蛋白質在自組裝短肽水凝膠中的緩釋速度與蛋白質大小和凝膠孔徑直接相關, 如何提高小分子蛋白質的緩釋效果一直是個問題。本研究采用生物素夾心法研究胰島素樣生長因子1(IGF-1)在N端帶有RGD序列的自組裝短肽(P3)水凝膠中的釋放效果。紫外分光光度計檢測每個時間點所釋放的IGF-1濃度, 結果顯示IGF-1的釋放速度明顯降低。水凝膠培養實驗表明用生物素夾心法延長IGF-1釋放時間能夠有效地促進小鼠成軟骨細胞ATDC5的增殖。
引用本文： 劉燕飛, 范振海, 王鈺瑩, 余麗梅. 生物素夾心法對小分子蛋白質胰島素樣生長因子1在自組裝短肽水凝膠中的緩釋. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(2): 387-392. doi: 10.7507/1001-5515.20150070 復制
引言
自組裝短肽是一類能夠在特定的溶液環境下(pH、溫度、離子濃度等)，在疏水作用的推動下自發發生分子內折疊從而形成特定二級結構，并最終組裝成直徑10~20 nm納米纖維的短肽。這些短肽所形成的水凝膠含水量可以高達99%，具有低免疫原性、降解產物無毒、可原位注射、組織相容性好等優點，所以可以作為小分子藥物、細胞因子的緩釋支架而注射到組織損傷部位以促進組織修復和再生[1-2]。比如RADA16能夠緩釋溶菌酶、胰蛋白酶抑制劑和免疫球蛋白G等蛋白質[3]；MAX8短肽能夠緩釋溶菌酶、乳鐵蛋白、肌紅蛋白等蛋白質，且對負電蛋白質的緩釋作用尤其明顯[4]；我們前期也發現RADA16對胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1, IGF-1)、酸性成纖維細胞生長因子(acidic fibroblast growth factor, aFGF)以及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)有不同的緩釋作用，其緩釋效果和細胞因子的分子量以及凝膠網絡結構特性有關，對于小分子量蛋白質來說，短肽水凝膠的緩釋作用不明顯，比如24 h之后93%的IGF-1均已被釋放[5]。因此如何對蛋白質，尤其是小分子蛋白質進行有效緩釋還是個有待解決的問題[6]。
目前，為了提高材料對蛋白質的負載量，提高生物利用率，而將蛋白質鏈接在材料表面的方法大致有兩類，第一是采用共價連接然后通過水解或者酶切的方式進行釋放[7-8]，但這種方法往往具有包裹步驟復雜、需要后期處理、蛋白質易變性、緩釋系統不安全等缺點[9]；第二是通過諸如配體受體親和力或靜電作用等物理吸附作用將蛋白質吸附在材料表面[10-11]。這種方法較為溫和，可很大程度保證蛋白質的活性。其中最常見的就是生物素(biotin)-親和素(avidin)系統。生物素和親和素都是天然存在的蛋白質，一個親和素分子能夠和4個生物素分子特異性結合，生物素標記蛋白質可以通過其和親和素分子的高親和力而連接于材料表面，從而提高材料對蛋白質的包裹量或對蛋白質進行定位運輸等[12-13]，但是該系統在自組裝短肽水凝膠中的應用和研究工作還比較少。
近年來研究發現，自組裝短肽(KLDL)3能夠緩釋生物素標記的IGF-1和轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)，進而促進骨髓干細胞和軟骨細胞蛋白多糖的合成；Lee等[15]發現采用生物素三明治的方法在自組裝短肽RADA16上綁定的IGF-1能夠在大鼠心肌層持續釋放28 d，結合自組裝短肽優異的生物相容性，緩釋的IGF-1能夠促進注射的心肌組細胞激活和分化，進而促進大鼠心肌梗死區血管和心肌生成[16]。在我們的前期工作中，我們也發現了所設計的N端生物素標記自組裝短肽(P3)對FITC標記的親和素具有很好的親和力[17]。因此在本研究中，我們采用生物素夾心法研究P3短肽對IGF-1的緩釋作用，并以小鼠成軟骨細胞ATDC5為模型研究IGF-1緩釋的效果。
1 材料與方法
1.1 實驗材料與試劑
P3和對照自組裝短肽P8訂購于上海吉爾生化公司(純度＞95%)；生物素標記的IGF-1購自Eagle Biosciences公司，以下簡稱為b-IGF-1；未標記的IGF-1購自Invitrogen公司；IGF-1抗體、親和素和DNA定量試劑盒購自Sigma公司；ATDC5細胞培養使用DMEM/F12培養基和5%胎牛血清。
