本研究構建含人肝細胞生長因子受體(C-Met)胞外區基因的慢病毒表達載體, 并將其轉染293T細胞, 真核表達并純化獲得人C-Met胞外段蛋白。采用RT-PCR擴增人C-Met胞外區(ED)基因, 構建慢病毒表達載體p RRL-CMV-ED, 磷酸鈣法轉染293T細胞, RT-PCR及Western blot法檢測ED基因在293T細胞中mRNA的轉錄和蛋白表達。PCR擴增及測序結果表明成功構建了p RRL-CMV-ED慢病毒表達載體, PCR擴增的目的基因大小為2 700 bp左右; 轉染p RRL-CMV-ED的293T細胞上清經鎳柱親和純化, SDS-PAGE分析純化產物在105 kD處有明顯蛋白條帶; Western及ELISA結果顯示, 純化蛋白為C-Met胞外區蛋白且能與肝細胞生長因子(HGF)特異性結合。本研究結果可能為制備C-Met單克隆抗體以及篩選阻斷HGF/C-Met信號通路的中和抗體奠定基礎。
引用本文： 郭佳, 尹衍新, 蔣明, 于麗華, 蔣韻, 李貴情, 房健民. 人C-Met胞外區慢病毒穿梭載體構建及在293T細胞中的表達. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(2): 400-404. doi: 10.7507/1001-5515.20150072 復制
引言
C-Met是肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)已知的唯一受體，也是一類具有自身磷酸化活性的跨膜受體，在多種惡性腫瘤的發生發展中具有重要作用[1-2]。臨床研究發現，C-Met的過量表達可見于在我國發病率較高的肺癌、肝癌、大腸癌、乳腺癌中，并與腫瘤惡性化程度、轉移及預后呈正相關[3-6]。C-Met主要包括三個功能不同的結構域：胞外區(extracellular domain, ED)、跨膜區和胞內區。胞外區作為配體識別部位，識別并結合HGF，對后續發生的一系列生物調節效應具有重要作用[7]。胞內區具有酪氨酸激酶活性，可激活多種信號分子，引起廣泛細胞應答，包括細胞增殖、分化和血管生成等。HGF與其受體C-Met胞外區結合使其構象發生改變，磷酸化激活胞內多條信號轉導途徑，促進腫瘤細胞的增殖、遷徙和血管生成，最終導致惡性腫瘤的侵襲和轉移[8]。一旦腫瘤細胞中異常活化的HGF/C-Met信號通路被阻斷，腫瘤細胞就會出現細胞增殖減緩、成瘤性降低、侵襲能力下降等一系列變化[9]。阻斷HGF/C-Met信號通路的酪氨酸激酶抑制劑cabozantinib已于2012年獲美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批準用于晚期甲狀腺髓樣癌的治療。目前，還沒有FDA批準的抗C-Met的中和抗體藥物。本研究通過構建與HGF特異性結合的C-Met胞外區基因的慢病毒表達載體，并將其轉染293T細胞，真核表達獲得人C-Met胞外區蛋白，以期為制備C-Met單克隆抗體以及篩選阻斷HGF/C-Met信號通路的中和抗體奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
293T細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所。慢病毒表達載體p RRL-CMV及其包裝質粒、大腸桿菌DH5α及質粒pCR-Blunt-C-Met(含有人C-Met全長基因)為本實驗室保存。克隆載體pCR-Blunt及TRIzol試劑購自Invitrogen公司。細胞培養基DMEM及胎牛血清購自Hyclone公司。各種限制性核酸內切酶、高保真DNA聚合酶購自NEB公司。DNA凝膠回收試劑盒和小量質粒抽提試劑盒購自Axygen公司。T4 DNA連接酶、內毒素純化中抽試劑盒購自Promega公司。商品化的重組人C-Met蛋白、重組人HGF蛋白、山羊抗人C-Met多克隆抗體購自R&D公司。HRP標記的兔抗山羊IgG抗體購自Bethyl公司。TMB顯色液購自北京天根生物科技有限公司。NC膜、ECL化學發光試劑購自美國Pierce公司。PCR引物合成及產物測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。
