臨床上對于免疫缺陷或者免疫抑制的患者而言, 真菌感染是不可忽視的問題。近十年, 真菌感染致死的病例不斷增多, 發展抗真菌疫苗重新受到研究工作者的關注。樹突狀細胞(DC)是體內唯一能破解真菌信號并能將信息有效傳遞給不同的輔助性T淋巴細胞激活免疫反應的細胞。最新的研究表明, 基于DC的靶向疫苗策略具有抗真菌潛力。本文論述了DC抗真菌疫苗策略及其可行性的研究進展。
引用本文： 范國鑫, 王龍, 王悅葉, 趙培林. 樹突狀細胞抗真菌疫苗的可行性研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(3): 684-687. doi: 10.7507/1001-5515.20150124 復制
引言
侵襲性真菌感染是臨床上非常棘手的問題，致死率可高達30%~50%[1]。然而，真菌在人類感染的所有病原體中研究最少[1]。盡管近二十年體內抗真菌藥物研究有了較大發展，但真菌病原體感染致死率依然不斷提升，主要是因為這類患者免疫力多數受到抑制，比如艾滋病患者、器官移植受體、腫瘤患者等。曲霉菌、白色念珠菌、新型隱球菌三大機會致病菌對免疫力缺陷或抑制的患者來說是致命的威脅[2-4]。研究表明[5]，發展抗真菌的疫苗將給免疫缺陷或抑制的患者帶來福音，免疫疫苗治療有望成為臨床上抗真菌感染的新策略。
樹突狀細胞(dendritic cell, DC)是抗原遞呈能力最強的抗原提呈細胞(antigen presenting cell, APC)[6]。DC疫苗抗腫瘤的臨床試驗在2010年4月29日得到美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration, FDA)的批準[7]。美國洛克菲勒大學教授Ralph M．Steinman因“發現樹突狀細胞及其在獲得性免疫中的作用”而獲得2011年的諾貝爾生理學或醫學獎[8]。機體抵抗和清除真菌依賴于固有免疫應答和獲得性免疫應答的調動和相互協調[9]，而DC就是在固有免疫應答和獲得性免疫應答中扮演中間人的角色，也是唯一的活化初始T細胞的抗原提呈細胞[10]。DC通過啟動和協調輔助性T淋巴細胞(T help, Th)、調節性T淋巴細胞(regulatory cell, Treg)及效應性T細胞的應答，以調動固有免疫和適應性免疫發揮抵抗清除真菌的作用[10-11]。
本文將對DC的抗真菌免疫機制，抗真菌的靶向DC疫苗策略及其研究進展進行綜述。
1 DC的抗真菌免疫機制
過去100年，對哺乳動物免疫學的研究認識取得較大進展，但對抗真菌免疫機制的認識是在近幾年才有了重大的突破[12]。機體抵抗不同真菌的有效應答依賴于不同的免疫應答機制，而DC在這些機制中均表現出驚人的功能可塑性。
1.1 固有免疫：模式識別受體與DC
固有免疫和適應性免疫對抗真菌的感染主要依賴于吞噬細胞(主要為DC)對病原體的吞噬清除，而固有免疫是機體抵抗真菌感染的第一道防線[1]。DC對真菌病原體的清除首先依賴于形形色色的模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)對保守性真菌病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)的識別。PRR識別真菌病原體之后，可激活細胞內的信號傳導通路誘發DC的遷徙、成熟以及分泌細胞因子產生免疫應答。另外，PRR還可以調節DC對真菌的攝取，引導真菌進入DC內部合適的位置進行抗原加工和呈遞。PRR主要包括Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)家族，C型凝集素受體(C-type lectin receptors, CLR)家族和Nod樣受體(Nod-like receptor, NLR)[11]。
