為克服羥基磷灰石/聚氨酯植入體材料界面結合力弱、羥基磷灰石在聚氨酯基體中分散性差等缺陷,論文采用原位復合法制備納米羥基磷灰石/聚氨酯復合材料,對材料的斷面微觀形貌、熱穩定性、玻璃化轉變溫度、力學性能進行了測定與分析,借助MG63細胞與復合材料共培養方法來評定復合材料的生物相容性。原位復合的方法可以提高界面結合強度、改善羥基磷灰石顆粒在聚氨酯基體中的分散性,并使材料力學性能得到明顯改善。結果表明,當羥基磷灰石的質量分數為20%時,聚氨酯的熱穩定性、玻璃化轉變溫度均得以提高;拉伸強度和斷裂伸長率最大,分別為6.83 MPa、861.17%,與純聚氨酯相比分別提高了236.45%和143.30%;細胞培養實驗可見該復合材料對細胞的黏附與增殖無不良影響。
引用本文： 谷牧青, 肖鳳娟, 梁曄, 岳林, 李松, 李蘭蘭, 馮菲菲. 羥基磷灰石/聚氨酯植入體材料的原位復合及其性能研究. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(4): 826-831. doi: 10.7507/1001-5515.20150149 復制
引言
羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)具有良好的骨融合性和成骨活性，能與骨組織形成牢固的化學鍵合[1-2]。但純的HA因脆性大、力學性能差、加工困難等缺點[3]，限制了它作為硬組織修復材料在承重部位的應用。聚氨酯(polyurethane，PU)材料以其優異的力學性能、良好的生物相容性和易加工性，在植入體內的醫療器械和人造器官等生物醫學領域發揮著重要作用[4-5]。另外，PU的可設計性強，可通過選擇不同嵌段和調節軟硬段比例，從而合成出具有不同化學結構、力學性能和熱性能的PU，以滿足不同的應用需求[6]，但PU缺乏與骨鍵合的生物活性。因此，制備羥基磷灰石/聚氨酯(hydroxyapatite/polyurethane，HA/PU)復合材料有望綜合二者的優點，從而得到綜合性能良好的骨替代材料。
近年來，國內外此類復合材料的制備方法主要有共混法(包括溶液共混法、干態共混法和熔融共混法)、溶膠凝膠法、仿生礦化法、原位復合法等[7-8]。其中，共混法操作簡單、易于工業化，不足在于只是簡單的物理混合，無化學結合，制得的復合材料界面結合力弱、力學性能差，雖采用偶聯劑修飾可起到積極作用，但因成本較高而受到限制。溶膠-凝膠法可較好地解決納米粒子團聚問題，并與聚合物基體形成化學鍵結合，但溶劑揮發致使材料收縮、易脆裂，且前驅物價格昂貴、毒性大。而仿生礦化法以生物體內的生物礦化機理為依據，可望所得復合材料更接近于人體骨成分，但其制備周期長且工藝還有待進一步完善。相比之下，原位復合法綜合了物理共混和化學反應二者的優點，制備過程中聚合物分子的末端基團與納米粒子表面發生化學反應而形成一點或多點錨固，大分子鏈外展形成空間位阻，且原位復合形成的網絡結構可穩定納米HA粒子，因而阻止了納米粒子的團聚現象。此外，原位復合過程中納米粒子和聚合物基體界面處產生的化學鍵合，可提高復合材料界面結合強度，進而提高了復合材料的力學性能。
本文采用原位復合法制備了HA/PU復合材料，并對該復合材料的斷面微觀形貌、熱穩定性、玻璃化轉變溫度、力學性能及生物相容性進行了測定分析。
1 實驗部分
1.1 材料及來源
蓖麻油(castor oil,CO，分析純)，為天津市富宇精細化工有限公司產品；異佛爾酮二異氰酸酯(isophorone diisocyanate,IPDI，化學純)，為國藥化學試劑有限公司產品；1,4-丁二醇(1,4-Butanediol,BDO，分析純)，為天津市光復精細化工研究所產品；二月桂酸二丁基錫(dibutyltin dilaurate,DBTDL，分析純)，為北京華業寰宇化工有限公司產品；HA為自制納米粉末，干燥密封保存；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)為國藥基團化學試劑有限公司產品；人骨肉瘤細胞(MG63細胞)為美國ATCC公司產品，細胞培養采用常規方法。
1.2 HA/PU復合材料的制備
