新型無鎳ZrCuFeAlAg非晶態合金的體外細胞毒性_《生物醫學工程學雜志》

作者：

龐慧芳 ^1,2 , 許琮 ¹ , 覃華 ¹ , 李德民 ¹ , 黎培員 ¹ , 王波 ¹ , 張淑娟 ¹ ,  趙秋 ¹

1. 華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院肝病研究所, 武漢 430030;
2. 包頭醫學院第二附屬醫院消化病研究所, 包頭 014030;

關鍵詞：

Zr-基非晶態合金細胞毒性生物相容性 MG-63細胞

DOI：

10.7507/1001-5515.20150069

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摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

通過檢測一種新型無鎳Zr-基非晶態合金Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃的體外細胞毒性, 并與常用生物醫用合金Ti6Al4V的細胞毒性進行比較, 以評價該材料的生物相容性。按照ISO 10993-5:1999及GB/T 16886.5-1997標準, 將Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃、純Zr及Ti6Al4V材料按試件表面積與培養液體積比為1 cm²/mL和0.5 cm²/mL分別提取浸提液, 再用Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑分別檢測以浸提液培養的人骨肉瘤MG-63細胞1、3、5 d后的光密度(OD)值并計算細胞相對增殖率(RGR)以評價其細胞毒性。將人骨肉瘤MG-63細胞培養于合金樣本表面3 d后固定并分別采用激光共聚焦顯微鏡(LSCM)及掃描電鏡(SEM)觀察各組材料表面細胞生長形態。間接細胞毒性試驗CCK-8結果提示, Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃組及純Zr組與Ti6Al4V組相同, 其1、3、5 d的細胞相對增殖率均大于85%, 經細胞毒性分級均為0或1級, 符合國家醫用材料合格標準; 直接細胞毒性試驗LSCM觀察人骨肉瘤MG-63細胞在各組材料樣本表面生長形態相似, 并且各組與陰性對照組細胞數量之間無明顯差別; SEM觀察到人骨肉瘤MG-63細胞于各組材料表面貼壁生長及細胞形態均良好, 基本符合醫用材料標準, 表明該材料具有良好的細胞生物相容性。因此, 我們初步認為它可成為潛在的生物醫用替代材料, 尤其用于骨科植入材料。

引用本文： 龐慧芳, 許琮, 覃華, 李德民, 黎培員, 王波, 張淑娟, 趙秋. 新型無鎳ZrCuFeAlAg非晶態合金的體外細胞毒性. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(2): 380-386. doi: 10.7507/1001-5515.20150069 復制

引言

每一種新型生物醫學材料進入臨床前期研究都必須經過生物相容性和安全性的評價，細胞毒性試驗是最常用的評價手段之一^[1]，具有方法簡便、快速、準確、客觀及重復性好的特點。具備良好的物理、化學特性及生物相容性的合金材料是目前國內外生物醫學材料領域研究的熱點之一。鈦及鈦合金由于其良好的生物相容性和耐腐蝕性能，已作為生物醫學材料廣泛應用于人體內^[2-6]。Ti6AI4V是1954年由美國研制成功的第一代生物材料鈦合金^[7]，由于其強度、韌性、耐熱性、可塑性、抗腐蝕性和生物相容性均良好，在鈦合金工業領域中成為王牌合金，其使用量占全部鈦合金的75%～85%。但目前認為，純鈦及鈦合金在臨床實際應用中強度、耐磨性及加工性能并不十分理想，而且在長期應用過程中會釋放對人體有潛在毒性的V元素^{[2-5, 8-9]}。因此研制出低彈性模量、耐腐蝕性強和生物相容性良好的材料是我們亟待解決的問題。

許多非晶態合金(bulk metallic glass, BMGs)材料具備與人體致密骨相似的彈性模量，能與人體骨具有良好的力學相容性，因此在降低應力遮擋效應方面優于傳統的骨科植入材料^[10-11]。近年來，Zr-基非晶態合金材料以其良好的機械及電化學性能和可塑性強等優點，已在生物醫學應用領域作為潛在的骨科植入材料引起了廣泛關注和研究^[10-18]。

本研究按照國際標準化組織(ISO)及國家技術標準(GB)規定的要求和標準，以目前廣泛應用于臨床的Ti6Al4V鈦合金作為參照材料^[18-19]，對一種新型無鎳Zr-基非晶態合金Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃的細胞毒性及相容性進行研究并初步探討，為其應用于臨床提供良好的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料制備及浸提液的提取

1.1.1 材料名稱及來源

Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃、純Zr、Ti6Al4V等三種合金材料均由華中科技大學材料學院提供。