TLR識別PAMP涉及到細胞內信號轉導通路的激活，包括最終轉錄因子AP-1和核因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)的激活。大量的研究表明，真菌的識別主要依賴于內核酸敏感的TLR，包括TLR3、TLR7和TLR9[13]。所有TLR家族(TLR3例外)識別PAMP都是通過TLR介導的MyD88髓分化的初級應答。由于MyD88對Th1的啟動作用，現已普遍認為TLR對真菌的識別誘導了Th1的應答。與TLR類似，CLR也可識別大多數真菌PAMP(包括葡聚糖分子、甘露糖分子、海藻糖分子)并激活免疫受體酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activatory motif, ITAM)的胞內信號轉導通路以誘導DC的成熟和細胞因子的分泌[14]。比如，CLR中DC相關的Dectin-2家族能直接或間接地調整胞內信號傳導，識別各種各樣的內源或外源性的配體以識別真菌[15]。最近的動物和人體研究也表明，CLR的多態性或者基因突變與真菌的易感性具有重大的相關性[16]。對于NLR而言, NLRP3和NLRC4在抗真菌感染的免疫機制中發揮著重要作用，但具體這些炎癥小體是如何被真菌激活的卻不得而知[12]。
1.2 適應性免疫：Th17與適應性免疫
機體對真菌的適應性免疫應答可分為細胞免疫和體液免疫。體液免疫對機體抗真菌的作用在最近幾年才有了肯定[17-18]，但細胞免疫的抗真菌機制早已有所認識，它主要依賴于吞噬細胞的PRR對真菌病原體的識別以及細胞因子和趨化因子的分泌[1]。事實上，特定PRR對真菌的識別與特定類型的適應性免疫應答有著直接的聯系，比如Th1的適應性免疫應答與TLR4直接關聯, Th2的適應性免疫應答與TLR2直接關聯[19]。
最新研究表明，CLR與NLR對真菌的識別可以誘導Th17的免疫應答，這些機制的發現對于設計抗真菌的疫苗有著重大的意義[11-12]。值得注意的是，以IL-17分泌為主要特征的Th17免疫應答主要是負責黏膜上的抗真菌作用。雖然其中的機制還有待進一步闡述，但可能涉及局部中性粒細胞的聚集和抗菌肽的產生。IL-17是誘導粒細胞生成和中性粒細胞趨化的最主要的細胞因子，也可以通過提高粒細胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF)和CXC趨化因子在黏膜上皮細胞以及局部基質的表達而間接激活中性粒細胞[20]。最近人體試驗也表明，Th17免疫缺陷與黏膜和皮膚的真菌易感性有著直接的聯系，盡管動物實驗表明Th17應答中炎癥也可以誘導病理發展和機體易感性。
2 靶向DC的抗真菌策略
鑒于靶向DC抗真菌的疫苗策略在初期實驗中表現出了巨大潛力[21-23], 以及DC在抗真菌的免疫機制中的獨特地位和中心性作用[1, 3, 19]，基于DC的抗真菌疫苗極具開發前景。隨著抗原提呈技術的進步以及對DC生物特性的深入了解，靶向DC在體外的抗原有效裝載已經成為可能。
2.1 給藥途徑
DC廣泛存在于皮膚、肺和小腸，因而這些部位的DC靶向策略更具潛力。一項控制疫苗給藥路徑的開放性研究表明，對于18~60歲的受試者，與皮下注射相比，經皮內注射能誘發強度近兩倍的抗體應答[24]。另一非臨床試驗表明，疫苗經陰道給藥可以很快清除小鼠體內的假絲酵母菌，而且能有效地防止復發[25]。然而，針對上述部位的DC靶向策略治療也并非通用的抗真菌疫苗的給藥途徑。比如，皮炎芽生菌的減毒活疫苗在皮下給藥的時候能發揮完整的保護作用，而經鼻內給藥抵抗肺內致死感染卻沒有效果。
組織的微環境也會調節DC亞群的功能，從而影響有效的T細胞應答。脾內DC亞群可以在沒有IL-6的情況下誘發Th17分化，而來自皮膚和小腸的DC則必需IL-6誘發Th17的分化[26]。所以，在設計抗真菌疫苗給藥途徑的時候，應考慮注射途徑局部細胞因子的分泌和DC亞群特性等因素。
2.2 抗真菌DC疫苗的構建方法