以IPDI、CO、BDO、DBTDL、納米HA為原料，采用原位復合法制備HA/PU復合材料，反應中異氰酸酯(-NCO)摩爾數與總羥基(-OH)摩爾數(包括CO與BDO)之比為1.05∶1。制備過程如下：①按組分配比準確稱量CO，加入到裝有電動攪拌器的三口燒瓶中，按比例緩慢添加自制HA粉末并攪拌均勻，在110~120 ℃下真空減壓、脫水2 h；②降溫至40 ℃，稱量計量的IPDI置于恒壓滴液漏斗中，在氮氣保護下，緩慢滴加至三口燒瓶中，保溫反應3 h； ③反應停止后，真空脫泡30 min，得到HA/PU預聚體；④隨后將預聚體加熱到40 ℃，加入計量的擴鏈劑BDO，迅速攪拌均勻，再加入0.3 wt%的催化劑DBTDL，攪拌、真空脫泡10~15 min；⑤將混合溶液倒入預熱并涂覆脫模劑的模具中，置于電熱干燥箱中，70 ℃條件下固化20 h，制得HA/PU復合材料，室溫放置7 d后，對其進行性能測試。
1.3 HA/PU復合材料的物化性能測定
采用日本日立公司的S-570型掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察HA/PU復合材料斷面微觀形貌。熱穩定性測定在TGA/SDTA851e型熱重分析儀上進行，測試溫度為50~550 ℃，升溫速率10 ℃/min，載氣為氮氣，氣流速率為10 mL/min。采用DSC822e型差式掃描量熱儀對試樣的玻璃化轉化溫度進行測定，升溫速率10 ℃/min，載氣為氮氣，氣流速率為10 mL/min，測試范圍為30~180 ℃。純PU與HA/PU材料靜態力學性能利用XWW-10KN型電子萬能材料試驗機，依據國標GB/T 1040-92法進行測試，實驗試樣采用Ⅰ型試樣(雙鏟型)，斷裂伸長率的計算見式(1)。
| ${\varepsilon _\tau } = \frac{{G - {G_0}}}{{{G_0}}} \times 100\% $ |
式中，ετ——斷裂伸長率，%；G0——試樣原始標距，mm；G——試樣斷裂時標線間距離，mm。
1.4 生物相容性實驗
HA/PU(HA質量百分數為20%)復合材料經高壓消毒后置于24孔板內，用培養液及小牛血清浸泡1 d，將MG63細胞按1×104 Cell/mL的濃度滴加于每孔內，隨后置于標準環境(37 ℃，5% CO2，95%空氣)下孵育，隔天換液。實驗中以直接接種于24孔板作為空白對照組，實驗組與空白組均設三個平行樣本，利用倒置顯微鏡、掃描電鏡觀察不同時段細胞的形態與增殖生長情況。采用四唑鹽比色法(MTT法)測試細胞的增殖率，其具體操作如下：分別于第1、4、7、11天，每組取4孔，每孔加40 μL的MTT(2.5%)，在37 ℃條件下持續孵育4 h，停止培養。將孔內的培養基和MTT混合液吸棄后，每孔加入450 μL DMSO，輕搖6 min，于37 ℃孵箱中放置半小時。然后，用100 μL的加樣器，每孔取150 μL，每次取75 μL，將反應液移至96孔板中。采用570 nm波長來測定各孔的吸光度(optical density,OD)，求得第1、4、7、11天實驗組與空白組的OD平均值，最后對實驗組和空白組的細胞增殖情況進行比較分析。
2 結果與討論
2.1 HA加入量的影響
為考察HA加入量對復合材料性能的影響，在合成純PU條件下，異氰酸酯指數R值為1.05，擴鏈系數為0.9，催化劑加入量為0.3 wt%，在普通烘箱中于70 ℃固化20 h，采用預聚體法真空脫泡處理工藝，選擇HA的加入量為0%、5%、10%、15%、20%、30%、40%，得到的樣品外觀如圖 1所示。通過觀察比較，當HA微晶含量在20%以內時，隨HA加入量的增加，樣品透明度降低，力學性能逐漸提高，但當HA含量為30%時，HA微晶開始從PU中脫出，繼續增加HA含量到40%時，樣品中只有最上面一層反應均勻，中間部分基本上沒有參加反應，HA微晶從PU中脫出的現象較嚴重，表明HA與PU間的界面相容性已經變差，力學性能開始下降。由此，確定最合適的HA加入量為20%。選用上述適宜的條件合成的HA/PU樣品進行性能測定。
圖1
不同HA含量的樣品圖
Figure1.