1.1.2 材料制備

利用精密切割機切取尺寸為Φ6 mm×1 mm的圓形試件，將三種試件表面進行打磨拋光后，先用大量蒸餾水沖洗數次，再依次用丙酮、95%無水乙醇超聲清洗各15 min，蒸餾水充分沖洗之后，將樣本試件移入無菌培養皿中烘干，于121℃高壓蒸汽滅菌60 min備用。

1.1.3 浸提液的提取

按照ISO 10993-5:1999標準^[20]，將高壓滅菌的三組樣本試件在超凈臺內，置入無菌6孔培養板中，用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的MEM培養基為浸提介質，按浸提試件表面積與培養液體積比分別配成1 cm²/mL及0.5 cm²/mL。將培養板置于37℃、5％CO₂的飽和濕度條件下孵育72 h，使樣品金屬離子盡可能析出后，再用0.22μm微孔濾膜過濾滅菌，含有金屬離子的培養液即為浸提液。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞常規培養與分組

將人成骨肉瘤MG-63細胞(購于武漢大學動物資源保藏中心)于含有10%胎牛血清(Hyclone公司)、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素雙抗(武漢鼎國公司)的MEM培養基(Hyclone公司)中，置于37℃、5% CO₂以及飽和濕度條件下進行培養。細胞生長貼壁約90%融合度時，可進行常規傳代培養。

A組：Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃非晶態合金組；B組：純Zr；C組：Ti6Al4V組；D組：對照組，即不含合金樣本組。

1.2.2 間接細胞毒性實驗

CCK-8法收集對數生長期的人骨肉瘤MG-63細胞，加入含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的新鮮MEM培養液制成單細胞懸液，以每孔5×10³個細胞按200μL接種于96孔板中，于37℃、5％CO₂以及飽和濕度條件下進行培養。待培養24 h細胞貼壁后將原培養基吸棄，再以每孔加入100μL浸提液或培養液進行定量，繼續培養1、3、5 d。實驗終止，每孔加入10μL CCK-8(碧云天公司)搖勻5～10 min，于37℃、5％CO₂及飽和濕度條件下避光孵育2 h后終止培養。采用酶標儀(Bio-RAD680)在波長450 nm處測量光密度(optical density，OD)值，每組OD值以均值±標準差(x±s)表示，計算其細胞相對增殖率(relative growth rate，RGR)(%)=(OD_實驗-OD_空白)/(OD_對照-OD_空白)×100%。根據國家技術標準GB/T16886.5-1997^[21]，將RGR以6級毒性評分標準轉換成毒性級別，RGR≥100%為0級，75%~99%為1級，50%~74%為2級，25%~49%為3級，l%~24%為4級，0為5級；認為材料毒性級別為0或1級為合格，2級為應結合細胞形態綜合評價，3～5級為不合格。

1.2.3 直接細胞毒性實驗

激光共聚焦顯微鏡(Laser scanning confocal microscopy, LSCM)觀察細胞形態變化：收集對數生長期的人骨肉瘤MG-63細胞，用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，將圓形蓋玻片置入12孔板中，以每孔1×10⁴個細胞接種于含有合金樣本(實驗組)及空白(對照組)培養板中，每孔體積1 mL，于37℃、5％CO₂及飽和濕度條件下進行培養。培養3 d后以PBS緩沖液洗滌5 min×3次，以4%多聚甲醛溶液于37℃固定20～30 min，再用PBS洗滌樣品10 min×3次，使用0.1% tritonX-100(武漢鼎國公司)于37℃破膜滲透化處理10 min。再用PBS沖洗5 min×3次，以5% BSA液(武漢鼎國公司)于37℃封閉20～30 min，各孔加入150μL Hochest 33258工作液(武漢谷歌公司)室溫避光孵育10 min后，用PBS避光洗滌5 min×3次，再以含5% BSA和0.1% tritonX-100的PBS稀釋FITC-phalloidin染色工作液(按1：200比例)(美國Sigma公司)，并各孔加入300～400μL，室溫避光孵育30 min。再用PBS沖洗5 min×3次后，取出干凈的載玻片滴加4～6μL抗熒光淬滅劑(武漢谷歌公司)將樣本固定的同時蓋上蓋玻片，直接用LSCM(UltraVIEW VoX, PerkinElmer)觀察在樣本表面生長的細胞形態。

掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)觀察樣本表面細胞形態變化:收集對數生長期的人骨肉瘤MG-63細胞，用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，以每孔1×10⁴個細胞接種于含有合金樣本及空白的12孔培養板中，每孔體積1 mL，置于37℃、5％CO₂及飽和濕度條件下進行培養。培養3 d之后，先用PBS緩沖液在搖床上漂洗5 min×3次，再以4%多聚甲醛溶液室溫固定60 min，用PBS洗滌10 min×3次，然后使用梯度酒精(50%、60%、70%、80%、90%、100%)脫水各10 min，在六甲基二硅胺烷((Hexamethyldisilazane, HMDS)溶液中干燥并噴鍍金膜之后，將表面黏附細胞的樣品置于SEM下進行觀察。