1.2 實驗方法
1.2.1 短肽母液配制
稱取適量短肽干粉，用超純水溶解，使其濃度為1% (10 mg/mL)，超聲處理30 min，即為母液。母液于4℃保存。對于所有生物素標記的短肽實驗，在超聲處理前，P3和P8短肽按照1：99的分子比例進行混合，此混合短肽命名為實驗短肽(1%P3+99%P8)。
1.2.2 纖維納米結構觀察
將含有1%的P3短肽母液稀釋到0.02%，室溫靜置1 h，取2μL于新鮮剝離的云母片上，放置5~10 s后馬上用500μL超純水沖洗，氮氣吹干后使用原子力動態模式測量(SPI4000 Probe Stataion & SPA-400 SPM Unit)。對于親和素結合的樣品，實驗短肽稀釋到0.01%，室溫靜置2 h后加入親和素孵育10 min。
纖維的真實尺度用如下公式進行校正：
(W為真實寬度，Wobs為測量寬度，Rt為針尖曲率半徑，H為纖維高度)
1.2.3 IGF-1對水凝膠結合力分析
將b-IGF-1和親和素1：1混合，然后加入到實驗短肽水凝膠中室溫孵育1 h，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS, pH7.2)小心沖洗水凝膠以洗掉未結合的親和素。然后超聲打碎凝膠，將樣品稀釋后變性，用IGF-1抗體(0.1μg/mL)檢測綁定在凝膠納米纖維上的b-IGF-1。對照組設為b-IGF-1+P8水凝膠組和IGF-1+實驗短肽水凝膠組。
1.2.4 IGF-1在水凝膠中的緩釋
分別配制50μL濃度為1.0％的實驗短肽溶液和P8短肽溶液，與含有IGF-1和b-IGF-1的PBS等體積混合，生物素終濃度為40μmol/L。其他步驟按照文獻的記載進行[3, 5]。最后按照文獻的方法利用標準曲線換算成蛋白質的濃度[18]。用累計釋放的蛋白質占蛋白總量的比例對時間作圖。每一個數據點由3次實驗平均而得。
1.2.5 ATDC5細胞在水凝膠中的生長情況
在接種細胞至水凝膠之前，細胞用10%蔗糖溶液重懸至5×105個/mL，快速和含40 ng/mL b-IGF-1及親和素的短肽母液等體積混合；添加細胞培養基，于培養箱內放置30 min直至凝膠形成，然后更換培養基以平衡pH；此后每隔1~2 d更換培養基。然后在特定時間點用槍頭打碎水凝膠以收集細胞，使用DNA熒光定量試劑盒繪制DNA標準曲線，檢測水凝膠培養中不同天數的細胞數量，具體方法參照試劑盒說明書。熒光分光光度計激發波長360 nm，發射波長460 nm。培養實驗重復3次。
1.2.6 結果分析
蛋白質印跡光密度分析使用Bio-rad公司Quanlity One軟件；統計學分析使用Origin Pro 8.0系統進行分析，組間比較實用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 短肽納米結構以及親和素對生物素標記的納米纖維親和力分析
圖 1的原子力顯微鏡掃描結果顯示，實驗短肽能夠在離子的作用下自組裝形成高1.2~1.4 nm，寬15~20 nm的纖維結構[見圖 1(b)(c)]，N端生物素標記不影響短肽的自組裝行為和納米纖維的微觀結構，這和我們之前的研究結果一致[17]。在實驗短肽溶液中添加親和素，親和素能夠選擇性地綁定在實驗短肽納米纖維上。有趣的是，如圖 1(b)右圖箭頭所示，在兩條纖維的交叉處經常發現一個親和素分子的存在，其高度2.9~3.4 nm，而兩條纖維的重疊高度為2.4~2.8 nm。由于親和素的四倍體結構，所以我們猜測可能是一個親和素分子可以同時結合兩個生物素分子，從而把兩條納米纖維鏈接起來，形成更加復雜的網絡結構。
圖1
生物素標記短肽(P3)和非生物素標記短肽(P8短肽)的化學結構及納米結構
(a)P3和P8短肽的化學結構。(b)短肽納米結構(左)以及親和素(右)在短肽纖維上的結合的原子力顯微鏡圖像。其中P3含量為1%。箭頭標識可能同時連接兩條纖維的親和素分子。(c)纖維尺度分析。Z代表劃線處Z軸高度