1.2 人C-Met胞外區基因克隆及鑒定
根據GenBank中人C-Met的基因序列(序列號：NM_001127500.1)設計PCR引物，并引入所需酶切位點。人C-Met的ED區基因兩端分別引入AgeⅠ和SalⅠ酶切位點，上游引物P1(5＇-3＇)：TAT-
1.3 人C-Met胞外區慢病毒表達載體p RRL-CMV-ED的構建
測序正確的pCR-Blunt-ED質粒用AgeⅠ和SalⅠ雙酶切，同時用AgeⅠ和SalⅠ酶切慢病毒表達載體p RRL-CMV。經膠回收試劑盒純化后，將酶切所得的目的片段和慢病毒表達載體連接，連接產物轉化大腸桿菌感受態DH5α，篩選陽性克隆，通過酶切及DNA序列測定獲得慢病毒表達質粒p RRL-CMV-ED，用去除內毒素的質粒提取試劑盒純化備用。
1.4 人C-Met胞外區蛋白在293T細胞中的表達
1.4.1 轉染細胞的熒光顯微鏡觀察
接種處于對數生長期的293T細胞，待細胞生長至50%~60%融合時，利用磷酸鈣法將慢病毒表達載體p RRL-CMV-ED和含有綠色熒光蛋白的空載體(p RRL-CMV-GFP)共轉染293T細胞，以p RRL-CMV-GFP轉染293T細胞為陽性對照，以未轉染的293T細胞作為空白對照。通過熒光顯微鏡觀察轉染48 h后的293T細胞綠色熒光蛋白的表達。
1.4.2 轉染細胞中人C-Met胞外區基因mRNA轉錄水平的檢測
收集轉染慢病毒表達載體p RRL-CMV-ED后的293T細胞，TRIzol法提取總RNA，經Eppendorf BioPhotometer plus核酸蛋白測定儀定量后，逆轉錄合成cDNA。以cDNA為模板，以P1和P2為上下游引物進行PCR擴增，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠成像分析系統觀察結果并拍照。檢測人C-Met胞外區基因在轉錄水平的表達情況。
1.5 ED-His融合蛋白的純化
收集293T細胞培養液，10 000 r/min離心20 min取上清，經0.45μm的濾膜過濾。將濾過的培養液與PBS緩沖液等體積混合，通過Ni-NTA agarose純化柱來純化ED-His融合蛋白，操作方法按說明書進行。將收集的洗脫液進行10%的SDS-PAGE電泳分析。BCA試劑盒測定蛋白濃度，－80℃保存備用。
1.6 ED-His融合蛋白的Western blot分析
SDS-PAGE電泳后將膠上蛋白通過電轉儀轉移至硝酸纖維素膜上，以山羊抗人C-Met多克隆抗體為一抗(1：1 000倍稀釋)，HRP標記的兔抗山羊IgG抗體為二抗(1：5 000倍稀釋)。將ECL化學發光底物作用于硝酸纖維素膜上，對X線片進行曝光、顯影和定影處理，檢測分析Western blot結果。
1.7 ELISA檢測ED-His融合蛋白與HGF結合活性
用CBS將重組人HGF蛋白稀釋至10 ng/mL，4℃過夜包被。PBST洗滌3次后，用1% BSA 37℃封閉2 h。將ED-His融合蛋白加入酶標板中與HGF混勻，37℃作用2 h，同時以PBS作為陰性對照，R & D公司商品化的重組人C-Met蛋白作為陽性對照，PBST洗滌3次。以山羊抗人C-Met多克隆抗體作為一抗，37℃作用1 h，PBST洗滌3次。HRP標記兔抗山羊IgG抗體作為二抗進行檢測，37℃作用1 h。PBST洗滌后每孔加入100μL TMB顯色液，37℃避光顯色10 min，終止反應后酶標儀測定A450數值。檢測ED-His融合蛋白是否具有與人HGF特異結合的能力。
2 結果
2.1 人C-Met胞外區基因擴增與克隆
以C-Met胞外段引物P1和P2擴增出約2 700 bp的特異性條帶，大小與預期相符(圖 1)。PCR產物回收后，連接到克隆載體PCR-Blunt形成克隆質粒PCR-Blunt-ED，AgeⅠ和SalⅠ雙酶切得到約2 700 bp的條帶，初步證明擴增的C-Met的ED區已經連接到克隆載體中，將其中3個陽性克隆送出測序，測序鑒定為人C-Met胞外段序列。
圖1
人體C-Met的ED區基因擴增
泳道1：DNA marker; 泳道2：C-Met的胞外區
