobasal培養基、B27、L-谷氨酰胺、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、馬血清(horse serum,HS) (Gibco)，青/鏈霉素雙抗(Sigma)；293T細胞由本實驗室保存，DMEM培養基為本研究所配制。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天)，RT-PCR、real-time PCR試劑盒(TaKaRa)；RNA提取試劑盒、蛋白RIPA裂解液和蛋白定量試劑盒(百泰克)；核蛋白提取試劑盒(Invent Biotechnologies)，HAT活性檢測試劑盒(Biovision)。CBP一抗(Cell Signaling)、Ac-H3、Ac-H4一抗(Millipore)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、核蛋白內參LaminB一抗(Abcam)；鼠抗兔綠色熒光二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc)，HRP標記的羊抗兔、羊抗小鼠二抗(中杉金橋)，4＇,6＇-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Sigma)。
1.3 儀器
Bio-Rad梯度PCR儀、定量PCR儀、電泳儀、轉膜儀，G:Box凝膠成像系統、Sigma高速冷凍離心機、Sigma恒溫細胞培養箱、尼康倒置熒光顯微鏡、Eppendorf移液器等。
1.4 細胞培養及鑒定
1.4.1 大鼠原代海馬神經元的培養
將6孔板用多聚賴氨酸鋪板后，取孕17~18 d胎鼠，5%乙醇消毒后斷頭取腦，鈍性分離迅速取出海馬組織，輕輕剔除腦膜及血管后置于冰DMEM液中清洗2次。將海馬組織剪成約1 mm3小塊(以上操作在冰上進行)，轉入含10% HS、5% FBS及含1/100的青/鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基中。用巴氏吸管反復輕輕吹打，200目不銹鋼篩網過濾。取少量細胞懸液，血球計數板計數，以1.5×106個/孔密度種植于包被過多聚賴氨酸的6孔板內，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養。12 h后將培養液全部換成含0.5 mmol/L谷氨酰胺、2% B27的無血清neurobasal培養基，每3天半量換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。
1.4.2 NSE免疫熒光鑒定神經元純度
將原代神經元接種于預先用蓋玻片鋪底的6孔板內，于培養的第7天，吸棄培養基，甲醇∶冰乙酸(3∶1)－20 ℃固定，PBS清洗后5％胎牛血清白蛋白封閉；再次PBS洗滌后加入含0.2% Triton X-100的兔抗大鼠NSE抗體稀釋液(稀釋比為1/500)，4 ℃過夜；次日PBS洗滌后加入小鼠抗兔綠色熒光二抗，室溫避光孵育1 h；PBS洗滌后DAPI復染胞核，熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機取5個視野，攝像后利用SPOT3.4軟件計算每個視野中NSE表達陽性細胞數占該視野總細胞數的比例即為神經元純度。
1.5 實驗方法
1.5.1 CBP 基因RNA 干擾慢病毒載體制備及陽性克隆鑒定
目的基因Crebbp(NM_133381)即CBP靶基因序列，針對靶點合成的4對含干擾序列的DNA oligo，均委托紐恩(上海)生物科技有限公司設計，如表 1所示。DNA oligo(內含酶切位點)經退火形成雙鏈DNA，與經Age Ⅰ和EcoR I雙酶切后的pLKD.UbiC.GFP.U6.shRNA載體連接。經連接反應后，立刻轉化或凍存于-20℃以后轉化。將連接好的產物轉入細菌感受態細胞，用抗生素抗性篩選。挑取重組陽性克隆行PCR鑒定并行DNA測序。PCR鑒定陽性克隆的引物為：Primer(+)：5＇-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3＇；Primer (-)：5＇-TTCGTCTGACGTGGCAGCGCT-3＇。陽性條帶為380 bp、空載對照條帶為344 bp，PCR鑒定出的陽性重組子進一步測序，采用DNAStar的MegAlign軟件對插入片段與測序結果進行比對驗證，從而篩選出構建成功的siCBP慢病毒載體。對照序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT，在NCBI數據庫中，該對照序列只和斑馬魚的兩個基因有連續16個堿基的同源性，除此以外，該序列和基因組中的任何序列沒有連續16個堿基的同源性，因此可用做普適型陰性對照。對照克隆構建過程同干擾載體構建。
表1
大鼠CBP的siRNA序列
Table1.