構建抗真菌DC疫苗的經典方法是通過體外真菌RNA轉染DC來實現，可以誘發保護性T細胞反應，還可以加速保護性Th1分泌干擾素-γ的增多，但這種方法結果具有真菌特異性，并未觀察到跨菌種的交叉保護[11]。另外，此方法耗時、昂貴，在臨床推廣應用的可能性不大。
另一種直接而有效的抗真菌DC疫苗構建方法是將抗原共價連接于特異性DC的配體上。真菌病原體一般都含有甘露糖基化的蛋白，而甘露糖基化的蛋白則能有效地被DC通過CLR識別吞噬。Lam等[27]發現，模型抗原OVA(ovalbumin, OVA)的甘露糖基化可以大大增強其免疫原性，至少DC通過CLR家族CD206和CD209對其進行攝取的能力得到明顯加強。其他糖類分子同樣可以有效地將特異性抗原呈遞給靶向DC。相比于可溶性的OVA，OVA負載的β糖類顆粒能使靶向DC在體內誘導OVA特異性CD4+和CD8+T細胞增殖更具優勢[28]。
還有一種抗真菌DC疫苗構建是通過納米顆粒的使用而得以實現。納米顆粒與DC的靶向構建依賴于納米顆粒本身的亞微粒大小以及DC表面的受體或者能結合獨特受體的抗體結構。納米顆粒介導的靶向DC在最近的研究中體現出明顯的優越性。Tacken等[29]的研究表明，納米顆粒可以有效地構建靶向DC，納米顆粒與佐劑的共同遞送可誘發強烈的免疫應答且毒性較小。
2.3 可行性分析
真菌表面覆蓋有多聚糖、糖類分子以及糖復合抗原，是抗真菌疫苗構建的基礎。然而，真菌表面糖復合抗原的免疫原性尚不可預知，其半數糖類分子并不能被T細胞直接識別。隨著新技術的出現，真菌表面一部分能被T細胞直接識別的糖復合物表現出極強的免疫原性，使得抗真菌疫苗的設想成為可能[30]。另一方面，早前的研究已經表明，糖基化多肽的免疫反應可以誘發糖類特異性的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)應答，經適當處理過的糖復合物可以被加工和呈遞給CD8+T細胞[30]。由于DC的交叉呈遞，設計抗真菌DC疫苗以期產生真菌糖類特異性的CTL應答來達到抗真菌效果有望實現。
3 結語
本文論述了DC抗真菌疫苗策略及其可行性研究進展。隨著對抗真菌免疫機制的認識日益加深，以及基于DC的靶向疫苗技術日益成熟，新疫苗的構建顯示出免疫應答良好且毒性較小的優越性。DC作為固有免疫和適應性免疫的中心抗原提呈細胞，在抗真菌疫苗中的應用將指日可待。
引言
侵襲性真菌感染是臨床上非常棘手的問題，致死率可高達30%~50%[1]。然而，真菌在人類感染的所有病原體中研究最少[1]。盡管近二十年體內抗真菌藥物研究有了較大發展，但真菌病原體感染致死率依然不斷提升，主要是因為這類患者免疫力多數受到抑制，比如艾滋病患者、器官移植受體、腫瘤患者等。曲霉菌、白色念珠菌、新型隱球菌三大機會致病菌對免疫力缺陷或抑制的患者來說是致命的威脅[2-4]。研究表明[5]，發展抗真菌的疫苗將給免疫缺陷或抑制的患者帶來福音，免疫疫苗治療有望成為臨床上抗真菌感染的新策略。
樹突狀細胞(dendritic cell, DC)是抗原遞呈能力最強的抗原提呈細胞(antigen presenting cell, APC)[6]。DC疫苗抗腫瘤的臨床試驗在2010年4月29日得到美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration, FDA)的批準[7]。美國洛克菲勒大學教授Ralph M．Steinman因“發現樹突狀細胞及其在獲得性免疫中的作用”而獲得2011年的諾貝爾生理學或醫學獎[8]。機體抵抗和清除真菌依賴于固有免疫應答和獲得性免疫應答的調動和相互協調[9]，而DC就是在固有免疫應答和獲得性免疫應答中扮演中間人的角色，也是唯一的活化初始T細胞的抗原提呈細胞[10]。DC通過啟動和協調輔助性T淋巴細胞(T help, Th)、調節性T淋巴細胞(regulatory cell, Treg)及效應性T細胞的應答，以調動固有免疫和適應性免疫發揮抵抗清除真菌的作用[10-11]。
