表觀遺傳學對骨髓間充質干細胞的調控作用已經成為醫學領域的研究熱點。本文主要綜述了DNA甲基化、組蛋白乙酰化、小干擾RNA(siRNA)誘導基因沉默以及微小RNA(miRNA)四個方面對骨髓間充質干細胞調控作用的進展。結果表明, 表觀遺傳學對骨髓間充質干細胞的調控作用在骨修復、神經修復和心肌修復等方面的應用具有重要的意義。
引用本文： 陳志浩, 方淑斌, 田京. 表觀遺傳學對骨髓間充質干細胞調控作用的研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(3): 680-683. doi: 10.7507/1001-5515.20150123 復制
引言
表觀遺傳學是指DNA序列不發生變化而基因表達卻發生了可遺傳的改變的一門遺傳學分支學科，主要機制包括：DNA甲基化、組蛋白修飾、基因沉默，廣義上還包括微小RNA(microRNA, miRNA)的調控等[1]。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的干細胞群體，具有多向分化潛能, 在細胞工程和基因工程中具有潛在應用前景，在再生醫學中具有重要的臨床應用價值[2]。近年來，表觀遺傳學在骨髓間充質干細胞凋亡與分化的調控作用研究中的應用已經成為熱點，極大地促進了再生醫學的發展，本文對主要研究進展作一綜述。
1 DNA甲基化調控骨髓間充質干細胞的凋亡與分化
DNA甲基化是最重要的一種表觀遺傳學修飾方式，是指在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases, DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，在CpG二核苷酸5′胞嘧啶的第5位碳原子上加一甲基基團，使之變成5′-甲基胞嘧啶的化學修飾過程[3]。其中，DNA啟動子高甲基化能下調相應基因的表達，對骨髓間充質干細胞的凋亡有重要的調控作用。Choi等[4]通過對比第5代與第15代骨髓間充質干細胞中DNA的甲基化模式，研究DNA甲基化對骨髓間充質干細胞衰老的調控作用, 發現與DNA復制、細胞周期及過氧化物酶體增殖物活化受體信號通路相關基因的高甲基化可能為導致骨髓間充質干細胞衰老的重要原因。這意味著上述基因可能成為延緩骨髓間充質干細胞凋亡的重要靶點。此外，DNA啟動子低甲基化則能上調基因的表達。Naeem等[5]用兩種去甲基化藥物zebularine和5-氮胞苷處理骨髓間充質干細胞，并分別用RT-PCR和免疫化學的方法測定心臟特異性基因和心肌特異性蛋白的表達水平，發現GATA4和Nkx2.5基因編碼的mRNA、蛋白質，以及心肌肌鈣蛋白T均可標測到，從而表明用DNA去甲基化藥物可促使骨髓間充質干細胞轉化形成心肌細胞。因此，DNA啟動子的甲基化與去甲基化均可通過調控相應基因靶點的表達，從而調控骨髓間充質干細胞的分化與凋亡。
2 組蛋白乙酰化調控骨髓間充質干細胞的分化
組蛋白乙酰化是通過組蛋白乙酰基轉移酶(histone acetylases, HATs)和組蛋白去乙酰化酶(histone acetyltransferase, HDACs)協調完成的，常見于組蛋白H3的Lys9、14、18、23和H4的Lys5、8、12、16等位點，其可使核小體的結構變得松弛，促進轉錄因子和協同轉錄因子與DNA分子接觸，從而激活特定基因的轉錄過程[6]。組蛋白的去乙酰化是HDACs使啟動子不易接近轉錄調控元件，從而抑制轉錄，和基因的失活相關。Dong等[7]用HDACs抑制劑丙戊酸處理骨髓間充質干細胞72 h，發現肝臟特異性標記物在mRNA和蛋白質水平均顯著提高，同時丙戊酸可顯著提高骨髓間充質干細胞分化形成的肝細胞功能，如糖原儲存、細胞色素酶P450的活性以及甲胎蛋白和白蛋白合成均顯著提高；通過進一步研究發現，骨髓間充質干細胞經丙戊酸處理后細胞中組蛋白H3、H4乙酰化程度增加，從而表明丙戊酸可能通過抑制HDACs的活性而增加染色質的乙酰化狀態，進而促進骨髓間充質干細胞向肝細胞方向分化。然而，目前關于組蛋白乙酰化對骨髓間充質干細胞調控作用的研究仍然相對較少，需要更多的研究對其進行深入地探討。