Figure1. PCR amplification results of the extracellular domain of C-MetLane 1: DNA marker; Lane 2: the extracellular domain of C-Met
2.2 慢病毒表達載體p RRL-CMV-ED構建和鑒定
將測序鑒定正確的PCR-Blunt-ED質粒以及空的p RRL-CMV質粒分別雙酶切后連接，篩選陽性克隆經AgeⅠ和SalⅠ雙酶切產物可見7 500 bp的載體片段和2 700 bp的目的基因片段，大小與預期相符，見圖 2。結果表明人C-Met的ED區的慢病毒表達質粒p RRL-CMV-ED構建成功。測序結果經NCBI的BLAST分析顯示，慢病毒表達質粒p RRL-CMV-ED的序列與GenBank中登錄的人類C-Met胞外區基因序列同源性達100%。
圖2
慢病毒穿梭載體p RRL-CMV-ED酶切鑒定
泳道1：DNA marker; 泳道2：p RRL-CMV-ED雙酶切
Figure2. Restriction endonuclease analysis of the recombinant plasmid p RRL-CMV-EDLane 1: DNA marker; Lane2: p RRL-CMV-ED
2.3 轉染細胞的熒光顯微鏡觀察
通過磷酸鈣法轉染293T細胞48 h后熒光顯微鏡下可觀察，p RRL-CMV-ED和p RRL-CMV-GFP共轉染的293T細胞及陽性對照組細胞均有GFP表達，未轉染質粒的陰性對照組細胞則無熒光表達(圖 3)，證明慢病毒表達載體轉染成功。
圖3
慢病毒質粒轉染293T細胞
Figure3.
Lentiviral plasmid transfected into 293T cells
2.4 RT-PCR檢測慢病毒轉染細胞中目的基因mRNA的表達
轉染72 h的293T細胞的RT-PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，在約2 700 bp處可見目的條帶(圖 4)。測序發現，目的條帶為人C-Met的ED區基因序列。結果表明，慢病毒表達載體p RRL-CMV-ED成功轉染293T細胞，并在細胞中表達。
圖4
轉染細胞ED基因RT-PCR產物電泳圖
泳道1：DNA marker; 泳道2：轉染后293T細胞ED基因擴增
Figure4. RT-PCR analysis of ED gene expression from transfectd 293T cellLane 1: DNA marker; Lane 2: ED expression from transfected 293T cell
2.5 ED-His融合蛋白的純化及Western blot分析
通過Ni-NTA agarose純化柱來純化ED-His融合蛋白進行SDS-PAGE電泳分析。由圖 5可見蛋白純化效果較好，無其他明顯雜帶，分子量大小約為105 kD，與預測分子量大小相符合。將純化后蛋白進一步通過Western blot檢測，結果證實了純化的蛋白為人C-Met的胞外區蛋白(圖 6)。
圖5
SDS-PAGE鑒定純化的ED-His融合蛋白
M:蛋白marker; 泳道1-2：ED-His融合蛋白
Figure5. Analysis of purified ED protein by SDS-PAGEM:protein molecular weight marker; Lane 1-2: Purified protein of ED-His
圖6
ED-His融合蛋白的western blot鑒定
泳道1-2: ED-His融合蛋白
Figure6. Western blot analysis of ED-His proteinLane 1-2: expressed protein of ED of C-Met
2.6 ELISA檢測ED-His融合蛋白與HGF結合
ELISA檢測結果如圖 7所示，ED-His融合蛋白可以與HGF結合，且隨著融合蛋白量的增多，與HGF結合率增大。100μg ED-His融合蛋白與HGF的結合能力達到R & D公司商品化的重組人C-Met蛋白水平。
圖7
ELISA檢測ED-His融合蛋白與HGF結合活性
Figure7.