本文將對DC的抗真菌免疫機制，抗真菌的靶向DC疫苗策略及其研究進展進行綜述。
1 DC的抗真菌免疫機制
過去100年，對哺乳動物免疫學的研究認識取得較大進展，但對抗真菌免疫機制的認識是在近幾年才有了重大的突破[12]。機體抵抗不同真菌的有效應答依賴于不同的免疫應答機制，而DC在這些機制中均表現出驚人的功能可塑性。
1.1 固有免疫：模式識別受體與DC
固有免疫和適應性免疫對抗真菌的感染主要依賴于吞噬細胞(主要為DC)對病原體的吞噬清除，而固有免疫是機體抵抗真菌感染的第一道防線[1]。DC對真菌病原體的清除首先依賴于形形色色的模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)對保守性真菌病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)的識別。PRR識別真菌病原體之后，可激活細胞內的信號傳導通路誘發DC的遷徙、成熟以及分泌細胞因子產生免疫應答。另外，PRR還可以調節DC對真菌的攝取，引導真菌進入DC內部合適的位置進行抗原加工和呈遞。PRR主要包括Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)家族，C型凝集素受體(C-type lectin receptors, CLR)家族和Nod樣受體(Nod-like receptor, NLR)[11]。
TLR識別PAMP涉及到細胞內信號轉導通路的激活，包括最終轉錄因子AP-1和核因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)的激活。大量的研究表明，真菌的識別主要依賴于內核酸敏感的TLR，包括TLR3、TLR7和TLR9[13]。所有TLR家族(TLR3例外)識別PAMP都是通過TLR介導的MyD88髓分化的初級應答。由于MyD88對Th1的啟動作用，現已普遍認為TLR對真菌的識別誘導了Th1的應答。與TLR類似，CLR也可識別大多數真菌PAMP(包括葡聚糖分子、甘露糖分子、海藻糖分子)并激活免疫受體酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activatory motif, ITAM)的胞內信號轉導通路以誘導DC的成熟和細胞因子的分泌[14]。比如，CLR中DC相關的Dectin-2家族能直接或間接地調整胞內信號傳導，識別各種各樣的內源或外源性的配體以識別真菌[15]。最近的動物和人體研究也表明，CLR的多態性或者基因突變與真菌的易感性具有重大的相關性[16]。對于NLR而言, NLRP3和NLRC4在抗真菌感染的免疫機制中發揮著重要作用，但具體這些炎癥小體是如何被真菌激活的卻不得而知[12]。
1.2 適應性免疫：Th17與適應性免疫
機體對真菌的適應性免疫應答可分為細胞免疫和體液免疫。體液免疫對機體抗真菌的作用在最近幾年才有了肯定[17-18]，但細胞免疫的抗真菌機制早已有所認識，它主要依賴于吞噬細胞的PRR對真菌病原體的識別以及細胞因子和趨化因子的分泌[1]。事實上，特定PRR對真菌的識別與特定類型的適應性免疫應答有著直接的聯系，比如Th1的適應性免疫應答與TLR4直接關聯, Th2的適應性免疫應答與TLR2直接關聯[19]。
最新研究表明，CLR與NLR對真菌的識別可以誘導Th17的免疫應答，這些機制的發現對于設計抗真菌的疫苗有著重大的意義[11-12]。值得注意的是，以IL-17分泌為主要特征的Th17免疫應答主要是負責黏膜上的抗真菌作用。雖然其中的機制還有待進一步闡述，但可能涉及局部中性粒細胞的聚集和抗菌肽的產生。IL-17是誘導粒細胞生成和中性粒細胞趨化的最主要的細胞因子，也可以通過提高粒細胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF)和CXC趨化因子在黏膜上皮細胞以及局部基質的表達而間接激活中性粒細胞[20]。最近人體試驗也表明，Th17免疫缺陷與黏膜和皮膚的真菌易感性有著直接的聯系，盡管動物實驗表明Th17應答中炎癥也可以誘導病理發展和機體易感性。