3 siRNA誘導基因沉默調控骨髓間充質干細胞的凋亡
人工導入、RNA病毒、轉座子或重復序列等dsRNA被Dicer酶加工成長為21~26 nt的小干擾RNA(small interfering, siRNA)，這些siRNA可與一些蛋白組分形成一個沉默效應復合體，從而降解與siRNA互補的mRNA序列進而誘導基因沉默。Smac基因作為新發現的一種由線粒體釋放的促凋亡蛋白, 其可參與細胞凋亡的線粒體通路和死亡受體通路的下游反應, 通過特異性地結合凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs), 解除IAPs對Caspase的抑制作用，從而促進細胞凋亡。陸超等[8-9]利用Par4-siRNA誘導Par4基因沉默，探討Par4基因沉默對人骨髓間充質干細胞中Smac基因表達的影響。研究結果表明，設計的Par4-siRNA可顯著誘導骨髓間充質干細胞中Par4基因沉默，進而拮抗谷氨酸對骨髓間充質干細胞凋亡的誘導作用，而后者可能與Par4-siRNA對谷氨酸誘導的骨髓間充質干細胞中Smac蛋白表達上調，進而上調Caspase-3的活性密切相關。骨髓間充質干細胞移植在修復梗死心肌組織中有著良好的應用前景，而氧化應激作用使大部分移植后的骨髓間充質干細胞存活時間短，從而限制了該療法的廣泛應用。Hua等[10]為研究siRNA靶向下調Caspase-3的表達對骨髓間充質干細胞凋亡的影響，通過初步實驗表明，轉染Caspase-3 siRNA的骨髓間充質干細胞中編碼Caspase-3酶的mRNA及Caspase-3酶的表達量均比非轉染的骨髓間充質干細胞低。在此基礎上，其用含雙氧水的培養基培養骨髓間充質干細胞以誘導其凋亡過程，發現雙氧水誘導凋亡的骨髓間充質干細胞與正常骨髓間充質干細胞轉染Caspase-3 siRNA后，前者編碼Caspase-3酶的mRNA顯著高于后者，從而表明siRNA可通過靶向下調Caspase-3的表達，顯著提高氧化應激作用下的骨髓間充質干細胞的存活率。由于調控細胞凋亡的基因數量巨大，在對這些基因進行深入分析的基礎上設計出相應的siRNA誘導基因沉默，因此siRNA在調控細胞凋亡方面有著良好的應用前景。
4 miRNA調控骨髓間充質干細胞的分化
miRNA是一類具有調控功能的內源性非編碼RNA，其大小為20～25個核苷酸，可通過結合靶mRNA中的3′非編碼區，從而降解靶mRNA或阻遏靶mRNA的翻譯。據統計，人類約有30%的基因受到miRNA的調控。目前相關研究表明，miRNA在調控骨髓間充質干細胞的神經分化、成骨分化及心肌分化方面有著重要的作用。研究表明，miRNA-124[11]/125b[12]/9[13]均可誘導骨髓間充質干細胞的神經分化，其中，miRNA-124/125b調控骨髓間充質干細胞的神經分化主要與上調細胞中β3微管蛋白和微管相關蛋白2表達率密切相關，而miRNA-9則可能通過Notch-9信號通路[13]或鋅指蛋白521[14]調控骨髓間充質干細胞的神經分化。