研究不同粒徑的羥基磷灰石(HA)粒子對惡性黑色素瘤A375細胞的抑制效應。濕法合成4種短棒狀HA粒子,平均直徑分別為998.0 nm (HA1)、511.0 nm (HA2)、244.0 nm (HA3)和71.6 nm (HA4),體外干預惡性黑色素瘤A375細胞。結果顯示:平均直徑小于511.0 nm的HA粒子均可抑制A375細胞的增殖,其中納米級HA4粒子對A375細胞的增殖抑制和誘導凋亡能力最強;HA粒子分布于A375細胞胞質內;HA4組A375細胞超微結構的改變最為顯著。研究表明,粒徑是HA粒子抗腫瘤效應極為重要的影響因素,納米級HA4粒子抑制A375細胞增殖的能力最強;納米HA通過誘導細胞凋亡抑制A375細胞增殖。
引用本文： 郭波, 李波, 王滟, 洪友良, 張伶俐, 張興棟. 不同粒徑羥基磷灰石粒子對惡性黑色素瘤A375細胞抑制效應的初步研究. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(4): 832-837. doi: 10.7507/1001-5515.20150150 復制
引言
羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)[Ca10(PO4)6(OH)2]是人體骨組織重要的無機組成部分，在生物體內主要以納米晶體的形式存在，以其為主要成分的無機陶瓷材料也是重要的生物修復材料。1992年，Aoki在使用HA粒子載抗腫瘤藥物進行體外抗腫瘤研究時意外發現，作為空白對照的HA粒子同樣可以抑制腫瘤細胞Ca-9的增殖，提示HA粒子可能具有抗腫瘤效應[1]。將HA粒子吸附氟尿嘧啶和絲裂霉素C等抗腫瘤藥物，并與腫瘤細胞HSC23共同培養，發現與單純使用氟尿嘧啶、絲裂霉素C或HA粒子相比較，載有抗腫瘤藥物的HA粒子能顯著地抑制腫瘤細胞增殖，進一步證明了HA粒子對腫瘤細胞增殖具有抑制作用[2-3]。近年來一些研究顯示：HA粒子與肝癌、肺癌、宮頸癌等惡性腫瘤細胞共同培養時，均可產生細胞毒性，從而導致腫瘤細胞死亡。
研究表明，除了化學組成，HA粒子的大小、形狀、表面特征等也對其生物學效應具有明顯的影響[4]。而不同粒徑的HA是否存在抗腫瘤效應方面的差異，目前尚無系統研究。因此，本研究合成不同粒徑的HA粒子，干預惡性黑色素瘤細胞A375的增殖，以研究羥基磷灰石的粒徑對其抗腫瘤效應的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和儀器
惡性黑色素瘤細胞A375：美國ATCC中心，由四川大學華西醫院病理實驗室提供。鼠抗人CD147TTIC單克隆熒光抗體，美國Ancell公司；DMEM培養基、胰蛋白酶，美國GIBCO公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，美國SIGMA公司；MRC-1024ES激光掃描共聚焦顯微鏡，英國Bio-Rad公司；TE2000-U熒光相差倒置顯微鏡及顯微操作系統，日本Nikon公司。
1.2 HA粒子制備和表征
1.2.1 HA粒子制備
通過濕法合成4種HA粒子，均為短棒狀，由反應條件不同分別合成微米級粒子HA1、HA2、HA3以及納米級粒子HA4。粒子平均直徑：HA1為998.0 nm，HA2為511.0 nm，HA3為244.0 nm，HA4為71.6 nm。
(1) HA1的制備：CaCl2和Na3PO4的Ca/P比為1.67，于室溫下反應，將磷酸鹽滴加入鈣鹽同時攪拌，控制pH值在10，繼續攪拌1 h，陳化24 h，將生成的沉淀去離子水水洗至中性，120 ℃干燥24 h。使用時稱取一定量的粉末分散于水中，超聲分散后待用。
(2)HA2的制備：CaCl2和Na3PO4的Ca/P比為1.67，于室溫下反應，將磷酸鹽滴加入鈣鹽同時攪拌，控制pH值在10，繼續攪拌1 h，陳化24 h，將生成的沉淀去離子水水洗至中性，60 ℃干燥24 h。使用時稱取一定量的粉末分散于水中，超聲分散后待用。
(3)HA3的制備：CaCl2和Na3PO4按Ca/P比為1.67，65℃反應1 h，加入少量的檸檬酸作為分散劑(按生成固含量的3%加入)，將磷酸鹽滴加入鈣鹽同時攪拌，控制pH值在10，繼續攪拌1 h，陳化24 h，將生成的沉淀去離子水水洗至中性，冷凍干燥。使用時稱取一定量的粉末分散于水中，超聲分散后待用。