2 靶向DC的抗真菌策略
鑒于靶向DC抗真菌的疫苗策略在初期實驗中表現出了巨大潛力[21-23], 以及DC在抗真菌的免疫機制中的獨特地位和中心性作用[1, 3, 19]，基于DC的抗真菌疫苗極具開發前景。隨著抗原提呈技術的進步以及對DC生物特性的深入了解，靶向DC在體外的抗原有效裝載已經成為可能。
2.1 給藥途徑
DC廣泛存在于皮膚、肺和小腸，因而這些部位的DC靶向策略更具潛力。一項控制疫苗給藥路徑的開放性研究表明，對于18~60歲的受試者，與皮下注射相比，經皮內注射能誘發強度近兩倍的抗體應答[24]。另一非臨床試驗表明，疫苗經陰道給藥可以很快清除小鼠體內的假絲酵母菌，而且能有效地防止復發[25]。然而，針對上述部位的DC靶向策略治療也并非通用的抗真菌疫苗的給藥途徑。比如，皮炎芽生菌的減毒活疫苗在皮下給藥的時候能發揮完整的保護作用，而經鼻內給藥抵抗肺內致死感染卻沒有效果。
組織的微環境也會調節DC亞群的功能，從而影響有效的T細胞應答。脾內DC亞群可以在沒有IL-6的情況下誘發Th17分化，而來自皮膚和小腸的DC則必需IL-6誘發Th17的分化[26]。所以，在設計抗真菌疫苗給藥途徑的時候，應考慮注射途徑局部細胞因子的分泌和DC亞群特性等因素。
2.2 抗真菌DC疫苗的構建方法
構建抗真菌DC疫苗的經典方法是通過體外真菌RNA轉染DC來實現，可以誘發保護性T細胞反應，還可以加速保護性Th1分泌干擾素-γ的增多，但這種方法結果具有真菌特異性，并未觀察到跨菌種的交叉保護[11]。另外，此方法耗時、昂貴，在臨床推廣應用的可能性不大。
另一種直接而有效的抗真菌DC疫苗構建方法是將抗原共價連接于特異性DC的配體上。真菌病原體一般都含有甘露糖基化的蛋白，而甘露糖基化的蛋白則能有效地被DC通過CLR識別吞噬。Lam等[27]發現，模型抗原OVA(ovalbumin, OVA)的甘露糖基化可以大大增強其免疫原性，至少DC通過CLR家族CD206和CD209對其進行攝取的能力得到明顯加強。其他糖類分子同樣可以有效地將特異性抗原呈遞給靶向DC。相比于可溶性的OVA，OVA負載的β糖類顆粒能使靶向DC在體內誘導OVA特異性CD4+和CD8+T細胞增殖更具優勢[28]。
還有一種抗真菌DC疫苗構建是通過納米顆粒的使用而得以實現。納米顆粒與DC的靶向構建依賴于納米顆粒本身的亞微粒大小以及DC表面的受體或者能結合獨特受體的抗體結構。納米顆粒介導的靶向DC在最近的研究中體現出明顯的優越性。Tacken等[29]的研究表明，納米顆粒可以有效地構建靶向DC，納米顆粒與佐劑的共同遞送可誘發強烈的免疫應答且毒性較小。
2.3 可行性分析
真菌表面覆蓋有多聚糖、糖類分子以及糖復合抗原，是抗真菌疫苗構建的基礎。然而，真菌表面糖復合抗原的免疫原性尚不可預知，其半數糖類分子并不能被T細胞直接識別。隨著新技術的出現，真菌表面一部分能被T細胞直接識別的糖復合物表現出極強的免疫原性，使得抗真菌疫苗的設想成為可能[30]。另一方面，早前的研究已經表明，糖基化多肽的免疫反應可以誘發糖類特異性的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)應答，經適當處理過的糖復合物可以被加工和呈遞給CD8+T細胞[30]。由于DC的交叉呈遞，設計抗真菌DC疫苗以期產生真菌糖類特異性的CTL應答來達到抗真菌效果有望實現。
3 結語
本文論述了DC抗真菌疫苗策略及其可行性研究進展。隨著對抗真菌免疫機制的認識日益加深，以及基于DC的靶向疫苗技術日益成熟，新疫苗的構建顯示出免疫應答良好且毒性較小的優越性。DC作為固有免疫和適應性免疫的中心抗原提呈細胞，在抗真菌疫苗中的應用將指日可待。