Figure1. Chemical structures and nanostructures of biotinylated designer peptides (P3) and nonbiotinylated peptide (P8)(a) chemical structures of P3 and P8 peptide. (b) AFM images o1f the self-assembling peptide nanofibers alone (left) or avidin coupled to the self-assembling peptide nanofibers (right). Biotinylated and nonbiotinylated peptides were mixed in an 1:99 ratio. Arrow show spherical avidin molecules may connect the two nanofibers. (c) scale analysis of the nanofibers marked by the blue line. The coordinates Z represent the Z axis heights above the mica surface at the marked positions
2.2 b-IGF-1對混合納米纖維的結合
在本研究中使用生物素夾心法將b-IGF-1綁定在納米纖維上，具體過程如圖 2(a)所示。其中，b-IGF-1和親和素的分子比例為1：1，這樣可以使得親和素分子總是具有游離的結合位點而能夠和納米纖維上的生物素結合。為了進一步檢測生物素夾心法的有效性，我們將b-IGF-1和親和素分別同實驗短肽水凝膠和P8短肽水凝膠共同室溫孵育1 h，洗去未結合的IGF-1后，用IGF-1抗體檢測水凝膠中b-IGF-1的含量。圖 2(b)結果顯示，實驗短肽水凝膠中的b-IGF-1的含量是對照組P8短肽水凝膠中b-IGF-1的6.5±0.6倍，是IGF-1+實驗短肽組中IGF-1含量的4.2±0.8倍。結果表明生物素夾心法能夠有效地將IGF-1綁定在短肽納米纖維表面。
圖2
IGF-1對生物素標記短肽纖維的綁定
(a)生物素三明治法將b-IGF-1綁定在P3短肽纖維上的示意圖；(b)蛋白質印跡顯示b-IGF-1對P3納米纖維的結合力
Figure2. Tethering of IGF-1 to the biotinylated self-assembling peptides(a) model of the biotin sandwich method of tethering biotinylated IGF-1 (b-IGF-1) to biotinylated self-assembling peptides by using avidin; (b) Western blot analysis demonstrates that the biotinylated IGF-1 couples only to the biotinylated P3 nanofibers and not the nonbiotinylated control peptides
2.3 IGF-1在水凝膠中的釋放情況
如圖 3所示，在對照組P8短肽水凝膠內，b-IGF-1的短期釋放速度十分迅速，在4 h之內，有70.2%的b-IGF-1已經被釋放。隨著時間的推移，b-IGF-1的釋放速度逐漸減慢，并在12 h左右開始進入平臺期，24 h之后其釋放總量達到了94.4%；同時，未標記的的IGF-1在實驗短肽水凝膠中的釋放曲線與之十分類似，不同的是，IGF-1的短期釋放速度(＜12 h)要比b-IGF-1快一些，這可能是生物素標記導致釋放分子分子量略微增大造成的結果。相比之下，b-IGF-1在實驗短肽水凝膠內的釋放速度則要緩慢許多，24 h后只有50.7%的b-IGF-1被釋放，60 h后的釋放總量也只有57.8%。這些結果表明生物素夾心法可以有效地減慢小分子蛋白質在自組裝短肽水凝膠中的釋放速度。
圖3
室溫下IGF-1或b-IGF-1在自組裝短肽水凝膠中的釋放曲線
Figure3.