(4)HA4的制備：CaCl2和Na3PO4的Ca/P比為1.67，于室溫下反應，加入少量的檸檬酸作為分散劑(按生成固含量的3%加入)，將磷酸鹽滴加入鈣鹽同時攪拌，控制pH值在10，繼續攪拌1 h，陳化24 h，將生成的沉淀去離子水水洗至中性，冷凍干燥。使用時稱取一定量的粉末分散于水中，超聲分散后待用。
1.2.2 HA粒子表征
(1)HA粒子直徑分析：將制備的HA粒子以去離子水分散到一定濃度，加少量的分散劑和穩定劑(聚丙烯酸胺或者六偏磷酸鈉)，每隔半小時超聲5 min，以激光散射納米粒度儀進行粒子直徑分析，測量3次取其平均值。
(2)納米HA粒子相成分分析：將制備的納米HA粒子(nano-HA)(HA4)進行X-射線衍射(X-ray diffraction，XRD)，進行相成分分析。
(4)納米HA粒子透射電鏡觀察：將制備的納米HA粒子(nano-HA)(HA4)以去離子水分散到一定濃度，加少量的分散劑和穩定劑(聚丙烯酸胺或者六偏磷酸鈉)，每隔半小時超聲5 min，將一滴或數滴溶膠涂抹于Cu網上，以透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察。
1.3 實驗方法
1.3.1 MTT比色法測試
取對數生長期的細胞,胰蛋白酶消化后吹打成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×104個/mL，接種于96孔培養板中，每孔總體積0.2 mL。24 h后細胞貼壁，棄原培養液，加入含有4種HA粒子的培養液(粒子終濃度為150 g/mL)，每種粒子設5個復孔。作用24、48、72、96 h后,加入MTT液(濃度為5 mg/mL),每孔20 μL，37 ℃孵育4 h。棄上清液，加入二甲亞砜(DMSO)150 μL，振蕩10 min，使結晶充分溶解。選擇波長570 nm，在酶標儀上測定各孔光吸收度值(OD值)。以PBS代替HA粒子作為空白對照。
1.3.2 TEM觀察
空白組以及微米粒子HA1、納米粒子HA4粒子作用48 h后，收集培養瓶內A375細胞，細胞總數分別為1×106個/mL，置于2 mL的離心管中，2 000 r/min離心15 min，棄上清。吸管沿管壁加入0.5%的戊二醛固定，4 ℃靜置15 min；12 000 r/min離心15 min，棄上清。吸管沿管壁加入0.5%的戊二醛固定15 min。1%四氧化鋨固定15 min。丙酮逐級脫水。Epon812包埋，半薄切片光學定位。超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，TEM觀察。
1.3.3 免疫熒光觀察
取對數生長期的A375細胞，濃度為2×105個/mL，接種于6孔培養板中，每孔總體積2 mL。24 h 后細胞貼壁,棄原培養液,加入含4種HA粒子的新培養液(粒子終濃度為150 g/mL)。48 h后棄培養液，于4%的多聚甲醛固定15 min。PBS洗3次(5 min/次)。再加入200 μL細胞核特異熒光染色劑4，6-diamidino-2-phenylindole，dihydrochloride (molecular probes，USA)，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養5 min。PBS洗3次(5 min/次)； 以PBS代替HA粒子作為空白對照，置于免疫熒光顯微鏡下觀察。
1.3.4 流式細胞術測試
4種HA粒子作用細胞48 h后，收集培養瓶內A375細胞，細胞總數為1×106 個，用胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，離心(12 000 r/min)。棄上清液，沿管壁緩慢加入1 mL、70%乙醇(－20 ℃預冷)固定，過夜(4 ℃)。PBS洗2次(5 min/次)，100 μl RNA酶消化30 min(37 ℃)，再加入100 μL PI 染色液(4 ℃)，避光30 min。用Epics Elite Esp流式細胞儀對標本進行檢則。每次計細胞數5 000個。用分析軟件CellQuest計算凋亡率。
1.4 統計學分析
采用統計學分析軟件SPSS 13.0進行數據處理。實驗數據以均數±標準差(
2 結果
2.1 HA粒子表征
2.1.1 HA粒子分布
通過控制反應溫度以及使用不同的分散劑，共合成4種HA粒子，均為短棒狀，分別為微米級粒子HA1、HA2和HA3，以及納米級粒子HA4，具體分布如表 1所示。
表1
HA粒子的粒徑和粒徑分布(nm)
Table1.