Sample images with different HA content
2.2 HA/PU復合材料的形貌分析
圖 2(a)為HA/PU復合材料的斷面微觀形貌，可見HA粒子均勻分散于PU基體中，無團聚現象，起彌散增強的作用。圖 2(b)為HA/PU復合材料的低倍放大情況下的斷口形貌，云霧狀的淺色區域是PU硬段區，深色區域為軟段區，軟段、硬段分別積聚形成相互獨立的微區，表現為微相分離結構。原因在于在PU中加入HA粉體后，極性基團增多，硬段分子間的相互作用力增強，使其更容易發生硬段有序化積聚形成硬段微區。此外，具柔性分子結構的BDO[9-10]，與聚合物不混容，在大分子之間起到隔離作用，可減少PU鏈段運動的摩擦，縮短硬段相有序化松弛時間，使體系凝固時接近熱力學平衡狀態，即形成微相分離結構。
圖2
HA/PU復合材料的斷口形貌圖
(a)高倍斷口形貌圖;(b)低倍斷口形貌圖
Figure2. Fracture morphology images of HA/PU composites(a) fracture morphology images at high magnification; (b) fracture morphology images at low magnification
2.3 HA/PU復合材料的熱穩定性分析
與純PU對比分析HA/PU復合材料的熱穩定性，得到的熱重(thermalgravity，TG)曲線如圖 3(左)所示。純PU材料起始熱分解溫度為250 ℃，至460 ℃左右不再分解，失重率達到97.8%，而HA/PU復合材料的起始熱分解溫度在260 ℃左右，溫度達470 ℃后不再失重，失重率為80%，剩余20%為熱穩定性良好的HA。圖 3(右)為純PU與HA/PU復合材料的微商熱重(derivative thermogravimetry，DTG)曲線，可見純PU熱分解過程分三個階段，對應于DTG曲線上的三個失重峰；而HA/PU復合材料熱失重分為兩個階段。其中純PU在250~350 ℃處的失重峰是由于PU硬段分解出現失重峰，即PU主鏈上氨基甲酸酯基團中的C-O鍵斷裂，分解生成異氰酸酯和多元醇并進一步分解為胺類和CO2等氣體的失重造成的，在350 ℃~400 ℃的失重峰是由于PU軟段分解為乙烯、丙酮、環氧己烷等小分子有機物而產生的熱失重[11-12]；400~460 ℃為小分子有機物進一步分解為氣體的失重峰；與之相對，HA/PU復合材料的熱分解的第一階段溫度范圍在260~360 ℃，是PU硬段分解的失重峰，第二階段為360~470 ℃,是PU軟段分解的失重峰。與純PU相比，初始熱分解溫度和DTG曲線上的兩個失重峰均向高溫方向移動，說明在PU基體中添加HA，使得HA/PU復合材料的熱穩定性有所提高。原因在于HA中部分-OH與未交聯的末端-NCO反應生成氨基甲酸酯基團，增強了HA粒子與PU基體間的界面結合。另外，HA中部分-OH和PU基體羰基(-C=O)中的O形成氫鍵，增強了PU基體與HA之間的相互作用，從而提高復合材料的熱穩定性。
圖3
純PU和HA/PU復合材料的TG與DTG曲線
Figure3.
TG and DTG curves of pure PU and HA/PU Composites
2.4 HA/PU復合材料的玻璃化轉變溫度
純PU和HA/PU復合材料的差式掃描量熱法分析(differential scanning calorimeter，DSC)曲線如圖 4所示，可見純PU的玻璃化轉變溫度(Tg)為63.29 ℃左右，HA/PU復合材料的Tg約為74.16 ℃。HA/PU的Tg高于純PU的Tg，原因是加入HA后削弱了PU基體內分子鏈的柔順性，分子鏈段的活動能力下降，加之HA使得氫鍵作用增強，提高了PU分子鏈間的相互作用力，限制了高分子鏈的內旋轉，達到相應轉變的鏈段運動所需熱能增大，復合材料的Tg升高。此外，HA/PU復合材料在62.18 ℃附近出現了一個吸熱峰，原因是隨溫度的升高，PU基體內側基、支鏈、官能團、鏈結等小尺寸運動單元，它們的運動活化能較低，所需運動空間較小，故在未達到玻璃化轉變點之前，為達平衡狀態，出現了松弛現象，產生吸熱峰。
圖4
純PU和HA/PU復合材料的DSC曲線
Figure4.