在萎縮性骨不連組織中，hsa-miRNA-149、hsa-miRNA-654-5p和hsa-miRNA-221的表達上調，而魏鈞強[15-16]等則通過定量實時PCR和免疫印跡法測定第4代人骨髓間充質干細胞的成骨分化過程相關基因編碼的mRNA和蛋白質在不同時間的表達水平, 發現堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein, BMP-2)和血小板源生長因子A(platelet-derived growth factor A, PDGF-A)均顯著增加，hsa-miRNA-149和hsa-miRNA-654-5p分別能負性調控ALP和BMP-2基因編碼的mRNA與蛋白質水平，而hsa-miRNA-221則與PDGF-A無明顯關系，其中hsa-miRNA-654-5p可通過作用于BMP-2的特定靶點而直接抑制BMP-2的mRNA和蛋白表達，但hsa-miRNA-149是否也通過作用于ALP的特定靶點而直接抑制BMP-2的mRNA和蛋白表達則仍需進一步的研究去探索。此外，miRNA-125b能特異性與Smad4 mRNA的3'-UTR結合，而干擾Smad4表達則能抑制ALP活性及RUNX2 mRNA表達水平，因此miRNA-125b可通過抑制靶基因Smad4的表達調控骨髓間充質干細胞的成骨分化[17]，而miRNA-31可通過抑制骨特異性轉錄因子Osterix的表達調控骨髓間充質干細胞的成骨分化[18]，相關研究表明，miRNA-146a[19]、miRNA-26a[20]和miRNA-30a-5P[21]可能參與調控骨髓間充質干細胞的成骨分化，但是具體的機制則仍不清楚。此外，Liu等[22]通過研究表明miRNA-16可以通過抑制CCND1、CCND2和CDK6基因的表達，誘導骨髓間充質干細胞分裂阻滯于G1期，進而促使骨髓間充質干細胞向心肌細胞方向分化。相關研究初步表明miRNA-424[23]和miRNA-499[24]可誘導大鼠骨髓來源間充質干細胞向心肌樣細胞分化，但其具體的機制則仍需要進一步研究去探討。
5 展望
綜上所述，DNA甲基化、組蛋白乙酰化、siRNA誘導基因沉默以及miRNA能夠調控骨髓間充質干細胞的凋亡與分化，促進骨髓間充質干細胞在骨修復、神經修復和心肌修復等方面的應用。然而，表觀遺傳學在骨髓間充質干細胞研究中的應用仍然存在諸多不足。首先，miRNA-146a、miRNA-26a和miRNA-30a-5P調控骨髓間充質干細胞成骨分化，以及miRNA-424和miRNA-499調控骨髓間充質干細胞心肌分化的具體機制仍然不清楚；其次，許多研究仍處于基礎研究階段，如何與臨床治療更好地結合起來則需要進一步的探索。因此，表觀遺傳學在骨髓間充質干細胞的調控方面具有良好的應用前景，但是仍需更多深入地去探討研究。
引言
表觀遺傳學是指DNA序列不發生變化而基因表達卻發生了可遺傳的改變的一門遺傳學分支學科，主要機制包括：DNA甲基化、組蛋白修飾、基因沉默，廣義上還包括微小RNA(microRNA, miRNA)的調控等[1]。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的干細胞群體，具有多向分化潛能, 在細胞工程和基因工程中具有潛在應用前景，在再生醫學中具有重要的臨床應用價值[2]。近年來，表觀遺傳學在骨髓間充質干細胞凋亡與分化的調控作用研究中的應用已經成為熱點，極大地促進了再生醫學的發展，本文對主要研究進展作一綜述。
1 DNA甲基化調控骨髓間充質干細胞的凋亡與分化
DNA甲基化是最重要的一種表觀遺傳學修飾方式，是指在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases, DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，在CpG二核苷酸5′胞嘧啶的第5位碳原子上加一甲基基團，使之變成5′-甲基胞嘧啶的化學修飾過程[3]。其中，DNA啟動子高甲基化能下調相應基因的表達，對骨髓間充質干細胞的凋亡有重要的調控作用。Choi等[4]通過對比第5代與第15代骨髓間充質干細胞中DNA的甲基化模式，研究DNA甲基化對骨髓間充質干細胞衰老的調控作用, 發現與DNA復制、細胞周期及過氧化物酶體增殖物活化受體信號通路相關基因的高甲基化可能為導致骨髓間充質干細胞衰老的重要原因。