Release profiles for IGF-1 or biotinylated IGF-1 through the self-assembling peptide hydrogel in PBS at room temperature
2.4 緩釋的IGF-1對ATDC5細胞增殖的影響
生物素夾心法結合的IGF-1緩釋效果對細胞的影響如圖 4(a)所示，ATDC5細胞在短肽水凝膠中生長狀況良好，增殖迅速，在4 d之后細胞即開始形成團簇。每個團簇有8~12個細胞。熒光DNA定量方法顯示，在第2天，實驗短肽水凝膠和P8短肽水凝膠中的細胞數量大致相當，但在第4 d，實驗短肽水凝膠中的細胞增殖明顯，第6 d實驗短肽水凝膠中的細胞數量要高出對照組30%(P＜0.05)。因此，生物素夾心法緩釋IGF-1對ATDC5細胞增殖具有更強的促進作用，結果提示該方法能夠使IGF-1具有更長的釋放時間，能夠更加有效地發揮其生物活性。
圖4
在三維水凝膠培養中IGF-1緩釋對ATDC5細胞增的影響
(a)ATDC5細胞在實驗短肽水凝膠中的形貌；(b)ATDC5細胞在實驗短肽水凝膠和對照組P8短肽水凝膠中的增殖情況。b-IGF-1濃度都是20 ng/mL
Figure4. Effect of tethered IGF-1 on proliferation of ATDC5 cells(a) optical micrographs of ATDC5 cells embedded in IGF-1 tethering hydrogel after 4 days in culture; (b) changes in concentration of ATDC5 cells with IGF-1 coupled to avidin in biotinylated peptide nanofibers compared with IGF-1 coupled to avidin with P8 peptide during the course of the experiment
3 討論
近年來，伴隨著新型材料和相關技術的發展，藥物緩釋已經越來越受到研究人員的重視，尤其是對于蛋白質類藥物或細胞因子，急需一個能夠有效提高蛋白質藥代動力學和效果的釋放系統[9]。如今，在組織工程領域中，蛋白質和組織工程材料的聯合應用能夠更好地模擬自然組織細胞外微環境，促進細胞之間的聯系。因此，現代組織工程學的目標是聯合細胞、組織工程材料和信號分子共同達到缺損組織的再生或者重建[19]。
自組裝短肽水凝膠材料由于其可降解、免疫原性低且具有優秀的組織相容性，能夠原位注射到損傷部位以及提供真正的三維空間等優點而成為新一代組織工程材料而備受青睞[20-21]。當自組裝短肽水凝膠的孔徑大于蛋白質分子直徑的時候，蛋白質在水凝膠中的釋放速度主要取決于蛋白質的分子大小和水凝膠的含水量。總體來說，大分子蛋白質的緩釋效果要好于小分子蛋白質，比如在0.5%的RADA水凝膠中，VEGF和IGF-1的24 h釋放量分別為55%和93%[5]，因此小分子蛋白質在水凝膠中難以維持長效釋放。在本實驗中，對照組P8短肽水凝膠對b-IGF-1并沒有特異的親和力，所以只能達到短期的緩釋效果，36 h的b-IGF-1釋放總量為96.3%。而在實驗短肽水凝膠中，b-IGF-1通過生物素和親和素之間的特異親和力而綁定在納米纖維的表面，其36 h釋放總量只有52.9%，并可持續釋放。結果表明生物素-親和素系統可以用于蛋白質的緩釋，并且能夠大幅度減慢小分子蛋白質在水凝膠中的釋放速度。
此外，實驗中所使用的緩釋系統是我們設計的新型自組裝短肽，同經典的RADA相比，短肽N端所攜帶的RGD活性序列或可更好地促進細胞的黏附和增殖。ATDC5細胞能夠在短肽水凝膠中自由遷徙，生長狀況良好，尤其是在能夠緩釋IGF-1的混合水凝膠中，ATDC5細胞增殖迅速，在第4 d即可形成明顯的團簇，在第6 d細胞數量要高出對照組30%(P＜0.05)，這證明IGF-1在水凝膠中的的緩釋能夠更好地發揮出IGF-1的生物學活性。值得注意的是，在我們的短肽水凝膠系統中，ATDC5細胞形態在培養過程中始終呈卵圓形或者橢圓形，類似于標準瓊脂糖凝膠和其他三維自組裝系統中的細胞形態，和普通的二維培養系統中的三角形或多角形明顯不同。