1.3 統計學分析

實驗數據均以x±s表示，采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，多重均數比較采用單因素方差分析(one-way ANVOA)，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 直接細胞毒性試驗

CCK-8檢測結果顯示，浸提面積為1 cm²/mL的實驗組和對照組經浸提液培養1、3、5 d后的OD值、RGR及毒性級別如表 1所示。各組的細胞培養1、3、5 d的細胞相對增殖率均大于85%，其毒性級別均為1級；此外，浸提面積為0.5 cm²/mL的實驗組和對照組經浸提液培養1、3、5 d后的OD值、RGR及毒性級別如表 1所示。純Zr組和Ti6Al4V組細胞培養1、3 d的RGR均大于100%，其毒性級別均為0級，而Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃組的RGR均大于90%，其毒性級別為1級。以上3組經培養3 d后的細胞相對增殖率均大于95%，其毒性級別均為1級。因此，由表 1可知，Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃組與Ti6Al4V組相同，其細胞毒性試驗均為合格。

表1 各組OD值、RGR及細胞毒性評定 Table1. OD value, RGR, and cytotoxicity of MG-63 cells cultured in different groups

表選項

下載CSV

時間/d	組別	OD值			毒性級別
1	A	1.290±0.02	1.230±0.03	94.24	97.97	1	1
	B	1.329±0.03	1.315±0.05	97.63	106.33	1	0
	C	1.299±0.02	1.304±0.04	95.06	105.30	1	0
	D	1.356±0.03	1.251±0.04	100.00	100.00	0	0
3	A	1.188±0.05	1.320±0.06	86.80	94.20	1	1
	B	1.298±0.02	1.430±0.03	96.70	103.75	1	0
	C	1.313±0.04	1.425±0.02	97.91	103.29	1	0
	D	1.337±0.04	1.389±0.05	100.00	100.00	0	0
5	A	1.334±0.02	1.527±0.03	88.64	97.40	1	1
	B	1.450±0.03	1.560±0.05	97.70	99.83	1	1
	C	1.466±0.06	1.532±0.06	98.96	97.90	1	1
	D	1.432±0.07	1.564±0.06	100.00	100.00	0	0

2.2 細胞形態觀察

2.2.1 倒置顯微鏡下觀察常規培養的人骨肉瘤MG-63細胞

常規復蘇培養的人骨肉瘤MG-63細胞經過培養3 d后如圖 1所示，在倒置相差顯微鏡下可見細胞基本已經鋪滿瓶壁，細胞呈長梭形、三角形或紡錘形等幾種形態，體積較大，密度均勻，細胞間緊密連接并黏附生長于瓶壁，未見明顯凋亡及壞死細胞，細胞生長狀態良好。

圖1 人骨肉瘤MG-63細胞常規培養3 d后細胞形態(200×) Figure1. Morphology of MG-63 cells after 3 day′s culture (200×)

圖選項

下載全尺寸圖像

下載幻燈片

2.2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察樣本表面細胞形態

將人骨肉瘤MG-63細胞與三種材料Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃、純Zr、Ti6Al4V共培養3 d并固定和熒光標記之后，在激光共聚焦顯微鏡(LSCM)下觀察各組細胞骨架和形態。其結果如圖 2所示(注：藍色熒光為Hochest33258標記細胞核；綠色熒光為FITC-phalloidin標記細胞微絲)，三種材料表面的細胞數量及黏附狀態與對照組相似，大量均勻標記的人骨肉瘤MG-63細胞黏附和平鋪于這些材料表面，其細胞骨架清晰、形態基本正常，細胞豐滿、自由伸展，與對照組無明顯差異。并且材料組未見明顯凋亡及壞死細胞，其生長狀態良好，這表明Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃材料具有良好的細胞相容性。

圖2 不同合金材料培養人骨肉瘤MG-63細胞形態與骨架結構的改變

分別用Hochest33258和FITC-phalloidin熒光標記細胞核與微絲。A組：Zr_60.14Cu_22.31 Fe_4.85 Al_9.7 Ag₃；B組：純Zr；C組：Ti6Al4V；D組：對照組

Figure2. Changes of morphology and cytoskeleton of MG-63 cells

nucleus and microfilament were stained with Hochest33258 and FITC-phalloidin respectively after co-culturing for 3 days. A group: Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃; B group: pure Zr; C group: Ti6Al4V alloy; D group: control group