HA particle size and size distribution (nm)
2.1.2 納米HA粒子(HA4)的XRD結果
對HA4粒子采用DX-1000型X-射線衍射儀進行測試，XRD結果表明，在2θ=26°、32°、40°、46°、50°附近，都有羥基磷灰石(002)、(211)、(310)、(222)和(213)晶面衍射的特征峰，均無雜質峰出現。
2.1.3 納米HA粒子(HA4)的TEM觀察結果
圖 1為HA4粒子的TEM照片，從測試照片中可以看出，所制備的納米HA粒子呈短棒狀，分散良好，粒度分析表明其直徑分布于63.5～201.0 nm，平均直徑約為71.6 nm。
圖1
納米HA粒子(HA4)TEM圖像
Figure1.
TEM image of nano HA particle (HA4)
2.2 不同粒徑HA粒子對惡性黑色素瘤A375的生物活性影響
2.2.1 細胞增殖
由表 2的結果可見，不同直徑的HA粒子與腫瘤細胞共同培養24 h，各實驗組間的吸光度值差異無統計學意義。延長培養培養時間至48 h后，納米HA粒子明顯抑制了A375細胞的增殖(P<0.05)。培養72 h后，所有HA實驗組均抑制了A375細胞的增殖，與空白組比較，吸光度值差異有統計學意義(P<0.05)。培養96 h后，HA1粒子與空白對照組相比較，吸光度值差異無統計學意義，而HA2、HA3、HA4仍可明顯抑制A375細胞增殖(P<0.05)。
表2
不同粒徑HA粒子作用下A375細胞吸光度值(A570 nm)
Table2.
Effects of HA particles with different size on the absorbance value of A375 cells (A570 nm)
2.2.2 細胞免疫熒光觀察
圖 2為HA粒子干預惡性黑色素瘤細胞前后的免疫熒光圖。圖中空白組細胞核膜完整,染色質均勻一致,可見細胞核分裂像。HA粒子與細胞作用48 h后，HA1、HA2組未發現腫瘤細胞核形態和染色質變化；而HA3、HA4處理后，細胞核縮小、染色質不均勻，部分可見染色質積聚，且HA4作用后細胞核改變較明顯。
圖2
A375細胞與HA粒子培養48 h免疫熒光染色(200×)
Figure2.
Immunofluorescence micrograph of A375 cells co-cultured with HA particles for 48 h (200×)
2.2.3 流式細胞術檢測
HA粒子與腫瘤細胞A375培養48 h后，細胞的凋亡率分別為:空白組29.00%±2.77%，HA1組29.72%±2.33%，HA2組31.12%±1.70%，HA3組32.80%±3.22%，HA4組42.12%±1.76%。與空白組比較，HA4組的細胞凋亡率差異有統計學意義(P<0.05)，而HA1、HA2、HA3組的細胞凋亡率差異無統計學意義,表明納米HA粒子對惡性黑色素瘤細胞A375具有最強的凋亡誘導作用。
2.2.4 TEM觀察
圖 3為惡性黑色素瘤細胞與HA粒子培養48 h后的TEM圖像。空白對照組細胞核呈橢圓形，核內染色質分布均勻，核仁明顯，細胞器豐富，細胞質內粗面內質網、高爾基體、核糖體等細胞器均清晰可見，細胞膜完整，高倍鏡下核膜可見。HA1粒子作用A375細胞后，可見HA粒子進入細胞質內，細胞染色質聚集，細胞體積縮小，胞質內出現少量空泡，呈現凋亡前改變。HA4作用后，可見大量HA粒子進入細胞質內，細胞核固縮，染色質聚集于核膜周邊形成數個團塊，胞質內出現大量空泡，細胞呈凋亡改變。
圖3
惡性黑色素瘤細胞A375與HA粒子培養48H透射電鏡(10 000×)
Figure3.