本研究結果證明生物素夾心法可以作為一種同時緩釋一種或多種蛋白質的新方法，可以大大延長小分子蛋白質的釋放時間。將該方法結合自組裝短肽水凝膠系統有可能設計出更加接近損傷部位微環境的緩釋系統，并通過對多種蛋白質藥物或細胞因子的可控性釋放從而達到促進內源性再生反應的效果。但是這個系統統還處于實驗室研究階段，還有許多問題亟待解決。對該系統的深入研究與開發是未來納米科學研究和組織工程研究的重要方向。
引言
自組裝短肽是一類能夠在特定的溶液環境下(pH、溫度、離子濃度等)，在疏水作用的推動下自發發生分子內折疊從而形成特定二級結構，并最終組裝成直徑10~20 nm納米纖維的短肽。這些短肽所形成的水凝膠含水量可以高達99%，具有低免疫原性、降解產物無毒、可原位注射、組織相容性好等優點，所以可以作為小分子藥物、細胞因子的緩釋支架而注射到組織損傷部位以促進組織修復和再生[1-2]。比如RADA16能夠緩釋溶菌酶、胰蛋白酶抑制劑和免疫球蛋白G等蛋白質[3]；MAX8短肽能夠緩釋溶菌酶、乳鐵蛋白、肌紅蛋白等蛋白質，且對負電蛋白質的緩釋作用尤其明顯[4]；我們前期也發現RADA16對胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1, IGF-1)、酸性成纖維細胞生長因子(acidic fibroblast growth factor, aFGF)以及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)有不同的緩釋作用，其緩釋效果和細胞因子的分子量以及凝膠網絡結構特性有關，對于小分子量蛋白質來說，短肽水凝膠的緩釋作用不明顯，比如24 h之后93%的IGF-1均已被釋放[5]。因此如何對蛋白質，尤其是小分子蛋白質進行有效緩釋還是個有待解決的問題[6]。
目前，為了提高材料對蛋白質的負載量，提高生物利用率，而將蛋白質鏈接在材料表面的方法大致有兩類，第一是采用共價連接然后通過水解或者酶切的方式進行釋放[7-8]，但這種方法往往具有包裹步驟復雜、需要后期處理、蛋白質易變性、緩釋系統不安全等缺點[9]；第二是通過諸如配體受體親和力或靜電作用等物理吸附作用將蛋白質吸附在材料表面[10-11]。這種方法較為溫和，可很大程度保證蛋白質的活性。其中最常見的就是生物素(biotin)-親和素(avidin)系統。生物素和親和素都是天然存在的蛋白質，一個親和素分子能夠和4個生物素分子特異性結合，生物素標記蛋白質可以通過其和親和素分子的高親和力而連接于材料表面，從而提高材料對蛋白質的包裹量或對蛋白質進行定位運輸等[12-13]，但是該系統在自組裝短肽水凝膠中的應用和研究工作還比較少。
近年來研究發現，自組裝短肽(KLDL)3能夠緩釋生物素標記的IGF-1和轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)，進而促進骨髓干細胞和軟骨細胞蛋白多糖的合成；Lee等[15]發現采用生物素三明治的方法在自組裝短肽RADA16上綁定的IGF-1能夠在大鼠心肌層持續釋放28 d，結合自組裝短肽優異的生物相容性，緩釋的IGF-1能夠促進注射的心肌組細胞激活和分化，進而促進大鼠心肌梗死區血管和心肌生成[16]。在我們的前期工作中，我們也發現了所設計的N端生物素標記自組裝短肽(P3)對FITC標記的親和素具有很好的親和力[17]。因此在本研究中，我們采用生物素夾心法研究P3短肽對IGF-1的緩釋作用，并以小鼠成軟骨細胞ATDC5為模型研究IGF-1緩釋的效果。
1 材料與方法
1.1 實驗材料與試劑
P3和對照自組裝短肽P8訂購于上海吉爾生化公司(純度＞95%)；生物素標記的IGF-1購自Eagle Biosciences公司，以下簡稱為b-IGF-1；未標記的IGF-1購自Invitrogen公司；IGF-1抗體、親和素和DNA定量試劑盒購自Sigma公司；ATDC5細胞培養使用DMEM/F12培養基和5%胎牛血清。