Sequences of siRNA for rat CBP
1.5.2 慢病毒包裝及其滴度測定
培養293T細胞株(20代以下)(DMEM+10% FBS+1%的青/鏈霉素)作為包裝細胞，待細胞融合度約為70%~80%后，將細胞分到12個150 mm培養皿中，每瓶加入約8×106個細胞。24 h后，細胞融合度為30%~40%，在每個培養瓶中添加氯喹，使其終濃度為25 μmol/L。取一個50 mL離心管，加入31.56 mL滅菌水、4.44 mL 2 mol/L的CaCl2、252 μg載體質粒、168 μg psPAX2包裝質粒和84 g VSV-G表達質粒pMD2.G(使用Qiagen Maxiprep進行高純度無內毒素抽提)，充分混勻后，將轉染液分別滴加至含氯喹的293T細胞中，每個培養皿加6 mL，繼續培養過夜。第2天更換新鮮的DMEM完全培養基，繼續培養48~50 h。轉染2~3 d后重組病毒顆粒包裝完成，并分泌到培養上清中。此時觀察轉染效果，即觀察細胞的熒光感染率。收集所有培養上清，500 g室溫離心10 min，除去細胞和大的碎片，再用0.45 μm濾膜過濾上清液。接著使用超速離心機100 000 g離心2 h，去掉上清，200 μL DMEM或 Opti-MEME溶解沉淀，并用0.22 μm濾膜過濾獲得的病毒，除去大的顆粒雜質，分裝后保存于－80℃。采用相對定量PCR的方法測定測試細胞中的病毒基因組的整合數，根據病毒加入的體積、感染時的細胞量從而推斷原始的病毒滴度，將收集到的濃縮病毒原做梯度稀釋(10至106倍)分組后感染293T細胞，用熒光鏡觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表達，測定并標定病毒滴度。按照公式計算滴度(integration units per mL,IU/mL)：IU/mL=(C·2N·D·1000)/V，C為每個基因組中整合的病毒數，2N為感染時基因組數(每個孔大約有2×105，故大約對應4×105的基因組)，D為病毒稀釋倍數，V為每孔中加入的病毒體積，不同濃度梯度的病毒測試結果取平均值。
1.5.3 siCBP對原代海馬神經元中CBP基因及蛋白表達的抑制效率
培養生長狀態良好的原代神經元，在培養的第6天，用獲得的4種siCBP分別進行感染，同時設置空載病毒對照組。感染3 d后熒光顯微鏡下觀察慢病毒上報告基因GFP表達情況，感染24 h采用real time-PCR的方法檢測CBP的mRNA表達情況。總RNA抽提、RNA逆轉錄獲得cDNA根據TaKaRa公司的試劑盒操作說明書進行。PCR擴增參數：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環；65 ℃ 30 s，每次在延伸階段讀取吸光值，制作溶解曲線，每次real time-PCR對照組和siCBP實驗組分別設置3個復孔，實驗重復兩次，進一步對兩組各6個數據進行統計分析，CBP及GAPDH內參引物如表 2所示；提取各組細胞的蛋白質，等量上樣，同時加蛋白質分子量標準作標識，6% SDS-PAGE凝膠電泳，按標準條帶位置分離目的蛋白后轉膜，封閉、洗膜后加入一抗(CBP稀釋比為1/500，LaminB稀釋比為1/8 000)，4 ℃過夜；次日洗膜后加入HRP標記的二抗(羊抗兔稀釋比為1/5 000，羊抗小鼠稀釋比為1/5 000)孵育，增強化學發光(enhanced chemiluminescence,ECL)以檢測蛋白質水平的表達，實驗重復3次，Image J軟件測定蛋白灰度值。
表2
Real-time PCR引物
Table2.