DSC curves of pure PU and HA/PU Composites
2.5 HA/PU復合材料的力學性能分析
不同HA含量的HA/PU復合材料的拉伸強度和斷裂伸長率變化曲線如圖 5所示，可見復合材料的拉伸強度與斷裂伸長率的變化趨勢相一致。在HA含量為20%時，拉伸強度達到最大(6.83 MPa)，與純PU(2.03 MPa)相比，提高了236.45%；同時斷裂伸長率也達到最大(861.17%)，與純PU(353.95%)相比，提高了143.30%。由此可見，在PU基體中添加適量的HA，可提高復合材料的力學性能。增強原理概括為以下3點：①由于HA粒子均勻分散在PU基體中，當復合材料受外力作用時，作為分散相的剛性HA粒子能夠改變裂紋的擴展方向，吸收部分能量和分散應力，從而延緩破壞性裂紋的生長速率，提高材料的強度；②由于HA表面富含-OH，能與PU中的-NCO基團反應，共價鍵和氫鍵共同作用使HA/PU復合材料的界面粘結強度增強[13]，改善HA顆粒與PU基體間的應力傳遞，有效地將能量在傳遞過程中耗散，而對復合材料的整體強度影響較小[11, 14]。③軟、硬鏈段形成微相分離，使氨基甲酸酯硬鏈段的結晶性更好，而結晶和定向排列使聚合物分子間更容易形成氫鏈，即能產生較好的有序結晶，結晶的阻旋作用和聚合物鏈段遷移，最終使得HA/PU復合材料表現出優異力學性能。從圖中還可以看出，當HA含量超過20%時，HA/PU復合材料的拉伸強度和斷裂伸長率均呈下降趨勢，原因在于隨HA含量的增加，開始在基體中出現團聚現象，導致其表面積減小，使得HA與PU基體間的相互作用減弱[15]，甚至削弱氨基甲酸酯間的氫鍵作用，同時當材料受外力時，微粒團聚處易產生應力集中，降低了HA/PU復合材料的力學性能。
圖5
HA含量對HA/PU復合材料力學性能的影響
Figure5.
Effect of HA content on mechanical properties of HA/PU Composites
2.6 MG63細胞形態及增殖分析
利用倒置顯微鏡可觀察到細胞圍繞HA/PU復合材料的邊緣生長，細胞數目隨時間逐漸增長，且形態良好。圖 6是HA/PU復合材料與MG63細胞共培養7 d(圖 6左)和11 d(圖 6右)后的掃描電鏡圖。可見，MG63細胞與復合材料共培養7 d時，細胞呈紡錘狀及多角形，貼壁生長，此時細胞層數較少，但無細胞凋亡現象。培養11 d時，細胞生長旺盛，形態多為三角形及多邊形，其數目、層數明顯增加，成密集排列，通過偽足與材料緊密聯系。由此分析表明，HA/PU復合材料對細胞正常黏附、增殖無不良影響。
圖6
HA/PU復合材料與MG63細胞共培養7 d和11 d后的掃描電鏡圖
Figure6.
SEM images of MG63 cells cultured on HA/PU Composites for 7 days and 11 days
采用MTT法，以直接接種于培養板上的細胞為對照，比較MG63細胞在HA/PU復合材料上的增殖情況，見圖 7，由圖可見隨著時間增長，實驗組與空白對照組細胞的數目均呈上升趨勢。在第1天和第4天時，實驗組MTT值明顯高于空白對照組(P<0.05)。在第7天和第11天時，實驗組的MTT值增加幅度低于對照組，分析其原因可能是由于細胞排列致密，在加入DMSO后6 min輕度震蕩，不足以充分發揮DMSO的溶解作用。因此，造成實驗組的MTT值增長幅度下降。由細胞實驗結果表明，HA/PU復合材料對MG63細胞的正常生長、黏附、增殖無不良影響。為進一步排除HA/PU復合材料植入體內后發生免疫排斥及急性毒性等不良生物學反應，本課題組將在后續的實驗中，把HA/PU復合材料植入大鼠脊側肌肉內，定期觀察植入材料及周圍肌肉組織情況，為此復合材料的體內安全性、相容性提供參考依據。
圖7
MTT法檢測MG63細胞培養增殖情況
Figure7.