Analysis of ED-His recombinant protein bingding activity with HGF using ELISA
3 討論
肝細胞生長因子受體C-Met是由原癌基因C-Met編碼產生的一種酪氨酸激酶受體，是一類具有自身磷酸化活性的跨膜受體，包括三個結構域：胞外區、跨膜結區和胞內區。胞外區還包含一個信號素軸向蛋白樣的SEMA(semaphorin axon-guidance protein)結構域、一個富含Cys的PSI(plexins, semaphorins and integrins)區域以及一個由4個免疫球蛋白樣結構組成的IPT(immunoglobin-plexin-transcription)結構域。胞內區則包含一個近膜區、一個酪氨酸激酶區和一個C-末端序列[10]。ED區作為配體識別部位與HGF特異性結合，激活胞內結構域的酪氨酸激酶區和自動磷酸化位點，引發受體自身酪氨酸磷酸化，將外界信號傳至細胞核內，形成一種包括膜外結合位點、跨膜蛋白、膜內激酶區域完整的細胞膜受體。
研究發現HGF/C-Met信號通路在多種惡性腫瘤的進展中發揮重要作用，可促進腫瘤細胞的增殖、遷徙和血管生成，最終導致惡性腫瘤的侵襲和轉移[11]。HGF/C-Met已成為極有前景的抗腫瘤轉移治療新靶點。目前，已經報道的針對HGF/C-Met信號通路的抑制劑，主要是抗體類和小分子化合物(酪氨酸激酶抑制劑)[12]。大部分小分子抑制劑對HGF/C-Met信號通路的抑制作用顯著，但由于特異性較差、副作用較大、耐藥性等問題限制了其在臨床上的應用[13-14]。
抗體類抑制劑即中和性抗體因其特異性強、副作用小等特點，在多種腫瘤治療中發揮重要作用。中和性抗體不僅能與相應抗原受體特異性結合，還能有效中和配體對受體的作用，具有發展成為治療性抗體藥物的潛力。目前，還沒有FDA批準的抗C-Met的中和抗體藥物。因此，篩選抑制HGF與C-Met結合進而抑制腫瘤生長的中和性抗體具有重要意義。
本研究利用基因工程技術表達了C-Met的ED區重組蛋白，該區域是C-Met與其配體HGF結合的區域，在其信號傳導過程中發揮非常重要的作用。同時，C-Met作為細胞表面受體，該區域也是中和抗體的識別表位。經分析，構建的C-Met的胞外區慢病毒表達載體，可在293T細胞中高效表達, 且慢病毒載體能有效整合入宿主染色體組，介導目的基因穩定、長期地在293T細胞中表達，為本研究的后續實驗奠定基礎。重組蛋白經Western blot及ELISA驗證后證明，可以特異性地與HGF結合。以上結果表明人C-Met胞外段基因慢病毒表達系統構建成功，并真核表達獲得人C-Met胞外區蛋白，為制備C-Met單克隆抗體以及篩選阻斷HGF/C-Met信號通路的中和性抗體奠定基礎。
引言
C-Met是肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)已知的唯一受體，也是一類具有自身磷酸化活性的跨膜受體，在多種惡性腫瘤的發生發展中具有重要作用[1-2]。臨床研究發現，C-Met的過量表達可見于在我國發病率較高的肺癌、肝癌、大腸癌、乳腺癌中，并與腫瘤惡性化程度、轉移及預后呈正相關[3-6]。C-Met主要包括三個功能不同的結構域：胞外區(extracellular domain, ED)、跨膜區和胞內區。胞外區作為配體識別部位，識別并結合HGF，對后續發生的一系列生物調節效應具有重要作用[7]。胞內區具有酪氨酸激酶活性，可激活多種信號分子，引起廣泛細胞應答，包括細胞增殖、分化和血管生成等。HGF與其受體C-Met胞外區結合使其構象發生改變，磷酸化激活胞內多條信號轉導途徑，促進腫瘤細胞的增殖、遷徙和血管生成，最終導致惡性腫瘤的侵襲和轉移[8]。一旦腫瘤細胞中異常活化的HGF/C-Met信號通路被阻斷，腫瘤細胞就會出現細胞增殖減緩、成瘤性降低、侵襲能力下降等一系列變化[9]。