TEM images of malignant melanoma A375 cells co-cultured with HA particles for 48 h (10 000×)
3 討論
隨著材料科學的進展，目前對HA粒子抗腫瘤特性的研究已逐步向納米尺度深入。近年來的研究表明，惡性腫瘤細胞與納米HA在體外共同培養時，納米HA可以抑制MDA-MB-231乳腺癌細胞、G2肝癌細胞和MG63骨肉瘤細胞等惡性腫瘤細胞的增殖[5-7]。腫瘤細胞的增殖過程中，多種因素可影響腫瘤細胞最終的生物結局。除了HA的化學組成，HA粒子的粒徑也可能影響腫瘤細胞的增殖。因此，本研究使用了平均粒徑為998.0、511.0、244.0 nm的三種短棒狀微米HA粒子，以及平均粒徑為71.6 nm的短棒狀納米HA粒子，與惡性黑色素瘤細胞A375體外共同培養。研究結果表明，隨著HA顆粒尺寸的減小，HA粒子對腫瘤細胞的增殖抑制效應逐漸增強，平均直徑為71.6 nm的短棒狀納米HA粒子對惡性黑色素瘤細胞的抑制作用最強。
HA4在與腫瘤細胞共培養48、72、96 h期間，對腫瘤細胞的增殖均有顯著的抑制作用。HA2和HA3與腫瘤細胞共培養72 h后，出現對細胞的增殖抑制。雖然HA1粒子在末期未對惡性黑色素瘤細胞增殖產生明顯的抑制作用，但與空白對照組相比較，腫瘤細胞增殖仍呈下降的趨勢，而且在第3天細胞吸光度值與空白組比較具有統計學差異。這可能是由于粒子大小并非均勻分布所致。由表 1可知，HA1粒子分布于80～1 000 nm之間，平均粒徑為998 nm，但仍有少部分較小尺寸的HA粒子。我們認為，由于腫瘤細胞不斷增殖，小顆粒HA粒子不斷消耗，并最終耗盡。這從另一方面也驗證了小尺寸HA尤其是納米HA粒子對腫瘤細胞增殖有明顯的抑制作用。
早期研究認為，HA粒子在殺傷腫瘤細胞的同時不損傷正常細胞，必須具備兩個條件：①HA的粒徑分布于20～100 nm之間；②納米粒子需要分布均勻[8]。我們的研究表明：平均粒徑為511.0 nm的HA粒子仍然具有腫瘤抑制作用，兩者結論似乎并不完全一致。這可能是由于腫瘤細胞類型和惡性程度的差異所造成的。Yeh等[9]通過掃描電鏡和TEM研究納米粒子對惡性腫瘤的影響，發現腫瘤細胞的非特異性吞噬能力和腫瘤細胞與材料的相互黏附密切相關。高惡性的腫瘤細胞能攝取更多的納米顆粒，而分裂相對較慢的正常細胞幾乎不能攝取納米顆粒。這也說明了在研究HA粒子與腫瘤細胞的相互作用時，應該考慮腫瘤細胞類型和惡性程度。
近年來研究認為：HA粒子抑制腫瘤的機制可能是通過誘導腫瘤細胞凋亡的途徑實現的。當惡性腫瘤細胞與HA粒子共同培養時，細胞外存在高濃度的HA粒子或鈣離子，腫瘤細胞較高的鈣攝入能力可能導致過多鈣離子或HA粒子的攝入，產生細胞毒性，從而誘導腫瘤細胞凋亡[10-13]。關于腫瘤發生、發展的原因，現在傾向的觀點是由于細胞的異常增殖和死亡動態失衡所致。目前很多抗癌藥物如拓樸異構酶抑制劑、烷化劑和抗代謝藥物等，主要是通過誘導腫瘤細胞凋亡來治療腫瘤，因此治療效果不僅取決于藥物對腫瘤細胞的直接作用，也依賴于其誘導腫瘤凋亡的能力。因此，研究HA粒子誘導腫瘤細胞凋亡的能力，將為HA粒子抗腫瘤的臨床應用提供依據。
細胞凋亡的特征性形態學變化包括細胞染色質的固縮、裂解，核仁的分裂，凋亡小體的形成等。在本研究中，從免疫熒光照片，我們可以看到細胞凋亡的特征性變化，如細胞體積縮小，胞膜皺縮，核固縮，核質沿核膜濃縮集中，形成數個團塊或境界分明的新月形小體。在TEM照片中，空白對照組細胞核呈橢圓形，核內染色質分布均勻，核仁明顯，細胞器豐富，胞質內粗面內質網、高爾基體、核糖體等細胞器均清晰可見，細胞膜完整，高倍鏡下核膜可見。HA1粒子作用于惡性黑色素瘤細胞后，染色質聚集，細胞體積縮小，胞質內出現空泡，呈現凋亡前改變。HA4作用于惡性黑色素瘤細胞后，細胞出現核固縮，染色質凝集并聚集于核膜周邊形成數個團塊，胞質內出現大量空泡，細胞呈凋亡改變。HA粒子與A375細胞培養48 h后，采用流式細胞儀檢測腫瘤細胞的凋亡率，結果表明細胞的凋亡率隨HA粒徑的減小而增加，HA4作用后的細胞凋亡率與空白組比較差異有統計學意義。因此，本研究進一步驗證了HA粒子可通過誘導細胞凋亡的方式抑制腫瘤細胞的增殖。