1.2 實驗方法
1.2.1 短肽母液配制
稱取適量短肽干粉，用超純水溶解，使其濃度為1% (10 mg/mL)，超聲處理30 min，即為母液。母液于4℃保存。對于所有生物素標記的短肽實驗，在超聲處理前，P3和P8短肽按照1：99的分子比例進行混合，此混合短肽命名為實驗短肽(1%P3+99%P8)。
1.2.2 纖維納米結構觀察
將含有1%的P3短肽母液稀釋到0.02%，室溫靜置1 h，取2μL于新鮮剝離的云母片上，放置5~10 s后馬上用500μL超純水沖洗，氮氣吹干后使用原子力動態模式測量(SPI4000 Probe Stataion & SPA-400 SPM Unit)。對于親和素結合的樣品，實驗短肽稀釋到0.01%，室溫靜置2 h后加入親和素孵育10 min。
纖維的真實尺度用如下公式進行校正：
(W為真實寬度，Wobs為測量寬度，Rt為針尖曲率半徑，H為纖維高度)
1.2.3 IGF-1對水凝膠結合力分析
將b-IGF-1和親和素1：1混合，然后加入到實驗短肽水凝膠中室溫孵育1 h，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS, pH7.2)小心沖洗水凝膠以洗掉未結合的親和素。然后超聲打碎凝膠，將樣品稀釋后變性，用IGF-1抗體(0.1μg/mL)檢測綁定在凝膠納米纖維上的b-IGF-1。對照組設為b-IGF-1+P8水凝膠組和IGF-1+實驗短肽水凝膠組。
1.2.4 IGF-1在水凝膠中的緩釋
分別配制50μL濃度為1.0％的實驗短肽溶液和P8短肽溶液，與含有IGF-1和b-IGF-1的PBS等體積混合，生物素終濃度為40μmol/L。其他步驟按照文獻的記載進行[3, 5]。最后按照文獻的方法利用標準曲線換算成蛋白質的濃度[18]。用累計釋放的蛋白質占蛋白總量的比例對時間作圖。每一個數據點由3次實驗平均而得。
1.2.5 ATDC5細胞在水凝膠中的生長情況
在接種細胞至水凝膠之前，細胞用10%蔗糖溶液重懸至5×105個/mL，快速和含40 ng/mL b-IGF-1及親和素的短肽母液等體積混合；添加細胞培養基，于培養箱內放置30 min直至凝膠形成，然后更換培養基以平衡pH；此后每隔1~2 d更換培養基。然后在特定時間點用槍頭打碎水凝膠以收集細胞，使用DNA熒光定量試劑盒繪制DNA標準曲線，檢測水凝膠培養中不同天數的細胞數量，具體方法參照試劑盒說明書。熒光分光光度計激發波長360 nm，發射波長460 nm。培養實驗重復3次。
1.2.6 結果分析
蛋白質印跡光密度分析使用Bio-rad公司Quanlity One軟件；統計學分析使用Origin Pro 8.0系統進行分析，組間比較實用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 短肽納米結構以及親和素對生物素標記的納米纖維親和力分析
圖 1的原子力顯微鏡掃描結果顯示，實驗短肽能夠在離子的作用下自組裝形成高1.2~1.4 nm，寬15~20 nm的纖維結構[見圖 1(b)(c)]，N端生物素標記不影響短肽的自組裝行為和納米纖維的微觀結構，這和我們之前的研究結果一致[17]。在實驗短肽溶液中添加親和素，親和素能夠選擇性地綁定在實驗短肽納米纖維上。有趣的是，如圖 1(b)右圖箭頭所示，在兩條纖維的交叉處經常發現一個親和素分子的存在，其高度2.9~3.4 nm，而兩條纖維的重疊高度為2.4~2.8 nm。由于親和素的四倍體結構，所以我們猜測可能是一個親和素分子可以同時結合兩個生物素分子，從而把兩條納米纖維鏈接起來，形成更加復雜的網絡結構。
圖1
生物素標記短肽(P3)和非生物素標記短肽(P8短肽)的化學結構及納米結構
(a)P3和P8短肽的化學結構。(b)短肽納米結構(左)以及親和素(右)在短肽纖維上的結合的原子力顯微鏡圖像。其中P3含量為1%。箭頭標識可能同時連接兩條纖維的親和素分子。(c)纖維尺度分析。Z代表劃線處Z軸高度