阻斷HGF/C-Met信號通路的酪氨酸激酶抑制劑cabozantinib已于2012年獲美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批準用于晚期甲狀腺髓樣癌的治療。目前，還沒有FDA批準的抗C-Met的中和抗體藥物。本研究通過構建與HGF特異性結合的C-Met胞外區基因的慢病毒表達載體，并將其轉染293T細胞，真核表達獲得人C-Met胞外區蛋白，以期為制備C-Met單克隆抗體以及篩選阻斷HGF/C-Met信號通路的中和抗體奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
293T細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所。慢病毒表達載體p RRL-CMV及其包裝質粒、大腸桿菌DH5α及質粒pCR-Blunt-C-Met(含有人C-Met全長基因)為本實驗室保存。克隆載體pCR-Blunt及TRIzol試劑購自Invitrogen公司。細胞培養基DMEM及胎牛血清購自Hyclone公司。各種限制性核酸內切酶、高保真DNA聚合酶購自NEB公司。DNA凝膠回收試劑盒和小量質粒抽提試劑盒購自Axygen公司。T4 DNA連接酶、內毒素純化中抽試劑盒購自Promega公司。商品化的重組人C-Met蛋白、重組人HGF蛋白、山羊抗人C-Met多克隆抗體購自R&D公司。HRP標記的兔抗山羊IgG抗體購自Bethyl公司。TMB顯色液購自北京天根生物科技有限公司。NC膜、ECL化學發光試劑購自美國Pierce公司。PCR引物合成及產物測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。
1.2 人C-Met胞外區基因克隆及鑒定
根據GenBank中人C-Met的基因序列(序列號：NM_001127500.1)設計PCR引物，并引入所需酶切位點。人C-Met的ED區基因兩端分別引入AgeⅠ和SalⅠ酶切位點，上游引物P1(5＇-3＇)：TAT-
1.3 人C-Met胞外區慢病毒表達載體p RRL-CMV-ED的構建
測序正確的pCR-Blunt-ED質粒用AgeⅠ和SalⅠ雙酶切，同時用AgeⅠ和SalⅠ酶切慢病毒表達載體p RRL-CMV。經膠回收試劑盒純化后，將酶切所得的目的片段和慢病毒表達載體連接，連接產物轉化大腸桿菌感受態DH5α，篩選陽性克隆，通過酶切及DNA序列測定獲得慢病毒表達質粒p RRL-CMV-ED，用去除內毒素的質粒提取試劑盒純化備用。
1.4 人C-Met胞外區蛋白在293T細胞中的表達
1.4.1 轉染細胞的熒光顯微鏡觀察
接種處于對數生長期的293T細胞，待細胞生長至50%~60%融合時，利用磷酸鈣法將慢病毒表達載體p RRL-CMV-ED和含有綠色熒光蛋白的空載體(p RRL-CMV-GFP)共轉染293T細胞，以p RRL-CMV-GFP轉染293T細胞為陽性對照，以未轉染的293T細胞作為空白對照。通過熒光顯微鏡觀察轉染48 h后的293T細胞綠色熒光蛋白的表達。
1.4.2 轉染細胞中人C-Met胞外區基因mRNA轉錄水平的檢測
收集轉染慢病毒表達載體p RRL-CMV-ED后的293T細胞，TRIzol法提取總RNA，經Eppendorf BioPhotometer plus核酸蛋白測定儀定量后，逆轉錄合成cDNA。以cDNA為模板，以P1和P2為上下游引物進行PCR擴增，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠成像分析系統觀察結果并拍照。檢測人C-Met胞外區基因在轉錄水平的表達情況。
1.5 ED-His融合蛋白的純化
