CK2β促進Pink1/Parkin介導的Miro1降解_《生物醫學工程學雜志》

作者：

張臣良 , 秦思月 ,  姜長安

四川大學華西第二醫院出生缺陷與相關婦兒疾病教育部重點實驗室, 成都 610041;

關鍵詞：

帕金森病 CK2β PARKIN1 MIRO1

DOI：

10.7507/1001-5515.20140248

視頻：

導出 下載 收藏 掃碼 引用

摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

帕金森氏病相關蛋白PTEN-induced putative kinase 1(PINK1)在細胞內有兩種亞型,分別是定位于線粒體表面的全長PINK1(PINK1FL)和定位于細胞質的PINK1-cyto。PINK1FL能在功能下降的線粒體表面積累,協同另一帕金森病相關蛋白PARKIN降解線粒體轉運因子MIROL1,但目前對PINK1-cyto的功能卻了解得極少。為了探討PINK1-cyto在細胞質中的生理學功能,我們在HEK293細胞中通過細胞轉染瞬時表達不同蛋白,并利用免疫共沉淀的方法探討蛋白質間的相互作用。實驗結果表明,PINK1-cyto在Casein Kinase Ⅱ調控亞基CK2β的幫助下,可以協同PARKIN降解MIRO1,并且CK2β的這一功能不依賴于Casein Kinase Ⅱ的催化亞基CK2α。同時,免疫共沉淀分析表明CK2β可以促進PINK1-cyto與MIROL1的結合。這說明,除了與CK2α結合外,CK2β也可以與PINK1-cyto結合形成具有生理活力的激酶復合體。

引用本文： 張臣良, 秦思月, 姜長安. CK2β促進Pink1/Parkin介導的Miro1降解. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(6): 1310-1315. doi: 10.7507/1001-5515.20140248 復制

引言

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種因多巴胺神經元缺失或死亡而引起的神經退行性疾病^[1]。PTEN-induced putative kinase 1 (pink1)和parkin是目前已發現的兩個遺傳性帕金森病基因。pink1編碼一個含有線粒體定位序列的Ser/Thr蛋白激酶，而parkin編碼的是一個與線粒體自噬(mitophagy)相關的泛素E3連接酶^[2-4]。研究表明全長PINK1(PINK1FL)在細胞質合成后會向線粒體內部轉運。在正常線粒體上，PINK1FL在未完全進入線粒體前就會被位于內膜上的蛋白酶PARL切去N-端的103個氨基酸，從而形成較短的PINK1-cyto亞型，并留在了細胞質；而當線粒體受損時，PINK1FL會在線粒體外膜積累，同時招募PARKIN泛素化線粒體外膜蛋白，如MITOFUSIN1、MIRO1等^[5]，進而激活受損線粒體通過自噬途徑被清除^[4-6]。在心肌細胞中，PINK1對MITOFUSIN2的磷酸化是PARKIN定位到線粒體的關鍵^[5]。利用自噬途徑清除損毀的細胞器和變性蛋白聚集體，被認為是神經元的重要自我保護機制之一。在正常生理條件下，雖然細胞質中的PINK1-cyto很不穩定^[7]，但在一些細胞中，PINK1-cyto水平很高，并可以定位于線粒體外膜起到保護細胞的功能，但具體機制還不清楚^[8]。MIRO1是一個定位于線粒體外膜的GTP酶，通過和MILTON、KHC等蛋白形成功能復合體來調控線粒體的轉運^[9]。研究發現，當線粒體受損時，線粒體外膜上積累的PINK1FL可以磷酸化MIRO1，從而啟動PARKIN對MIRO1的泛素化，促使MIRO1通過蛋白酶體途徑降解，最終導致線粒體的轉運停止^[10-11]。