綜上所述，本研究合成了不同大小(直徑)的HA粒子與惡性黑色素瘤細胞A375體外共同培養，結果表明平均直徑小于511.0 nm的HA粒子均可抑制A375細胞的增殖，其中納米HA粒子抑制細胞增殖和凋亡誘導的能力最強。同時，納米粒子組(HA4)A375細胞超微結構改變最為顯著。因此，本研究顯示HA粒子的大小(粒徑)是其抗腫瘤效應的重要影響因素。但腫瘤細胞是通過細胞膜表面的何種結構識別和轉運納米HA粒子的，則需要進一步研究。
引言
羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)[Ca10(PO4)6(OH)2]是人體骨組織重要的無機組成部分，在生物體內主要以納米晶體的形式存在，以其為主要成分的無機陶瓷材料也是重要的生物修復材料。1992年，Aoki在使用HA粒子載抗腫瘤藥物進行體外抗腫瘤研究時意外發現，作為空白對照的HA粒子同樣可以抑制腫瘤細胞Ca-9的增殖，提示HA粒子可能具有抗腫瘤效應[1]。將HA粒子吸附氟尿嘧啶和絲裂霉素C等抗腫瘤藥物，并與腫瘤細胞HSC23共同培養，發現與單純使用氟尿嘧啶、絲裂霉素C或HA粒子相比較，載有抗腫瘤藥物的HA粒子能顯著地抑制腫瘤細胞增殖，進一步證明了HA粒子對腫瘤細胞增殖具有抑制作用[2-3]。近年來一些研究顯示：HA粒子與肝癌、肺癌、宮頸癌等惡性腫瘤細胞共同培養時，均可產生細胞毒性，從而導致腫瘤細胞死亡。
研究表明，除了化學組成，HA粒子的大小、形狀、表面特征等也對其生物學效應具有明顯的影響[4]。而不同粒徑的HA是否存在抗腫瘤效應方面的差異，目前尚無系統研究。因此，本研究合成不同粒徑的HA粒子，干預惡性黑色素瘤細胞A375的增殖，以研究羥基磷灰石的粒徑對其抗腫瘤效應的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和儀器
惡性黑色素瘤細胞A375：美國ATCC中心，由四川大學華西醫院病理實驗室提供。鼠抗人CD147TTIC單克隆熒光抗體，美國Ancell公司；DMEM培養基、胰蛋白酶，美國GIBCO公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，美國SIGMA公司；MRC-1024ES激光掃描共聚焦顯微鏡，英國Bio-Rad公司；TE2000-U熒光相差倒置顯微鏡及顯微操作系統，日本Nikon公司。
1.2 HA粒子制備和表征
1.2.1 HA粒子制備
通過濕法合成4種HA粒子，均為短棒狀，由反應條件不同分別合成微米級粒子HA1、HA2、HA3以及納米級粒子HA4。粒子平均直徑：HA1為998.0 nm，HA2為511.0 nm，HA3為244.0 nm，HA4為71.6 nm。
(1) HA1的制備：CaCl2和Na3PO4的Ca/P比為1.67，于室溫下反應，將磷酸鹽滴加入鈣鹽同時攪拌，控制pH值在10，繼續攪拌1 h，陳化24 h，將生成的沉淀去離子水水洗至中性，120 ℃干燥24 h。使用時稱取一定量的粉末分散于水中，超聲分散后待用。
(2)HA2的制備：CaCl2和Na3PO4的Ca/P比為1.67，于室溫下反應，將磷酸鹽滴加入鈣鹽同時攪拌，控制pH值在10，繼續攪拌1 h，陳化24 h，將生成的沉淀去離子水水洗至中性，60 ℃干燥24 h。使用時稱取一定量的粉末分散于水中，超聲分散后待用。
(3)HA3的制備：CaCl2和Na3PO4按Ca/P比為1.67，65℃反應1 h，加入少量的檸檬酸作為分散劑(按生成固含量的3%加入)，將磷酸鹽滴加入鈣鹽同時攪拌，控制pH值在10，繼續攪拌1 h，陳化24 h，將生成的沉淀去離子水水洗至中性，冷凍干燥。使用時稱取一定量的粉末分散于水中，超聲分散后待用。
(4)HA4的制備：CaCl2和Na3PO4的Ca/P比為1.67，于室溫下反應，加入少量的檸檬酸作為分散劑(按生成固含量的3%加入)，將磷酸鹽滴加入鈣鹽同時攪拌，控制pH值在10，繼續攪拌1 h，陳化24 h，將生成的沉淀去離子水水洗至中性，冷凍干燥。使用時稱取一定量的粉末分散于水中，超聲分散后待用。
1.2.2 HA粒子表征
(1)HA粒子直徑分析：將制備的HA粒子以去離子水分散到一定濃度，加少量的分散劑和穩定劑(聚丙烯酸胺或者六偏磷酸鈉)，每隔半小時超聲5 min，以激光散射納米粒度儀進行粒子直徑分析，測量3次取其平均值。
(2)納米HA粒子相成分分析：將制備的納米HA粒子(nano-HA)(HA4)進行X-射線衍射(X-ray diffraction，XRD)，進行相成分分析。