Figure1. Chemical structures and nanostructures of biotinylated designer peptides (P3) and nonbiotinylated peptide (P8)(a) chemical structures of P3 and P8 peptide. (b) AFM images o1f the self-assembling peptide nanofibers alone (left) or avidin coupled to the self-assembling peptide nanofibers (right). Biotinylated and nonbiotinylated peptides were mixed in an 1:99 ratio. Arrow show spherical avidin molecules may connect the two nanofibers. (c) scale analysis of the nanofibers marked by the blue line. The coordinates Z represent the Z axis heights above the mica surface at the marked positions
2.2 b-IGF-1對混合納米纖維的結合
在本研究中使用生物素夾心法將b-IGF-1綁定在納米纖維上，具體過程如圖 2(a)所示。其中，b-IGF-1和親和素的分子比例為1：1，這樣可以使得親和素分子總是具有游離的結合位點而能夠和納米纖維上的生物素結合。為了進一步檢測生物素夾心法的有效性，我們將b-IGF-1和親和素分別同實驗短肽水凝膠和P8短肽水凝膠共同室溫孵育1 h，洗去未結合的IGF-1后，用IGF-1抗體檢測水凝膠中b-IGF-1的含量。圖 2(b)結果顯示，實驗短肽水凝膠中的b-IGF-1的含量是對照組P8短肽水凝膠中b-IGF-1的6.5±0.6倍，是IGF-1+實驗短肽組中IGF-1含量的4.2±0.8倍。結果表明生物素夾心法能夠有效地將IGF-1綁定在短肽納米纖維表面。
圖2
IGF-1對生物素標記短肽纖維的綁定
(a)生物素三明治法將b-IGF-1綁定在P3短肽纖維上的示意圖；(b)蛋白質印跡顯示b-IGF-1對P3納米纖維的結合力
Figure2. Tethering of IGF-1 to the biotinylated self-assembling peptides(a) model of the biotin sandwich method of tethering biotinylated IGF-1 (b-IGF-1) to biotinylated self-assembling peptides by using avidin; (b) Western blot analysis demonstrates that the biotinylated IGF-1 couples only to the biotinylated P3 nanofibers and not the nonbiotinylated control peptides
2.3 IGF-1在水凝膠中的釋放情況
如圖 3所示，在對照組P8短肽水凝膠內，b-IGF-1的短期釋放速度十分迅速，在4 h之內，有70.2%的b-IGF-1已經被釋放。隨著時間的推移，b-IGF-1的釋放速度逐漸減慢，并在12 h左右開始進入平臺期，24 h之后其釋放總量達到了94.4%；同時，未標記的的IGF-1在實驗短肽水凝膠中的釋放曲線與之十分類似，不同的是，IGF-1的短期釋放速度(＜12 h)要比b-IGF-1快一些，這可能是生物素標記導致釋放分子分子量略微增大造成的結果。相比之下，b-IGF-1在實驗短肽水凝膠內的釋放速度則要緩慢許多，24 h后只有50.7%的b-IGF-1被釋放，60 h后的釋放總量也只有57.8%。這些結果表明生物素夾心法可以有效地減慢小分子蛋白質在自組裝短肽水凝膠中的釋放速度。
圖3
室溫下IGF-1或b-IGF-1在自組裝短肽水凝膠中的釋放曲線
Figure3.