Casein Kinase Ⅱ(CK2)是一個廣泛分布的Ser/Thr蛋白激酶復合體。它主要由兩個催化亞基，CK2α1和CK2α2，以及兩個CK2β調控亞基組成。研究發現，CK2β可以作為一個中介蛋白，將具有激酶活性的催化亞基和底物結合在一起，從而促進CK2激酶對底物進行磷酸化^[12]。在本研究中，我們主要探討了CK2β對PINK1-cyto蛋白激酶活性及其底物識別的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293細胞株購于ATCC；細胞培養胎牛血清購于Biowest；DMEM培養基購于Hyclone；質粒抽取試劑盒及DNA膠回收試劑盒購于OMEGA BIO-TEK；所用限制性內切酶購于New England Biolabs；真核表達載體pcDNA3.1(+)購于Invitrogen；Flag、HA、myc單克隆鼠抗體均購于Prospect；Protein G Agarose購于Millipore；Dylight680標記的羊抗鼠Western二抗和及蛋白酶抑制劑購于Thermo Scientific；人類基因cDNA均購于Addgene；無激酶活性pink1-cyto突變體cDNA由成都靈動生物技術公司構建；轉染試劑MegaTran1.0購于Origene；其它生化試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 質粒構建

以Addgene公司cDNA基因為模板，利用帶有限制性內切酶位點的上下游引物通過PCR獲得目的基因片段，然后用相同的限制性內切酶酶切目的基因片段及帶有不同標簽的表達載體pcDNA3.1(+)，最后用T4連接酶將目的基因片段連入表達載體。將連接產物轉化入感受態大腸桿菌中，并將其均勻涂在相應抗性的LB-瓊脂糖平板上，37 ℃培養，待長出菌落后，挑取單克隆進行搖菌，最后提取質粒并用相應的限制性內切酶進行酶切檢測目的基因片段是否連入。質粒構建引物設計如表 1所示，實驗中所用引物均由上海生工公司合成。pink1-cyto只含有pink1基因104~581位氨基酸所對應的序列。兩種無激酶活性pink1-cyto突變體cDNA由成都靈動生物技術公司構建，其中Kinase Death(KD)形式突變位點為K219D/D362A/D384A；CLM形式是將Pink1激酶結構域中的162~170位氨基酸均替換為丙氨酸(A)。HA-parkin表達質粒直接購于Addgene。

表1 cDNA PCR擴增引物序列 Table1. Primers of cDNA PCR amplification

表選項

下載CSV

基因	引物序列(5′to 3′)
pink1-cyto	上游引物GATCGAATTCGAGGAAAAACAGG- CGGAGAGC
	下游引物GATCCTCGAGTCACAGGGCTGCCC- TCCATGAG
parkin	上游引物GATCGGATCCGCCACCATGATAGT- GTTTGTCAGGTTC
	下游引物GATCTCTAGACACGTCGAACCAGT- GGTCCCC
ck2β	上游引物GATCGGATCCGCCACCATGAGCAG- CTCAGAGGAGGTG
	下游引物GATCCTCGAGGCGAATCGTCTTGA- CTGGGCTC
ck2α1	上游引物GATCGGATCCGCCACCATGTCGGG- ACCCGTGCCAAGC
	下游引物GATCTCTAGACTGCTGAGCGCCAG- CGGCAGC
ck2α2	上游引物GATCGGATCCGCCACCATGCCCGGCCCGGCCGCGGGC
	下游引物GATCTCTAGATCGTGCTGCCGTGA- GACCACT
miro1	上游引物GATCGAATTCATGAAGAAAGACG- TGCGGATC
	下游引物GATCCTCGAGTCATCGCTGTTTCA- ATAATGCTTTG

1.2.2 細胞培養與表達質粒的轉染

HEK293細胞培養液為DMEM完全培養基，其中含有10%胎牛血清和1% Penicillin-Streptomycin(PS)溶液,培養箱環境為37 ℃和5% CO2。細胞在轉染前12 h接種到細胞培養板中，24孔細胞培養板以12萬個/孔細胞量接種，6孔細胞培養板以50萬個/孔細胞量接種；轉染操作嚴格按照Mega Tran1.0說明書進行，對HEK293細胞轉染效率約為95%。轉染后細胞在完全培養液中培養24 h，然后進行后續實驗操作。