Primers for real-time PCR
1.5.4 siCBP對原代海馬神經元中HAT活性及乙酰化組蛋白的抑制效果
于神經元生長的第6天，選擇對CBP基因和蛋白表達抑制效果最佳的一種siCBP感染神經元，同時設置慢病毒對照組，感染72 h后收集細胞，按Invent Biotechnologies公司提供的方法提取各組細胞的核蛋白，檢測HAT活性按照Biovision公司操作說明進行。兩組各設置3個復孔，實驗重復兩次，用分光光度計于440 nm下讀取吸光度數值，HAT活性表示為“相對OD值/微克核蛋白”，進一步對兩組各6個數據進行統計分析。提取各組細胞的核蛋白，等量上樣，加蛋白質分子量標準作標識，16% tris-tricine PAGE凝膠電泳，剩余步驟與上述檢測CBP蛋白的方法相同，其中一抗Ac-H3稀釋比為1/4 000，Ac-H4稀釋比為1/2 000，LaminB稀釋比為1/8 000。
1.5.5 統計學分析
數據用
2 結果
2.1 陽性克隆的PCR電泳及測序鑒定
如圖 1(a)所示，電泳結果顯示CBP vshRNA片段已經成功插入質粒，且vshRNA片段大小與我們預期一致。其中GR805的2、4、5、7、8、9號陽性；GR806的1、2、3、10號陽性；GR807的8號陽性；GR808的2、7號陽性。挑選的陽性克隆菌液(GR805的2號、GR806的1號、GR807的8號、GR808的7號)測序結果均有一段與設計合成的靶向鏈完全一致，GR807、GR808因為本身的莖環結構，導致測序反應提前終止，這是正常現象，如圖 1(b)所示。說明已將合成的雙鏈DNA oligo插入到vshRNA表達載體中，成功構建了RNAi慢病毒載體。
圖1
siCBP質粒的構建與鑒定
(a)4對siCBP重組慢病毒的構建；N:陰性對照；M：標準；1-10:1-10號轉化子；(b)4種siCBP重組慢病毒的測序結果
Figure1. Construction and identification of four pairs of siCBP lentivirus recombinants(a) construction of four pairs of siCBP lentivirus recombinants; N: Negative control; M: Marker; 1-10: transformants 1-10; (b) sequencing results of four pairs of siCBP lentivirus recombinants
2.2 慢病毒包裝及滴度測定
4種siCBP轉染293 T細胞24 h后，融合的多核細胞開始出現，大多數細胞仍然呈貼壁狀態，熒光顯微鏡觀察可見超過95%細胞帶有GFP。測定siCBP-GR805、GR806、GR807、GR808的滴度分別為1.29×108 TU/mL、1.95×108 TU/mL、1.14×108 TU/mL、1.84×108 TU/mL，對照的滴度為1.57×108 TU/mL，可用于體外實驗的研究。
2.3 siCBP感染大鼠原代海馬神經元情況
原代海馬神經元經培養后突觸逐漸增長形成相互連接，如圖 2(a)所示，于培養的第6天，經原代神經元免疫熒光鑒定，NSE陽性率>90%，如圖 2(b)所示，純度滿足實驗要求。4種siCBP感染原代海馬神經元情況如圖 3所示，GR807感染率約為50%，GR805、GR806、GR808達到70~80%。
圖2
大鼠原代海馬神經元培養及鑒定
(a)D1、D4、D6：原代海馬神經元培養第1、4、6天形態圖；(b)原代神經元NSE免疫熒光圖(200×)。BT：明場
Figure2. Identification of the primarily cultured hippocampal neurons(a) the morphology of the primary cultured hippocampal neurons. D1,D4,D6: at the first,fourth and sixth day of the neurons,respectively; (b) immunofluorescence staining of neuronal marker NSE in the primary cultured neurons (original magnification: 200×). BT: bright light