(4)納米HA粒子透射電鏡觀察：將制備的納米HA粒子(nano-HA)(HA4)以去離子水分散到一定濃度，加少量的分散劑和穩定劑(聚丙烯酸胺或者六偏磷酸鈉)，每隔半小時超聲5 min，將一滴或數滴溶膠涂抹于Cu網上，以透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察。
1.3 實驗方法
1.3.1 MTT比色法測試
取對數生長期的細胞,胰蛋白酶消化后吹打成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×104個/mL，接種于96孔培養板中，每孔總體積0.2 mL。24 h后細胞貼壁，棄原培養液，加入含有4種HA粒子的培養液(粒子終濃度為150 g/mL)，每種粒子設5個復孔。作用24、48、72、96 h后,加入MTT液(濃度為5 mg/mL),每孔20 μL，37 ℃孵育4 h。棄上清液，加入二甲亞砜(DMSO)150 μL，振蕩10 min，使結晶充分溶解。選擇波長570 nm，在酶標儀上測定各孔光吸收度值(OD值)。以PBS代替HA粒子作為空白對照。
1.3.2 TEM觀察
空白組以及微米粒子HA1、納米粒子HA4粒子作用48 h后，收集培養瓶內A375細胞，細胞總數分別為1×106個/mL，置于2 mL的離心管中，2 000 r/min離心15 min，棄上清。吸管沿管壁加入0.5%的戊二醛固定，4 ℃靜置15 min；12 000 r/min離心15 min，棄上清。吸管沿管壁加入0.5%的戊二醛固定15 min。1%四氧化鋨固定15 min。丙酮逐級脫水。Epon812包埋，半薄切片光學定位。超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，TEM觀察。
1.3.3 免疫熒光觀察
取對數生長期的A375細胞，濃度為2×105個/mL，接種于6孔培養板中，每孔總體積2 mL。24 h 后細胞貼壁,棄原培養液,加入含4種HA粒子的新培養液(粒子終濃度為150 g/mL)。48 h后棄培養液，于4%的多聚甲醛固定15 min。PBS洗3次(5 min/次)。再加入200 μL細胞核特異熒光染色劑4，6-diamidino-2-phenylindole，dihydrochloride (molecular probes，USA)，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養5 min。PBS洗3次(5 min/次)； 以PBS代替HA粒子作為空白對照，置于免疫熒光顯微鏡下觀察。
1.3.4 流式細胞術測試
4種HA粒子作用細胞48 h后，收集培養瓶內A375細胞，細胞總數為1×106 個，用胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，離心(12 000 r/min)。棄上清液，沿管壁緩慢加入1 mL、70%乙醇(－20 ℃預冷)固定，過夜(4 ℃)。PBS洗2次(5 min/次)，100 μl RNA酶消化30 min(37 ℃)，再加入100 μL PI 染色液(4 ℃)，避光30 min。用Epics Elite Esp流式細胞儀對標本進行檢則。每次計細胞數5 000個。用分析軟件CellQuest計算凋亡率。
1.4 統計學分析
采用統計學分析軟件SPSS 13.0進行數據處理。實驗數據以均數±標準差(
2 結果
2.1 HA粒子表征
2.1.1 HA粒子分布
通過控制反應溫度以及使用不同的分散劑，共合成4種HA粒子，均為短棒狀，分別為微米級粒子HA1、HA2和HA3，以及納米級粒子HA4，具體分布如表 1所示。
表1
HA粒子的粒徑和粒徑分布(nm)
Table1.
HA particle size and size distribution (nm)
2.1.2 納米HA粒子(HA4)的XRD結果
對HA4粒子采用DX-1000型X-射線衍射儀進行測試，XRD結果表明，在2θ=26°、32°、40°、46°、50°附近，都有羥基磷灰石(002)、(211)、(310)、(222)和(213)晶面衍射的特征峰，均無雜質峰出現。
2.1.3 納米HA粒子(HA4)的TEM觀察結果
圖 1為HA4粒子的TEM照片，從測試照片中可以看出，所制備的納米HA粒子呈短棒狀，分散良好，粒度分析表明其直徑分布于63.5～201.0 nm，平均直徑約為71.6 nm。
圖1
納米HA粒子(HA4)TEM圖像
Figure1.