1.2.3 免疫共沉淀

將細胞接種在6孔板中，12 h后將不同蛋白的表達質粒轉染進細胞，轉染后細胞培養24 h，使目的蛋白充分表達。然后去掉培養液，用PBS洗3次，每孔再加入200 μL NP-40細胞裂解液(1% NP-40，50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCL，1 mmol/L Protease Inhibitor Cocktail，pH 8.0)，細胞在冰上裂解25 min后將細胞裂解產物收于EP管中，14 000 r/min，4 ℃離心15 min；離心后取上清10 μL作為全細胞裂解產物(input),其余上清轉移至新的EP管中，加入2 μg抗體，4 ℃轉動孵育2 h，然后加入15 μL Protein G珠子(加入之前先用NP-40裂解液洗三次)，繼續4 ℃轉動孵育1 h，然后再用NP-40裂解液洗珠子4次，最后吸干裂解液，加入20 μL SDS緩沖液(2% SDS,40 mmol/L Tris，2 mmol/L DTT，4%甘油，0.01%溴酚藍，pH 6.8),100 ℃煮10 min。最后通過Western blot來檢測蛋白量。在PINK-cyto與CK2β的免疫共沉淀實驗中，以帶有Flag標簽的CK2β為誘餌蛋白，利用Flag抗體沉淀帶有myc標簽的PINK1-cyto；在MIRO1與CK2β的免疫共沉淀實驗中，同樣以帶有Flag標簽的CK2β為誘餌蛋白，利用Flag抗體沉淀帶有myc標簽的MIRO1；在CK2β對MIRO1與PINK1-cyto相互作用影響的免疫共沉淀實驗中，以帶有Flag標簽的PINK1-cyto為誘餌蛋白，利用Flag抗體沉淀帶有myc標簽的MIRO1。

1.2.4 Western blot檢測

蛋白樣品先用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，然后通過濕轉法將凝膠上的蛋白轉移到PVDF膜上，用含有5%脫脂奶粉的PBST封閉1 h，PBST洗膜三次，然后孵育相應的蛋白一抗，4 ℃轉動孵育過夜，移去一抗，PBST洗三次，然后用Dylight680熒光標記的羊抗鼠二抗在室溫孵育1 h，二抗孵育后用PBST洗3次。最后用Li-Cor Odyssey 紅外激光成像系統檢測抗原。用Image J軟件分析Western blot蛋白條帶灰度，來檢測蛋白量的變化。

1.2.5 統計學方法

每組實驗獨立重復3遍，實驗數據用均數±標準差(x±s)表示，組與組之間數據采用t檢驗進行統計分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 構建相關表達質粒

以購買的含有相關基因cDNA的質粒為模板，利用帶有酶切位點的PCR引物及PCR反應體系擴增目的基因片段，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增效果，得到正確的cDNA擴增片段[見圖 1(a)]。將酶切后的cDNA片段與相應的表達載體進行連接,依照1.2.1中的實驗方法，得到擴增的單克隆連接產物，然后對連接產物進行酶切檢測，表明已得到正確的表達載體[見圖 1(b)]。

圖1 PCR擴增目的基因cDNA片段和表達質粒的構建

(a)瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA的PCR擴增產物；(b)限制性內切酶檢測表達載體的構建

Figure1. Amplification of cDNA and construction of expression plasmids

(a) electrophoresis of PCR product of cDNA； (b) identification of constructions of expression plasmids by restriction endonuclease digestion