圖選項

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2.2.3 掃描電鏡觀察樣本表面細胞形態

將人骨肉瘤MG-63細胞與三種材料共培養3 d后固定并噴金，再以SEM觀察材料表面細胞生長情況。Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃材料表面可見大量細胞黏附，放大可見細胞呈長梭形、紡錘形或三角形，細胞與材料表面貼壁牢固且緊密連接，呈現良好的延伸生長，未見明顯凋亡及壞死細胞；純Zr和Ti6Al4V表面也可見大量細胞，其細胞形態與貼壁狀態良好(見圖 3)。三種材料中Ti6Al4V的細胞密度顯示稍高，但Zr基非晶態合金及純Zr的細胞與其相比未見顯著差異，三種材料均表現出良好的細胞相容性。

圖3 不同合金材料培養的人骨肉瘤MG-63細胞掃描電鏡下細胞形態的改變

(a)Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃(200×)；(b)Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃(400×)；(c)純Zr(400×)；(d)Ti6Al4V (400×)

Figure3. SEM images of MG-63 cells

(a) Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃ (200×); (b) Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃ (400×); (c) pure Zr (400×); (d) Ti6Al4V alloy (400×)

圖選項

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下載幻燈片

3 討論

骨骼是構成人體的重要支架，有承重、支撐人類生命活動等重要功能，因創傷、腫瘤等原因常常造成骨組織缺血、壞死及其他病變，往往給人們的生活帶來巨大的生命和財產損失。BMGs由于其獨特的性質可作為潛在的骨科植入材料，近年來成為生物醫學領域的研究熱點^[22]。Zr-基非晶態合金的機械及電化學性能在以往的文獻報道中得到廣泛研究并探討^{[17, 23]}。雖然，鈦合金及β-型鈦合金以其良好的生物相容性、獨特的晶體結構及耐腐蝕性強等優點，一直是骨科植入材料的首選^[24]，但仍有一定的局限性。因此，本研究以鈦合金Ti6Al4V為參照，通過間接和直接細胞毒性試驗評價力學性能較好的新型無鎳Zr-基非晶態合金材料Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃的體外細胞毒性和生物相容性。

CCK-8是一種基于WST-8的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒，其原理與MTT法基本相同，不僅重復性優于MTT而且細胞毒性小。因此，本研究采用CCK-8試劑盒檢測間接細胞毒性。通過CCK-8結果提示，Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃合金組、純Zr組與Ti6Al4V組的浸提液培養人骨肉瘤MG-63細胞1、3、5 d的RGR均大于75%，并且兩種浸提面積對其影響并不大。根據GB/T 16886.5-1997標準評定，其細胞毒性級別均為0或1級，處于生物醫學材料毒性合格范圍，表明該BMGs具有較低的細胞毒性。

常規傳代培養的人骨肉瘤MG-63細胞經培養3 d后，在普通倒置相差顯微鏡下顯示，細胞基本鋪滿瓶壁，細胞呈長梭形、三角形或紡錘形等多種形態，體積較大，細胞間緊密連接，平鋪于瓶壁，未見明顯的凋亡及壞死細胞。

為進一步檢測Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃合金與人骨肉瘤MG-63細胞之間的黏附生長情況，首先采用LSCM觀察共培養材料表面的細胞形態與骨架結構。三種材料表面的人骨肉瘤MG-63細胞經共培養3 d后鏡下顯示，細胞數量及黏附狀態與對照組相似，大量均勻標記的人骨肉瘤MG-63細胞黏附和平鋪于這些材料表面，其細胞骨架清晰、形態基本正常，細胞豐滿、自由伸展，與陰性對照組無明顯差異。并且材料組未見明顯凋亡及壞死細胞，其生長狀態良好，這表明Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃材料具有良好的細胞相容性。

SEM觀察結果進一步驗證了上述結論，Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃材料與純Zr和Ti6Al4V相同，其表面可見大量人骨肉瘤MG-63細胞黏附，呈長梭形、紡錘形或三角形，細胞與材料表面貼壁牢固及連接緊密，良好的延伸生長，未見明顯凋亡及壞死細胞。三種材料中Ti6Al4V的細胞密度顯示稍高，但Zr-基非晶態合金及純Zr組的細胞與其相比未見明顯差別，三種材料均表現出良好的細胞相容性。

Lu等通過對無鎳Zr-Cu-Al-Nb-Pd非晶態合金的研究揭示，Zr-基非晶態合金材料具有良好的機械性能、耐腐蝕性及生物安全性能，可作為潛在的生物材料^[16]，本研究進一步證實該結論。

4 結論

本研究通過浸提液和與材料共培養法對Zr-基非晶態合金材料Zr_60.14Cu_22.31Fe_4.85Al_9.7Ag₃與人骨肉瘤MG-63細胞的體外細胞毒性研究，初步認為其細胞毒性處于生物醫學材料標準合格范圍，并且于材料表面黏附性生長良好，表現出良好的細胞生物相容性，故可作為潛在的骨科植入替代材料，以期在未來的臨床應用中發揮重要作用。

引言