TEM image of nano HA particle (HA4)
2.2 不同粒徑HA粒子對惡性黑色素瘤A375的生物活性影響
2.2.1 細胞增殖
由表 2的結果可見，不同直徑的HA粒子與腫瘤細胞共同培養24 h，各實驗組間的吸光度值差異無統計學意義。延長培養培養時間至48 h后，納米HA粒子明顯抑制了A375細胞的增殖(P<0.05)。培養72 h后，所有HA實驗組均抑制了A375細胞的增殖，與空白組比較，吸光度值差異有統計學意義(P<0.05)。培養96 h后，HA1粒子與空白對照組相比較，吸光度值差異無統計學意義，而HA2、HA3、HA4仍可明顯抑制A375細胞增殖(P<0.05)。
表2
不同粒徑HA粒子作用下A375細胞吸光度值(A570 nm)
Table2.
Effects of HA particles with different size on the absorbance value of A375 cells (A570 nm)
2.2.2 細胞免疫熒光觀察
圖 2為HA粒子干預惡性黑色素瘤細胞前后的免疫熒光圖。圖中空白組細胞核膜完整,染色質均勻一致,可見細胞核分裂像。HA粒子與細胞作用48 h后，HA1、HA2組未發現腫瘤細胞核形態和染色質變化；而HA3、HA4處理后，細胞核縮小、染色質不均勻，部分可見染色質積聚，且HA4作用后細胞核改變較明顯。
圖2
A375細胞與HA粒子培養48 h免疫熒光染色(200×)
Figure2.
Immunofluorescence micrograph of A375 cells co-cultured with HA particles for 48 h (200×)
2.2.3 流式細胞術檢測
HA粒子與腫瘤細胞A375培養48 h后，細胞的凋亡率分別為:空白組29.00%±2.77%，HA1組29.72%±2.33%，HA2組31.12%±1.70%，HA3組32.80%±3.22%，HA4組42.12%±1.76%。與空白組比較，HA4組的細胞凋亡率差異有統計學意義(P<0.05)，而HA1、HA2、HA3組的細胞凋亡率差異無統計學意義,表明納米HA粒子對惡性黑色素瘤細胞A375具有最強的凋亡誘導作用。
2.2.4 TEM觀察
圖 3為惡性黑色素瘤細胞與HA粒子培養48 h后的TEM圖像。空白對照組細胞核呈橢圓形，核內染色質分布均勻，核仁明顯，細胞器豐富，細胞質內粗面內質網、高爾基體、核糖體等細胞器均清晰可見，細胞膜完整，高倍鏡下核膜可見。HA1粒子作用A375細胞后，可見HA粒子進入細胞質內，細胞染色質聚集，細胞體積縮小，胞質內出現少量空泡，呈現凋亡前改變。HA4作用后，可見大量HA粒子進入細胞質內，細胞核固縮，染色質聚集于核膜周邊形成數個團塊，胞質內出現大量空泡，細胞呈凋亡改變。
圖3
惡性黑色素瘤細胞A375與HA粒子培養48H透射電鏡(10 000×)
Figure3.
TEM images of malignant melanoma A375 cells co-cultured with HA particles for 48 h (10 000×)
3 討論
隨著材料科學的進展，目前對HA粒子抗腫瘤特性的研究已逐步向納米尺度深入。近年來的研究表明，惡性腫瘤細胞與納米HA在體外共同培養時，納米HA可以抑制MDA-MB-231乳腺癌細胞、G2肝癌細胞和MG63骨肉瘤細胞等惡性腫瘤細胞的增殖[5-7]。腫瘤細胞的增殖過程中，多種因素可影響腫瘤細胞最終的生物結局。除了HA的化學組成，HA粒子的粒徑也可能影響腫瘤細胞的增殖。因此，本研究使用了平均粒徑為998.0、511.0、244.0 nm的三種短棒狀微米HA粒子，以及平均粒徑為71.6 nm的短棒狀納米HA粒子，與惡性黑色素瘤細胞A375體外共同培養。研究結果表明，隨著HA顆粒尺寸的減小，HA粒子對腫瘤細胞的增殖抑制效應逐漸增強，平均直徑為71.6 nm的短棒狀納米HA粒子對惡性黑色素瘤細胞的抑制作用最強。