圖3
熒光顯微鏡觀察siCBP感染原代海馬神經元效果圖(200×)
BT：明場
Figure3. Images of the primarily cultured hippocampal neurons infected with siCBP under fluorescent microscope (200×)BT: bright light
2.4 CBP mRNA及蛋白的表達變化
感染了4種siCBP后，原代海馬神經元中CBP的mRNA表達與感染空載體細胞的對照組相比都有明顯下降，其中P805、P807均<0.05，P806、P808均<0.01，差異具有統計學意義，GR805、GR807、GR808感染神經元后CBP mRNA的抑制率約為50%，GR806感染神經元后CBP mRNA的抑制率約為80%；CBP蛋白表達與感染空載體細胞組相比也有不同程度下降，P值均<0.001，差異均具有統計學意義。其中GR805、GR807、GR808感染神經元后CBP蛋白的抑制率約分別為40%、30%、60%，GR806的CBP蛋白沉默效果最為明顯，干擾效率約為70%。
2.5 HAT活性及乙酰化組蛋白Ac-H3、Ac-H4的表達變化
用對CBP mRNA和蛋白抑制效率最高的GR806感染原代海馬神經元后，神經元的HAT活性與空載體感染的對照組相比下降明顯(P<0.05)，如圖 5(a)所示；Ac-H3、Ac-H4蛋白的表達與感染空載體細胞組相比均有明顯下調，如圖 5(b)所示。
圖4
CBP mRNA及蛋白表達的變化
siCBP組與對照組比較，*
siCBP group compared with control group,*
圖5
HAT活性及Ac-H3、Ac-H4蛋白的表達變化
(a)siCBP感染神經元后HAT活性變化(
(a) the HATs activity in neurons after siCBP infection (
3 討論
CBP是HATs家族的重要成員，具有轉錄激活和調節相關的各種功能。CBP蛋白除可以作為DNA結合轉錄因子和基礎轉錄機制元件之間的分子橋外，其HAT活性還可以與其它相關蛋白形成轉錄輔激活因子以增加組蛋白的乙酰化水平，釋放周圍結合的DNA序列的染色質結構，從而促進調節基因表達轉錄因子的功能成熟[4]。通過CBP基因敲除或轉基因動物的大量研究證實，一些神經退行性疾病與CBP調控的HAT活性和組蛋白乙酰化水平的降低密切相關。乙酰化水平的恢復，主要是通過藥理手段，可以部分逆轉神經病理特征[4-9]；H3、H4是CBP的代表性組蛋白底物，HAT活性的增高能夠增加乙酰化組蛋白Ac-H3、Ac-H4的表達水平，而HAT活性水平及組蛋白表達水平的降低會顯著抑制學習記憶等相關功能基因的表達，最終影響學習記憶等腦功能[3]，并且CBP相關的組蛋白乙酰化這一表觀遺傳改變又受到營養、環境等諸多因素的調節，因而關注HAT活性及其下游Ac-H3、Ac-H4的表達是驗證CBP功能、揭示其具體調節模式的重要方向。
目前對CBP進行體外特異性沉默或過表達的研究，多在血管平滑肌細胞[10-12]或者癌細胞[13]等非神經細胞中進行；僅有的用其對神經元的研究大多集中在海洋軟體動物海兔[14]或哺乳動物的皮層神經元[15-17]。而海馬區是大腦參與學習記憶功能的重要組織之一，也是眾多認知功能退行性疾病或精神神經綜合征的主要病灶之一，為了能在細胞水平和分子水平深入研究CBP及其依賴的組蛋白乙酰化在海馬神經元中發揮作用的分子基礎，我們從基因沉默的角度研究CBP對原代海馬神經元細胞HAT活性及組蛋白乙酰化水平的影響。本研究根據CBP的基因信息，成功構建了4對siCBP慢病毒載體；轉染293T細胞包裝生產了高滴度的siCBP慢病毒顆粒。將其感染大鼠原代培養海馬神經元后，PCR、western blot檢測結果提示GR806和GR808對CBP的表達水平有較為顯著的抑制效果；進一步以抑制效果最佳的GR806感染海馬神經元后，神經元的HAT活性和Ac-H3、Ac-H4蛋白的表達水平均降低明顯。這些結果表明，本研究構建的重組慢病毒siCBP能高效、特異地抑制原代海馬神經元內CBP、HAT活性及Ac-H3、Ac-H4的表達，為后續應用siCBP進一步闡明CBP依賴的組蛋白乙酰化對海馬區學習記憶功能影響及上下游調節的相關分子機制提供了實驗基礎。