圖選項

1.	ABELIOVICH A, FLINT BEAL M. Parkinsonism genes:culprits and clues[J]. J Neurochem, 2006, 99(4):1062-1072.
2.	ABOU-SLEIMAN P M, MUQIT M M, WOOD N W. Expanding in sights of mitochondrial dysfuction in Parkinson's disease[J]. Nat Rev Neurosci, 2006, 7(3):207-219.
3.	CLARK I E, DODSON M W, JIANG C, et al. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with Parkin[J]. Nature, 2006, 441(3):1162-1166.
4.	VIVES-BAUZA C, ZHOU C, HUANG Y, et al. PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107(1):378-383.
5.	GEGG ME, COOPERJ M, CHAU K Y, et al. Mitofusin 1 and mitofusin 2 are ubiquitinated in a PINK1/parkin-dependent manner upon induction of mitophagy[J]. Hum Mol Genet, 2010, 19(24):4861-4870.
6.	YANG Y, GEHRKE S, IMAI Y, et al. Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuronegeneration caused by inactivation of drosophila Pink1is rescued by pakin[J]. PNAS, 2006, 103(1):10793-10798.
7.	ZHOU C, HUANG Y, SHAO Y, et al. The kinase domain of mitochondrial PINK1 faces the cytoplasm[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(33):12022-12027.
8.	BECKER D, RICHTER J, TOCILESCU M A,et al. Pink1 kinase and its membrane potential(Deltaψ)-dependent cleavage product both localize to outer mitochondrial membrane by unique targeting mode[J]. J Biol Chem, 2012, 287(27):22969-22987.
9.	FRANSSON A, RUUSALA A, ASPENSTROM P. Atypical Rho GTPases have roles in mitochondrial homeostasis and apoptosis[J]. J Biol Chem, 2003, 278(8):6495-6502.
10.	LIU S, SAWADA T, LEE S, et al. Parkinson's disease-associated Kinase PINK1 regulates Miro protein level and axonal transport of mitochondria[J]. PLoS Genet, 2012, 8(3):e1002537.
11.	WANG X, WINTER D, ASHRAFI G, et al. PINK1 and Parkin marget Miro for phosphorylation and degradation to arrest mitochondrial motility[J]. Cell, 2011, 147(11):893-906.
12.	GIETZ R D, GRAHAM K C, LITCHFIELD D W. Interactions between the subunits of casein kinase Ⅱ[J]. J Biol Chem, 1995, 270:1302-13021.
13.	CHEN Y, DORN G W. PINK1-phosphorylated mitofusin 2 is a Parkin receptor for culling damaged mitochondria[J]. Science, 2013, 340(6131):471-475.

《生物醫學工程學雜志》

CK2β促進Pink1/Parkin介導的Miro1降解

摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

引言

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 質粒構建

1.2.2 細胞培養與表達質粒的轉染

1.2.3 免疫共沉淀

1.2.4 Western blot檢測

1.2.5 統計學方法

2 結果

2.1 構建相關表達質粒

2.2 CK2β促進PINK1-cyto/PARKIN對MIRO1的降解

2.3 CK2β促進PINK1-cyto與MIRO1的相互作用

2.4 CK2β促進PINK1-cyto/PARKIN介導的MIRO1降解不依賴于CK2激酶催化亞基

2.5 PINK1-cyto對MIRO1降解的調控依賴于其激酶活性

3 討論

引言

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 質粒構建

1.2.2 細胞培養與表達質粒的轉染

1.2.3 免疫共沉淀

1.2.4 Western blot檢測

1.2.5 統計學方法

2 結果

2.1 構建相關表達質粒

2.2 CK2β促進PINK1-cyto/PARKIN對MIRO1的降解

2.3 CK2β促進PINK1-cyto與MIRO1的相互作用

2.4 CK2β促進PINK1-cyto/PARKIN介導的MIRO1降解不依賴于CK2激酶催化亞基

2.5 PINK1-cyto對MIRO1降解的調控依賴于其激酶活性

3 討論

上一篇

下一篇

Format

Content

摘要全文圖表視頻參考文獻施引文獻補充材料