收集293T細胞培養液，10 000 r/min離心20 min取上清，經0.45μm的濾膜過濾。將濾過的培養液與PBS緩沖液等體積混合，通過Ni-NTA agarose純化柱來純化ED-His融合蛋白，操作方法按說明書進行。將收集的洗脫液進行10%的SDS-PAGE電泳分析。BCA試劑盒測定蛋白濃度，－80℃保存備用。
1.6 ED-His融合蛋白的Western blot分析
SDS-PAGE電泳后將膠上蛋白通過電轉儀轉移至硝酸纖維素膜上，以山羊抗人C-Met多克隆抗體為一抗(1：1 000倍稀釋)，HRP標記的兔抗山羊IgG抗體為二抗(1：5 000倍稀釋)。將ECL化學發光底物作用于硝酸纖維素膜上，對X線片進行曝光、顯影和定影處理，檢測分析Western blot結果。
1.7 ELISA檢測ED-His融合蛋白與HGF結合活性
用CBS將重組人HGF蛋白稀釋至10 ng/mL，4℃過夜包被。PBST洗滌3次后，用1% BSA 37℃封閉2 h。將ED-His融合蛋白加入酶標板中與HGF混勻，37℃作用2 h，同時以PBS作為陰性對照，R & D公司商品化的重組人C-Met蛋白作為陽性對照，PBST洗滌3次。以山羊抗人C-Met多克隆抗體作為一抗，37℃作用1 h，PBST洗滌3次。HRP標記兔抗山羊IgG抗體作為二抗進行檢測，37℃作用1 h。PBST洗滌后每孔加入100μL TMB顯色液，37℃避光顯色10 min，終止反應后酶標儀測定A450數值。檢測ED-His融合蛋白是否具有與人HGF特異結合的能力。
2 結果
2.1 人C-Met胞外區基因擴增與克隆
以C-Met胞外段引物P1和P2擴增出約2 700 bp的特異性條帶，大小與預期相符(圖 1)。PCR產物回收后，連接到克隆載體PCR-Blunt形成克隆質粒PCR-Blunt-ED，AgeⅠ和SalⅠ雙酶切得到約2 700 bp的條帶，初步證明擴增的C-Met的ED區已經連接到克隆載體中，將其中3個陽性克隆送出測序，測序鑒定為人C-Met胞外段序列。
圖1
人體C-Met的ED區基因擴增
泳道1：DNA marker; 泳道2：C-Met的胞外區
Figure1. PCR amplification results of the extracellular domain of C-MetLane 1: DNA marker; Lane 2: the extracellular domain of C-Met
2.2 慢病毒表達載體p RRL-CMV-ED構建和鑒定
將測序鑒定正確的PCR-Blunt-ED質粒以及空的p RRL-CMV質粒分別雙酶切后連接，篩選陽性克隆經AgeⅠ和SalⅠ雙酶切產物可見7 500 bp的載體片段和2 700 bp的目的基因片段，大小與預期相符，見圖 2。結果表明人C-Met的ED區的慢病毒表達質粒p RRL-CMV-ED構建成功。測序結果經NCBI的BLAST分析顯示，慢病毒表達質粒p RRL-CMV-ED的序列與GenBank中登錄的人類C-Met胞外區基因序列同源性達100%。
圖2
慢病毒穿梭載體p RRL-CMV-ED酶切鑒定
泳道1：DNA marker; 泳道2：p RRL-CMV-ED雙酶切
Figure2. Restriction endonuclease analysis of the recombinant plasmid p RRL-CMV-EDLane 1: DNA marker; Lane2: p RRL-CMV-ED
2.3 轉染細胞的熒光顯微鏡觀察
通過磷酸鈣法轉染293T細胞48 h后熒光顯微鏡下可觀察，p RRL-CMV-ED和p RRL-CMV-GFP共轉染的293T細胞及陽性對照組細胞均有GFP表達，未轉染質粒的陰性對照組細胞則無熒光表達(圖 3)，證明慢病毒表達載體轉染成功。
圖3
慢病毒質粒轉染293T細胞
Figure3.