這意味著上述基因可能成為延緩骨髓間充質干細胞凋亡的重要靶點。此外，DNA啟動子低甲基化則能上調基因的表達。Naeem等[5]用兩種去甲基化藥物zebularine和5-氮胞苷處理骨髓間充質干細胞，并分別用RT-PCR和免疫化學的方法測定心臟特異性基因和心肌特異性蛋白的表達水平，發現GATA4和Nkx2.5基因編碼的mRNA、蛋白質，以及心肌肌鈣蛋白T均可標測到，從而表明用DNA去甲基化藥物可促使骨髓間充質干細胞轉化形成心肌細胞。因此，DNA啟動子的甲基化與去甲基化均可通過調控相應基因靶點的表達，從而調控骨髓間充質干細胞的分化與凋亡。
2 組蛋白乙酰化調控骨髓間充質干細胞的分化
組蛋白乙酰化是通過組蛋白乙酰基轉移酶(histone acetylases, HATs)和組蛋白去乙酰化酶(histone acetyltransferase, HDACs)協調完成的，常見于組蛋白H3的Lys9、14、18、23和H4的Lys5、8、12、16等位點，其可使核小體的結構變得松弛，促進轉錄因子和協同轉錄因子與DNA分子接觸，從而激活特定基因的轉錄過程[6]。組蛋白的去乙酰化是HDACs使啟動子不易接近轉錄調控元件，從而抑制轉錄，和基因的失活相關。Dong等[7]用HDACs抑制劑丙戊酸處理骨髓間充質干細胞72 h，發現肝臟特異性標記物在mRNA和蛋白質水平均顯著提高，同時丙戊酸可顯著提高骨髓間充質干細胞分化形成的肝細胞功能，如糖原儲存、細胞色素酶P450的活性以及甲胎蛋白和白蛋白合成均顯著提高；通過進一步研究發現，骨髓間充質干細胞經丙戊酸處理后細胞中組蛋白H3、H4乙酰化程度增加，從而表明丙戊酸可能通過抑制HDACs的活性而增加染色質的乙酰化狀態，進而促進骨髓間充質干細胞向肝細胞方向分化。然而，目前關于組蛋白乙酰化對骨髓間充質干細胞調控作用的研究仍然相對較少，需要更多的研究對其進行深入地探討。
3 siRNA誘導基因沉默調控骨髓間充質干細胞的凋亡
人工導入、RNA病毒、轉座子或重復序列等dsRNA被Dicer酶加工成長為21~26 nt的小干擾RNA(small interfering, siRNA)，這些siRNA可與一些蛋白組分形成一個沉默效應復合體，從而降解與siRNA互補的mRNA序列進而誘導基因沉默。Smac基因作為新發現的一種由線粒體釋放的促凋亡蛋白, 其可參與細胞凋亡的線粒體通路和死亡受體通路的下游反應, 通過特異性地結合凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs), 解除IAPs對Caspase的抑制作用，從而促進細胞凋亡。陸超等[8-9]利用Par4-siRNA誘導Par4基因沉默，探討Par4基因沉默對人骨髓間充質干細胞中Smac基因表達的影響。研究結果表明，設計的Par4-siRNA可顯著誘導骨髓間充質干細胞中Par4基因沉默，進而拮抗谷氨酸對骨髓間充質干細胞凋亡的誘導作用，而后者可能與Par4-siRNA對谷氨酸誘導的骨髓間充質干細胞中Smac蛋白表達上調，進而上調Caspase-3的活性密切相關。骨髓間充質干細胞移植在修復梗死心肌組織中有著良好的應用前景，而氧化應激作用使大部分移植后的骨髓間充質干細胞存活時間短，從而限制了該療法的廣泛應用。Hua等[10]為研究siRNA靶向下調Caspase-3的表達對骨髓間充質干細胞凋亡的影響，通過初步實驗表明，轉染Caspase-3 siRNA的骨髓間充質干細胞中編碼Caspase-3酶的mRNA及Caspase-3酶的表達量均比非轉染的骨髓間充質干細胞低。在此基礎上，其用含雙氧水的培養基培養骨髓間充質干細胞以誘導其凋亡過程，發現雙氧水誘導凋亡的骨髓間充質干細胞與正常骨髓間充質干細胞轉染Caspase-3 siRNA后，前者編碼Caspase-3酶的mRNA顯著高于后者，從而表明siRNA可通過靶向下調Caspase-3的表達，顯著提高氧化應激作用下的骨髓間充質干細胞的存活率。由于調控細胞凋亡的基因數量巨大，在對這些基因進行深入分析的基礎上設計出相應的siRNA誘導基因沉默，因此siRNA在調控細胞凋亡方面有著良好的應用前景。