Results of proliferation of MG63 cells cultured on composites with MTT
3 結論
(1)采用原位復合法制備的HA/PU復合材料，HA粒子均勻分散于PU基體中起彌散強化作用，斷口形貌分析表明復合材料存在微相分離結構。
(2)將純PU與HA/PU復合材料對比分析，發現加入適量HA提高了復合材料的熱穩定性及玻璃化轉變溫度，且可同步提高PU材料的拉伸強度與斷裂伸長率，當HA質量分數為20%時，HA/PU復合材料的拉伸強度和斷裂伸長率最大，分別為6.83 MPa和861.17%，與純PU相比，分別提高了236.45%和143.30%。
(3)采用MG63細胞與HA/PU復合材料共培養方法，發現復合材料對細胞的粘黏與增殖并無不良影響，生物相容性良好。
引言
羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)具有良好的骨融合性和成骨活性，能與骨組織形成牢固的化學鍵合[1-2]。但純的HA因脆性大、力學性能差、加工困難等缺點[3]，限制了它作為硬組織修復材料在承重部位的應用。聚氨酯(polyurethane，PU)材料以其優異的力學性能、良好的生物相容性和易加工性，在植入體內的醫療器械和人造器官等生物醫學領域發揮著重要作用[4-5]。另外，PU的可設計性強，可通過選擇不同嵌段和調節軟硬段比例，從而合成出具有不同化學結構、力學性能和熱性能的PU，以滿足不同的應用需求[6]，但PU缺乏與骨鍵合的生物活性。因此，制備羥基磷灰石/聚氨酯(hydroxyapatite/polyurethane，HA/PU)復合材料有望綜合二者的優點，從而得到綜合性能良好的骨替代材料。
近年來，國內外此類復合材料的制備方法主要有共混法(包括溶液共混法、干態共混法和熔融共混法)、溶膠凝膠法、仿生礦化法、原位復合法等[7-8]。其中，共混法操作簡單、易于工業化，不足在于只是簡單的物理混合，無化學結合，制得的復合材料界面結合力弱、力學性能差，雖采用偶聯劑修飾可起到積極作用，但因成本較高而受到限制。溶膠-凝膠法可較好地解決納米粒子團聚問題，并與聚合物基體形成化學鍵結合，但溶劑揮發致使材料收縮、易脆裂，且前驅物價格昂貴、毒性大。而仿生礦化法以生物體內的生物礦化機理為依據，可望所得復合材料更接近于人體骨成分，但其制備周期長且工藝還有待進一步完善。相比之下，原位復合法綜合了物理共混和化學反應二者的優點，制備過程中聚合物分子的末端基團與納米粒子表面發生化學反應而形成一點或多點錨固，大分子鏈外展形成空間位阻，且原位復合形成的網絡結構可穩定納米HA粒子，因而阻止了納米粒子的團聚現象。此外，原位復合過程中納米粒子和聚合物基體界面處產生的化學鍵合，可提高復合材料界面結合強度，進而提高了復合材料的力學性能。
本文采用原位復合法制備了HA/PU復合材料，并對該復合材料的斷面微觀形貌、熱穩定性、玻璃化轉變溫度、力學性能及生物相容性進行了測定分析。
1 實驗部分
1.1 材料及來源
蓖麻油(castor oil,CO，分析純)，為天津市富宇精細化工有限公司產品；異佛爾酮二異氰酸酯(isophorone diisocyanate,IPDI，化學純)，為國藥化學試劑有限公司產品；1,4-丁二醇(1,4-Butanediol,BDO，分析純)，為天津市光復精細化工研究所產品；二月桂酸二丁基錫(dibutyltin dilaurate,DBTDL，分析純)，為北京華業寰宇化工有限公司產品；HA為自制納米粉末，干燥密封保存；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)為國藥基團化學試劑有限公司產品；人骨肉瘤細胞(MG63細胞)為美國ATCC公司產品，細胞培養采用常規方法。
1.2 HA/PU復合材料的制備