HA4在與腫瘤細胞共培養48、72、96 h期間，對腫瘤細胞的增殖均有顯著的抑制作用。HA2和HA3與腫瘤細胞共培養72 h后，出現對細胞的增殖抑制。雖然HA1粒子在末期未對惡性黑色素瘤細胞增殖產生明顯的抑制作用，但與空白對照組相比較，腫瘤細胞增殖仍呈下降的趨勢，而且在第3天細胞吸光度值與空白組比較具有統計學差異。這可能是由于粒子大小并非均勻分布所致。由表 1可知，HA1粒子分布于80～1 000 nm之間，平均粒徑為998 nm，但仍有少部分較小尺寸的HA粒子。我們認為，由于腫瘤細胞不斷增殖，小顆粒HA粒子不斷消耗，并最終耗盡。這從另一方面也驗證了小尺寸HA尤其是納米HA粒子對腫瘤細胞增殖有明顯的抑制作用。
早期研究認為，HA粒子在殺傷腫瘤細胞的同時不損傷正常細胞，必須具備兩個條件：①HA的粒徑分布于20～100 nm之間；②納米粒子需要分布均勻[8]。我們的研究表明：平均粒徑為511.0 nm的HA粒子仍然具有腫瘤抑制作用，兩者結論似乎并不完全一致。這可能是由于腫瘤細胞類型和惡性程度的差異所造成的。Yeh等[9]通過掃描電鏡和TEM研究納米粒子對惡性腫瘤的影響，發現腫瘤細胞的非特異性吞噬能力和腫瘤細胞與材料的相互黏附密切相關。高惡性的腫瘤細胞能攝取更多的納米顆粒，而分裂相對較慢的正常細胞幾乎不能攝取納米顆粒。這也說明了在研究HA粒子與腫瘤細胞的相互作用時，應該考慮腫瘤細胞類型和惡性程度。
近年來研究認為：HA粒子抑制腫瘤的機制可能是通過誘導腫瘤細胞凋亡的途徑實現的。當惡性腫瘤細胞與HA粒子共同培養時，細胞外存在高濃度的HA粒子或鈣離子，腫瘤細胞較高的鈣攝入能力可能導致過多鈣離子或HA粒子的攝入，產生細胞毒性，從而誘導腫瘤細胞凋亡[10-13]。關于腫瘤發生、發展的原因，現在傾向的觀點是由于細胞的異常增殖和死亡動態失衡所致。目前很多抗癌藥物如拓樸異構酶抑制劑、烷化劑和抗代謝藥物等，主要是通過誘導腫瘤細胞凋亡來治療腫瘤，因此治療效果不僅取決于藥物對腫瘤細胞的直接作用，也依賴于其誘導腫瘤凋亡的能力。因此，研究HA粒子誘導腫瘤細胞凋亡的能力，將為HA粒子抗腫瘤的臨床應用提供依據。
細胞凋亡的特征性形態學變化包括細胞染色質的固縮、裂解，核仁的分裂，凋亡小體的形成等。在本研究中，從免疫熒光照片，我們可以看到細胞凋亡的特征性變化，如細胞體積縮小，胞膜皺縮，核固縮，核質沿核膜濃縮集中，形成數個團塊或境界分明的新月形小體。在TEM照片中，空白對照組細胞核呈橢圓形，核內染色質分布均勻，核仁明顯，細胞器豐富，胞質內粗面內質網、高爾基體、核糖體等細胞器均清晰可見，細胞膜完整，高倍鏡下核膜可見。HA1粒子作用于惡性黑色素瘤細胞后，染色質聚集，細胞體積縮小，胞質內出現空泡，呈現凋亡前改變。HA4作用于惡性黑色素瘤細胞后，細胞出現核固縮，染色質凝集并聚集于核膜周邊形成數個團塊，胞質內出現大量空泡，細胞呈凋亡改變。HA粒子與A375細胞培養48 h后，采用流式細胞儀檢測腫瘤細胞的凋亡率，結果表明細胞的凋亡率隨HA粒徑的減小而增加，HA4作用后的細胞凋亡率與空白組比較差異有統計學意義。因此，本研究進一步驗證了HA粒子可通過誘導細胞凋亡的方式抑制腫瘤細胞的增殖。
綜上所述，本研究合成了不同大小(直徑)的HA粒子與惡性黑色素瘤細胞A375體外共同培養，結果表明平均直徑小于511.0 nm的HA粒子均可抑制A375細胞的增殖，其中納米HA粒子抑制細胞增殖和凋亡誘導的能力最強。同時，納米粒子組(HA4)A375細胞超微結構改變最為顯著。因此，本研究顯示HA粒子的大小(粒徑)是其抗腫瘤效應的重要影響因素。但腫瘤細胞是通過細胞膜表面的何種結構識別和轉運納米HA粒子的，則需要進一步研究。