4 miRNA調控骨髓間充質干細胞的分化
miRNA是一類具有調控功能的內源性非編碼RNA，其大小為20～25個核苷酸，可通過結合靶mRNA中的3′非編碼區，從而降解靶mRNA或阻遏靶mRNA的翻譯。據統計，人類約有30%的基因受到miRNA的調控。目前相關研究表明，miRNA在調控骨髓間充質干細胞的神經分化、成骨分化及心肌分化方面有著重要的作用。研究表明，miRNA-124[11]/125b[12]/9[13]均可誘導骨髓間充質干細胞的神經分化，其中，miRNA-124/125b調控骨髓間充質干細胞的神經分化主要與上調細胞中β3微管蛋白和微管相關蛋白2表達率密切相關，而miRNA-9則可能通過Notch-9信號通路[13]或鋅指蛋白521[14]調控骨髓間充質干細胞的神經分化。在萎縮性骨不連組織中，hsa-miRNA-149、hsa-miRNA-654-5p和hsa-miRNA-221的表達上調，而魏鈞強[15-16]等則通過定量實時PCR和免疫印跡法測定第4代人骨髓間充質干細胞的成骨分化過程相關基因編碼的mRNA和蛋白質在不同時間的表達水平, 發現堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein, BMP-2)和血小板源生長因子A(platelet-derived growth factor A, PDGF-A)均顯著增加，hsa-miRNA-149和hsa-miRNA-654-5p分別能負性調控ALP和BMP-2基因編碼的mRNA與蛋白質水平，而hsa-miRNA-221則與PDGF-A無明顯關系，其中hsa-miRNA-654-5p可通過作用于BMP-2的特定靶點而直接抑制BMP-2的mRNA和蛋白表達，但hsa-miRNA-149是否也通過作用于ALP的特定靶點而直接抑制BMP-2的mRNA和蛋白表達則仍需進一步的研究去探索。此外，miRNA-125b能特異性與Smad4 mRNA的3'-UTR結合，而干擾Smad4表達則能抑制ALP活性及RUNX2 mRNA表達水平，因此miRNA-125b可通過抑制靶基因Smad4的表達調控骨髓間充質干細胞的成骨分化[17]，而miRNA-31可通過抑制骨特異性轉錄因子Osterix的表達調控骨髓間充質干細胞的成骨分化[18]，相關研究表明，miRNA-146a[19]、miRNA-26a[20]和miRNA-30a-5P[21]可能參與調控骨髓間充質干細胞的成骨分化，但是具體的機制則仍不清楚。此外，Liu等[22]通過研究表明miRNA-16可以通過抑制CCND1、CCND2和CDK6基因的表達，誘導骨髓間充質干細胞分裂阻滯于G1期，進而促使骨髓間充質干細胞向心肌細胞方向分化。相關研究初步表明miRNA-424[23]和miRNA-499[24]可誘導大鼠骨髓來源間充質干細胞向心肌樣細胞分化，但其具體的機制則仍需要進一步研究去探討。
5 展望
綜上所述，DNA甲基化、組蛋白乙酰化、siRNA誘導基因沉默以及miRNA能夠調控骨髓間充質干細胞的凋亡與分化，促進骨髓間充質干細胞在骨修復、神經修復和心肌修復等方面的應用。然而，表觀遺傳學在骨髓間充質干細胞研究中的應用仍然存在諸多不足。首先，miRNA-146a、miRNA-26a和miRNA-30a-5P調控骨髓間充質干細胞成骨分化，以及miRNA-424和miRNA-499調控骨髓間充質干細胞心肌分化的具體機制仍然不清楚；其次，許多研究仍處于基礎研究階段，如何與臨床治療更好地結合起來則需要進一步的探索。因此，表觀遺傳學在骨髓間充質干細胞的調控方面具有良好的應用前景，但是仍需更多深入地去探討研究。