以IPDI、CO、BDO、DBTDL、納米HA為原料，采用原位復合法制備HA/PU復合材料，反應中異氰酸酯(-NCO)摩爾數與總羥基(-OH)摩爾數(包括CO與BDO)之比為1.05∶1。制備過程如下：①按組分配比準確稱量CO，加入到裝有電動攪拌器的三口燒瓶中，按比例緩慢添加自制HA粉末并攪拌均勻，在110~120 ℃下真空減壓、脫水2 h；②降溫至40 ℃，稱量計量的IPDI置于恒壓滴液漏斗中，在氮氣保護下，緩慢滴加至三口燒瓶中，保溫反應3 h； ③反應停止后，真空脫泡30 min，得到HA/PU預聚體；④隨后將預聚體加熱到40 ℃，加入計量的擴鏈劑BDO，迅速攪拌均勻，再加入0.3 wt%的催化劑DBTDL，攪拌、真空脫泡10~15 min；⑤將混合溶液倒入預熱并涂覆脫模劑的模具中，置于電熱干燥箱中，70 ℃條件下固化20 h，制得HA/PU復合材料，室溫放置7 d后，對其進行性能測試。
1.3 HA/PU復合材料的物化性能測定
采用日本日立公司的S-570型掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察HA/PU復合材料斷面微觀形貌。熱穩定性測定在TGA/SDTA851e型熱重分析儀上進行，測試溫度為50~550 ℃，升溫速率10 ℃/min，載氣為氮氣，氣流速率為10 mL/min。采用DSC822e型差式掃描量熱儀對試樣的玻璃化轉化溫度進行測定，升溫速率10 ℃/min，載氣為氮氣，氣流速率為10 mL/min，測試范圍為30~180 ℃。純PU與HA/PU材料靜態力學性能利用XWW-10KN型電子萬能材料試驗機，依據國標GB/T 1040-92法進行測試，實驗試樣采用Ⅰ型試樣(雙鏟型)，斷裂伸長率的計算見式(1)。
| ${\varepsilon _\tau } = \frac{{G - {G_0}}}{{{G_0}}} \times 100\% $ |
式中，ετ——斷裂伸長率，%；G0——試樣原始標距，mm；G——試樣斷裂時標線間距離，mm。
1.4 生物相容性實驗
HA/PU(HA質量百分數為20%)復合材料經高壓消毒后置于24孔板內，用培養液及小牛血清浸泡1 d，將MG63細胞按1×104 Cell/mL的濃度滴加于每孔內，隨后置于標準環境(37 ℃，5% CO2，95%空氣)下孵育，隔天換液。實驗中以直接接種于24孔板作為空白對照組，實驗組與空白組均設三個平行樣本，利用倒置顯微鏡、掃描電鏡觀察不同時段細胞的形態與增殖生長情況。采用四唑鹽比色法(MTT法)測試細胞的增殖率，其具體操作如下：分別于第1、4、7、11天，每組取4孔，每孔加40 μL的MTT(2.5%)，在37 ℃條件下持續孵育4 h，停止培養。將孔內的培養基和MTT混合液吸棄后，每孔加入450 μL DMSO，輕搖6 min，于37 ℃孵箱中放置半小時。然后，用100 μL的加樣器，每孔取150 μL，每次取75 μL，將反應液移至96孔板中。采用570 nm波長來測定各孔的吸光度(optical density,OD)，求得第1、4、7、11天實驗組與空白組的OD平均值，最后對實驗組和空白組的細胞增殖情況進行比較分析。
2 結果與討論
2.1 HA加入量的影響
為考察HA加入量對復合材料性能的影響，在合成純PU條件下，異氰酸酯指數R值為1.05，擴鏈系數為0.9，催化劑加入量為0.3 wt%，在普通烘箱中于70 ℃固化20 h，采用預聚體法真空脫泡處理工藝，選擇HA的加入量為0%、5%、10%、15%、20%、30%、40%，得到的樣品外觀如圖 1所示。通過觀察比較，當HA微晶含量在20%以內時，隨HA加入量的增加，樣品透明度降低，力學性能逐漸提高，但當HA含量為30%時，HA微晶開始從PU中脫出，繼續增加HA含量到40%時，樣品中只有最上面一層反應均勻，中間部分基本上沒有參加反應，HA微晶從PU中脫出的現象較嚴重，表明HA與PU間的界面相容性已經變差，力學性能開始下降。由此，確定最合適的HA加入量為20%。選用上述適宜的條件合成的HA/PU樣品進行性能測定。
圖1
不同HA含量的樣品圖
Figure1.