Release profiles for IGF-1 or biotinylated IGF-1 through the self-assembling peptide hydrogel in PBS at room temperature
2.4 緩釋的IGF-1對ATDC5細胞增殖的影響
生物素夾心法結合的IGF-1緩釋效果對細胞的影響如圖 4(a)所示，ATDC5細胞在短肽水凝膠中生長狀況良好，增殖迅速，在4 d之后細胞即開始形成團簇。每個團簇有8~12個細胞。熒光DNA定量方法顯示，在第2天，實驗短肽水凝膠和P8短肽水凝膠中的細胞數量大致相當，但在第4 d，實驗短肽水凝膠中的細胞增殖明顯，第6 d實驗短肽水凝膠中的細胞數量要高出對照組30%(P＜0.05)。因此，生物素夾心法緩釋IGF-1對ATDC5細胞增殖具有更強的促進作用，結果提示該方法能夠使IGF-1具有更長的釋放時間，能夠更加有效地發揮其生物活性。
圖4
在三維水凝膠培養中IGF-1緩釋對ATDC5細胞增的影響
(a)ATDC5細胞在實驗短肽水凝膠中的形貌；(b)ATDC5細胞在實驗短肽水凝膠和對照組P8短肽水凝膠中的增殖情況。b-IGF-1濃度都是20 ng/mL
Figure4. Effect of tethered IGF-1 on proliferation of ATDC5 cells(a) optical micrographs of ATDC5 cells embedded in IGF-1 tethering hydrogel after 4 days in culture; (b) changes in concentration of ATDC5 cells with IGF-1 coupled to avidin in biotinylated peptide nanofibers compared with IGF-1 coupled to avidin with P8 peptide during the course of the experiment
3 討論
近年來，伴隨著新型材料和相關技術的發展，藥物緩釋已經越來越受到研究人員的重視，尤其是對于蛋白質類藥物或細胞因子，急需一個能夠有效提高蛋白質藥代動力學和效果的釋放系統[9]。如今，在組織工程領域中，蛋白質和組織工程材料的聯合應用能夠更好地模擬自然組織細胞外微環境，促進細胞之間的聯系。因此，現代組織工程學的目標是聯合細胞、組織工程材料和信號分子共同達到缺損組織的再生或者重建[19]。
自組裝短肽水凝膠材料由于其可降解、免疫原性低且具有優秀的組織相容性，能夠原位注射到損傷部位以及提供真正的三維空間等優點而成為新一代組織工程材料而備受青睞[20-21]。當自組裝短肽水凝膠的孔徑大于蛋白質分子直徑的時候，蛋白質在水凝膠中的釋放速度主要取決于蛋白質的分子大小和水凝膠的含水量。總體來說，大分子蛋白質的緩釋效果要好于小分子蛋白質，比如在0.5%的RADA水凝膠中，VEGF和IGF-1的24 h釋放量分別為55%和93%[5]，因此小分子蛋白質在水凝膠中難以維持長效釋放。在本實驗中，對照組P8短肽水凝膠對b-IGF-1并沒有特異的親和力，所以只能達到短期的緩釋效果，36 h的b-IGF-1釋放總量為96.3%。而在實驗短肽水凝膠中，b-IGF-1通過生物素和親和素之間的特異親和力而綁定在納米纖維的表面，其36 h釋放總量只有52.9%，并可持續釋放。結果表明生物素-親和素系統可以用于蛋白質的緩釋，并且能夠大幅度減慢小分子蛋白質在水凝膠中的釋放速度。
此外，實驗中所使用的緩釋系統是我們設計的新型自組裝短肽，同經典的RADA相比，短肽N端所攜帶的RGD活性序列或可更好地促進細胞的黏附和增殖。ATDC5細胞能夠在短肽水凝膠中自由遷徙，生長狀況良好，尤其是在能夠緩釋IGF-1的混合水凝膠中，ATDC5細胞增殖迅速，在第4 d即可形成明顯的團簇，在第6 d細胞數量要高出對照組30%(P＜0.05)，這證明IGF-1在水凝膠中的的緩釋能夠更好地發揮出IGF-1的生物學活性。值得注意的是，在我們的短肽水凝膠系統中，ATDC5細胞形態在培養過程中始終呈卵圓形或者橢圓形，類似于標準瓊脂糖凝膠和其他三維自組裝系統中的細胞形態，和普通的二維培養系統中的三角形或多角形明顯不同。
本研究結果證明生物素夾心法可以作為一種同時緩釋一種或多種蛋白質的新方法，可以大大延長小分子蛋白質的釋放時間。將該方法結合自組裝短肽水凝膠系統有可能設計出更加接近損傷部位微環境的緩釋系統，并通過對多種蛋白質藥物或細胞因子的可控性釋放從而達到促進內源性再生反應的效果。但是這個系統統還處于實驗室研究階段，還有許多問題亟待解決。對該系統的深入研究與開發是未來納米科學研究和組織工程研究的重要方向。