Lentiviral plasmid transfected into 293T cells
2.4 RT-PCR檢測慢病毒轉染細胞中目的基因mRNA的表達
轉染72 h的293T細胞的RT-PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，在約2 700 bp處可見目的條帶(圖 4)。測序發現，目的條帶為人C-Met的ED區基因序列。結果表明，慢病毒表達載體p RRL-CMV-ED成功轉染293T細胞，并在細胞中表達。
圖4
轉染細胞ED基因RT-PCR產物電泳圖
泳道1：DNA marker; 泳道2：轉染后293T細胞ED基因擴增
Figure4. RT-PCR analysis of ED gene expression from transfectd 293T cellLane 1: DNA marker; Lane 2: ED expression from transfected 293T cell
2.5 ED-His融合蛋白的純化及Western blot分析
通過Ni-NTA agarose純化柱來純化ED-His融合蛋白進行SDS-PAGE電泳分析。由圖 5可見蛋白純化效果較好，無其他明顯雜帶，分子量大小約為105 kD，與預測分子量大小相符合。將純化后蛋白進一步通過Western blot檢測，結果證實了純化的蛋白為人C-Met的胞外區蛋白(圖 6)。
圖5
SDS-PAGE鑒定純化的ED-His融合蛋白
M:蛋白marker; 泳道1-2：ED-His融合蛋白
Figure5. Analysis of purified ED protein by SDS-PAGEM:protein molecular weight marker; Lane 1-2: Purified protein of ED-His
圖6
ED-His融合蛋白的western blot鑒定
泳道1-2: ED-His融合蛋白
Figure6. Western blot analysis of ED-His proteinLane 1-2: expressed protein of ED of C-Met
2.6 ELISA檢測ED-His融合蛋白與HGF結合
ELISA檢測結果如圖 7所示，ED-His融合蛋白可以與HGF結合，且隨著融合蛋白量的增多，與HGF結合率增大。100μg ED-His融合蛋白與HGF的結合能力達到R & D公司商品化的重組人C-Met蛋白水平。
圖7
ELISA檢測ED-His融合蛋白與HGF結合活性
Figure7.
Analysis of ED-His recombinant protein bingding activity with HGF using ELISA
3 討論
肝細胞生長因子受體C-Met是由原癌基因C-Met編碼產生的一種酪氨酸激酶受體，是一類具有自身磷酸化活性的跨膜受體，包括三個結構域：胞外區、跨膜結區和胞內區。胞外區還包含一個信號素軸向蛋白樣的SEMA(semaphorin axon-guidance protein)結構域、一個富含Cys的PSI(plexins, semaphorins and integrins)區域以及一個由4個免疫球蛋白樣結構組成的IPT(immunoglobin-plexin-transcription)結構域。胞內區則包含一個近膜區、一個酪氨酸激酶區和一個C-末端序列[10]。ED區作為配體識別部位與HGF特異性結合，激活胞內結構域的酪氨酸激酶區和自動磷酸化位點，引發受體自身酪氨酸磷酸化，將外界信號傳至細胞核內，形成一種包括膜外結合位點、跨膜蛋白、膜內激酶區域完整的細胞膜受體。
研究發現HGF/C-Met信號通路在多種惡性腫瘤的進展中發揮重要作用，可促進腫瘤細胞的增殖、遷徙和血管生成，最終導致惡性腫瘤的侵襲和轉移[11]。HGF/C-Met已成為極有前景的抗腫瘤轉移治療新靶點。目前，已經報道的針對HGF/C-Met信號通路的抑制劑，主要是抗體類和小分子化合物(酪氨酸激酶抑制劑)[12]。大部分小分子抑制劑對HGF/C-Met信號通路的抑制作用顯著，但由于特異性較差、副作用較大、耐藥性等問題限制了其在臨床上的應用[13-14]。
抗體類抑制劑即中和性抗體因其特異性強、副作用小等特點，在多種腫瘤治療中發揮重要作用。中和性抗體不僅能與相應抗原受體特異性結合，還能有效中和配體對受體的作用，具有發展成為治療性抗體藥物的潛力。目前，還沒有FDA批準的抗C-Met的中和抗體藥物。因此，篩選抑制HGF與C-Met結合進而抑制腫瘤生長的中和性抗體具有重要意義。
本研究利用基因工程技術表達了C-Met的ED區重組蛋白，該區域是C-Met與其配體HGF結合的區域，在其信號傳導過程中發揮非常重要的作用。同時，C-Met作為細胞表面受體，該區域也是中和抗體的識別表位。經分析，構建的C-Met的胞外區慢病毒表達載體，可在293T細胞中高效表達, 且慢病毒載體能有效整合入宿主染色體組，介導目的基因穩定、長期地在293T細胞中表達，為本研究的后續實驗奠定基礎。重組蛋白經Western blot及ELISA驗證后證明，可以特異性地與HGF結合。以上結果表明人C-Met胞外段基因慢病毒表達系統構建成功，并真核表達獲得人C-Met胞外區蛋白，為制備C-Met單克隆抗體以及篩選阻斷HGF/C-Met信號通路的中和性抗體奠定基礎。