Sample images with different HA content
2.2 HA/PU復合材料的形貌分析
圖 2(a)為HA/PU復合材料的斷面微觀形貌，可見HA粒子均勻分散于PU基體中，無團聚現象，起彌散增強的作用。圖 2(b)為HA/PU復合材料的低倍放大情況下的斷口形貌，云霧狀的淺色區域是PU硬段區，深色區域為軟段區，軟段、硬段分別積聚形成相互獨立的微區，表現為微相分離結構。原因在于在PU中加入HA粉體后，極性基團增多，硬段分子間的相互作用力增強，使其更容易發生硬段有序化積聚形成硬段微區。此外，具柔性分子結構的BDO[9-10]，與聚合物不混容，在大分子之間起到隔離作用，可減少PU鏈段運動的摩擦，縮短硬段相有序化松弛時間，使體系凝固時接近熱力學平衡狀態，即形成微相分離結構。
圖2
HA/PU復合材料的斷口形貌圖
(a)高倍斷口形貌圖;(b)低倍斷口形貌圖
Figure2. Fracture morphology images of HA/PU composites(a) fracture morphology images at high magnification; (b) fracture morphology images at low magnification
2.3 HA/PU復合材料的熱穩定性分析
與純PU對比分析HA/PU復合材料的熱穩定性，得到的熱重(thermalgravity，TG)曲線如圖 3(左)所示。純PU材料起始熱分解溫度為250 ℃，至460 ℃左右不再分解，失重率達到97.8%，而HA/PU復合材料的起始熱分解溫度在260 ℃左右，溫度達470 ℃后不再失重，失重率為80%，剩余20%為熱穩定性良好的HA。圖 3(右)為純PU與HA/PU復合材料的微商熱重(derivative thermogravimetry，DTG)曲線，可見純PU熱分解過程分三個階段，對應于DTG曲線上的三個失重峰；而HA/PU復合材料熱失重分為兩個階段。其中純PU在250~350 ℃處的失重峰是由于PU硬段分解出現失重峰，即PU主鏈上氨基甲酸酯基團中的C-O鍵斷裂，分解生成異氰酸酯和多元醇并進一步分解為胺類和CO2等氣體的失重造成的，在350 ℃~400 ℃的失重峰是由于PU軟段分解為乙烯、丙酮、環氧己烷等小分子有機物而產生的熱失重[11-12]；400~460 ℃為小分子有機物進一步分解為氣體的失重峰；與之相對，HA/PU復合材料的熱分解的第一階段溫度范圍在260~360 ℃，是PU硬段分解的失重峰，第二階段為360~470 ℃,是PU軟段分解的失重峰。與純PU相比，初始熱分解溫度和DTG曲線上的兩個失重峰均向高溫方向移動，說明在PU基體中添加HA，使得HA/PU復合材料的熱穩定性有所提高。原因在于HA中部分-OH與未交聯的末端-NCO反應生成氨基甲酸酯基團，增強了HA粒子與PU基體間的界面結合。另外，HA中部分-OH和PU基體羰基(-C=O)中的O形成氫鍵，增強了PU基體與HA之間的相互作用，從而提高復合材料的熱穩定性。
圖3
純PU和HA/PU復合材料的TG與DTG曲線
Figure3.
TG and DTG curves of pure PU and HA/PU Composites
2.4 HA/PU復合材料的玻璃化轉變溫度
純PU和HA/PU復合材料的差式掃描量熱法分析(differential scanning calorimeter，DSC)曲線如圖 4所示，可見純PU的玻璃化轉變溫度(Tg)為63.29 ℃左右，HA/PU復合材料的Tg約為74.16 ℃。HA/PU的Tg高于純PU的Tg，原因是加入HA后削弱了PU基體內分子鏈的柔順性，分子鏈段的活動能力下降，加之HA使得氫鍵作用增強，提高了PU分子鏈間的相互作用力，限制了高分子鏈的內旋轉，達到相應轉變的鏈段運動所需熱能增大，復合材料的Tg升高。此外，HA/PU復合材料在62.18 ℃附近出現了一個吸熱峰，原因是隨溫度的升高，PU基體內側基、支鏈、官能團、鏈結等小尺寸運動單元，它們的運動活化能較低，所需運動空間較小，故在未達到玻璃化轉變點之前，為達平衡狀態，出現了松弛現象，產生吸熱峰。
圖4
純PU和HA/PU復合材料的DSC曲線
Figure4.
DSC curves of pure PU and HA/PU Composites
2.5 HA/PU復合材料的力學性能分析
不同HA含量的HA/PU復合材料的拉伸強度和斷裂伸長率變化曲線如圖 5所示，可見復合材料的拉伸強度與斷裂伸長率的變化趨勢相一致。在HA含量為20%時，拉伸強度達到最大(6.83 MPa)，與純PU(2.03 MPa)相比，提高了236.45%；同時斷裂伸長率也達到最大(861.17%)，與純PU(353.95%)相比，提高了143.30%。由此可見，在PU基體中添加適量的HA，可提高復合材料的力學性能。增強原理概括為以下3點：①由于HA粒子均勻分散在PU基體中，當復合材料受外力作用時，作為分散相的剛性HA粒子能夠改變裂紋的擴展方向，吸收部分能量和分散應力，從而延緩破壞性裂紋的生長速率，提高材料的強度；②由于HA表面富含-OH，能與PU中的-NCO基團反應，共價鍵和氫鍵共同作用使HA/PU復合材料的界面粘結強度增強[13]，改善HA顆粒與PU基體間的應力傳遞，有效地將能量在傳遞過程中耗散，而對復合材料的整體強度影響較小[11, 14]。③軟、硬鏈段形成微相分離，使氨基甲酸酯硬鏈段的結晶性更好，而結晶和定向排列使聚合物分子間更容易形成氫鏈，即能產生較好的有序結晶，結晶的阻旋作用和聚合物鏈段遷移，最終使得HA/PU復合材料表現出優異力學性能。從圖中還可以看出，當HA含量超過20%時，HA/PU復合材料的拉伸強度和斷裂伸長率均呈下降趨勢，原因在于隨HA含量的增加，開始在基體中出現團聚現象，導致其表面積減小，使得HA與PU基體間的相互作用減弱[15]，甚至削弱氨基甲酸酯間的氫鍵作用，同時當材料受外力時，微粒團聚處易產生應力集中，降低了HA/PU復合材料的力學性能。
圖5
HA含量對HA/PU復合材料力學性能的影響
Figure5.
Effect of HA content on mechanical properties of HA/PU Composites
2.6 MG63細胞形態及增殖分析
利用倒置顯微鏡可觀察到細胞圍繞HA/PU復合材料的邊緣生長，細胞數目隨時間逐漸增長，且形態良好。圖 6是HA/PU復合材料與MG63細胞共培養7 d(圖 6左)和11 d(圖 6右)后的掃描電鏡圖。可見，MG63細胞與復合材料共培養7 d時，細胞呈紡錘狀及多角形，貼壁生長，此時細胞層數較少，但無細胞凋亡現象。培養11 d時，細胞生長旺盛，形態多為三角形及多邊形，其數目、層數明顯增加，成密集排列，通過偽足與材料緊密聯系。由此分析表明，HA/PU復合材料對細胞正常黏附、增殖無不良影響。
圖6
HA/PU復合材料與MG63細胞共培養7 d和11 d后的掃描電鏡圖
Figure6.
SEM images of MG63 cells cultured on HA/PU Composites for 7 days and 11 days
采用MTT法，以直接接種于培養板上的細胞為對照，比較MG63細胞在HA/PU復合材料上的增殖情況，見圖 7，由圖可見隨著時間增長，實驗組與空白對照組細胞的數目均呈上升趨勢。在第1天和第4天時，實驗組MTT值明顯高于空白對照組(P<0.05)。在第7天和第11天時，實驗組的MTT值增加幅度低于對照組，分析其原因可能是由于細胞排列致密，在加入DMSO后6 min輕度震蕩，不足以充分發揮DMSO的溶解作用。因此，造成實驗組的MTT值增長幅度下降。由細胞實驗結果表明，HA/PU復合材料對MG63細胞的正常生長、黏附、增殖無不良影響。為進一步排除HA/PU復合材料植入體內后發生免疫排斥及急性毒性等不良生物學反應，本課題組將在后續的實驗中，把HA/PU復合材料植入大鼠脊側肌肉內，定期觀察植入材料及周圍肌肉組織情況，為此復合材料的體內安全性、相容性提供參考依據。
圖7
MTT法檢測MG63細胞培養增殖情況
Figure7.
Results of proliferation of MG63 cells cultured on composites with MTT
3 結論
(1)采用原位復合法制備的HA/PU復合材料，HA粒子均勻分散于PU基體中起彌散強化作用，斷口形貌分析表明復合材料存在微相分離結構。
(2)將純PU與HA/PU復合材料對比分析，發現加入適量HA提高了復合材料的熱穩定性及玻璃化轉變溫度，且可同步提高PU材料的拉伸強度與斷裂伸長率，當HA質量分數為20%時，HA/PU復合材料的拉伸強度和斷裂伸長率最大，分別為6.83 MPa和861.17%，與純PU相比，分別提高了236.45%和143.30%。
(3)采用MG63細胞與HA/PU復合材料共培養方法，發現復合材料對細胞的粘黏與增殖并無不良影響，生物相容性良好。
