本研究旨在探討鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠在不同的病程持續時間內認知功能損傷及海馬神經元細胞凋亡的情況。通過一次性腹腔注射60 mg/kg鏈脲佐菌素,建立Ⅰ型糖尿病Wistar大鼠模型。建模后在不同的病程持續時間檢測體重、血糖值,應用Y迷宮檢測大鼠的認知能力,進一步HE染色檢測大鼠海馬CA1區神經元細胞的凋亡情況。結果發現,糖尿病大鼠隨著發病時間的延長,表現出體重逐漸下降和持續高血糖;糖尿病發病70 d以上,大鼠的海馬CA1區神經元細胞存活數量明顯減少,學習記憶功能下降。本研究顯示鏈脲佐菌素誘發的糖尿病大鼠,在發病70 d可表現出認知功能障礙和腦海馬神經元細胞損傷,具有明顯的糖尿病腦病特征。
引用本文： 薛宏宇, 汪俊博, 莊玉俠, 高貴珍. 糖尿病Wistar大鼠海馬神經元損傷及認知功能障礙研究. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(6): 1305-1309. doi: 10.7507/1001-5515.20140247 復制
引言
糖尿病是一種全身代謝紊亂的綜合性疾病，長期的代謝紊亂會引起眼、腎、心臟及神經系統等損傷。其中，糖尿病腦病是一種常見的與中樞神經系統退行性病變和功能損傷相關的糖尿病并發癥[1]。在1922年便有報道糖尿病能夠引起認知功能損傷，隨后的大量研究表明這種認知的損傷在Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病中都有發生。研究發現，糖尿病腦病患者出現嚴重的認知功能障礙和不同程度生活自理困難，并且由糖尿病引發的癡呆比其他原因引起的癡呆發病率更高[2]。臨床癥狀主要表現為學習、記憶、解決問題和運動反應速度能力等障礙[3-4]。目前認為糖尿病腦病的發病機制可能是糖尿病患者長期的高血糖引起脂質代謝紊亂，血液黏稠度不斷升高，血管壁狹窄，最終造成腦部血供應不足，從而誘發與認知有關的腦神經元細胞損傷。研究發現，隨著發病時間的延長，與認知相關的海馬CA1和CA2區神經元細胞發生凋亡，進而表現出認知下降[5-6]。
糖尿病腦病的發病機制已受到越來越多的人關注，但由于患者腦標本難以獲得，因此把實驗動物作為研究糖尿病腦病發病機制和藥物治療機制的模型已成為當前研究的主要手段，科學實驗和臨床研究迫切需求成熟的糖尿病腦病動物模型。由于糖尿病腦病主要表現為學習和記憶等功能障礙，形態學檢查也發現患者海馬神經元細胞凋亡或丟失，因此本研究從學習記憶能力以及與認知相關的海馬神經元細胞形態變化的角度對鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)誘導的糖尿病腦病大鼠進行研究。首先通過腹腔注射STZ構建糖尿病大鼠模型，進一步檢測和觀察糖尿病大鼠發病后不同病程時間的血糖、體重、行為學和海馬神經元細胞形態學表現，對糖尿病腦病的發病情況進行探討，為糖尿病腦病的進一步藥物試驗提供指導依據。
1 材料和方法
1.1 主要試劑及儀器
STZ購自Sigma公司，蘇木精和伊紅購自北京中杉金橋生物技術有限公司，多聚甲醛購自北京化學試劑公司，其他試劑均為國產分析純試劑。快速血糖檢測血糖儀購自上海新立生物技術公司，熒光倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，旋轉式薄片切片機購自德國萊卡公司，Y迷宮購自中科院上海生理所。
1.2 實驗動物模型的構建
Wistar大鼠購自大連醫科大學實驗動物中心，2月齡，體重230~250 g，雄性，適應一周之后，經Y迷宮篩選除去認知過于敏感或遲鈍的大鼠。糖尿病造模：一次性腹腔注射STZ(60 mg/kg)，給藥后分別在第3天和第7天2次檢測血糖，空腹血糖≥11.1 mmol/L為造模成功，未成模者除去，給藥后第8天記作糖尿病發病第1天，最終取90只成功造模大鼠進行實驗。
以90只造模成功的大鼠作為糖尿病組進行實驗，共分為9組，每組10只，分別在第20、30、40、50、60、70、80、90、100天進行檢查。另取10只正常大鼠注射相應劑量生理鹽水作為對照組。各組大鼠分籠飼養，溫度為(24±1)℃，自由進食進水，12 h光照。所有動物進行血糖、體重、Y迷宮測試，然后處死、取腦、固定、染色、細胞計數觀察。
1.3 行為學觀察
鼠具有喜暗避明習性，Y迷宮的工作原理就是通過對鼠明暗辨別特性學習記憶能力考查來評價其認知能力[7]。Y迷宮的實驗操作條件為：40 V直流電電壓，0.7 mA電流。具體步驟為：首先將大鼠放入其中一個臂箱，適應2 min，隨機開啟另外兩個臂箱中的一個信號燈，短時間后如果大鼠一直停留在暗處或者跑到另外一黑暗處，就會遭到足底電擊，最終跑到亮燈的安全區域一次學習完成。間隔2 min，進行下一次訓練。檢測要求為：大鼠由所在區域直接跑向安全區即為學習正確。每日訓練20次，直到正確率連續達80%為學會。記錄訓練次數、訓練天數、錯誤的次數和反應時間(到達安全區的時間，單位為s)。
1.4 形態學檢測并計數
大鼠進行乙醚深度麻醉，安樂處死，在冰臺上快速取出全腦，冰冷生理鹽水中洗凈組織表面血液，4%多聚甲醛固定48 h(4 ℃保存)，隨后用石蠟進行包埋，切片(厚度6 μm)，進行蘇木精-伊紅(HE)染色。具體操作步驟：固定，脫水，蘇木精染色5 min，分化，沖洗，再伊紅染色，酒精梯度脫水，透明，封片，400倍鏡下觀察。
海馬神經元細胞計數方法：以海馬組織齒狀回上下側分支末端連線延長與海馬CA1區交界為中點，沿海馬神經元走向以交界中點為中心，向兩方向各延長0.5 mm，取海馬CA1區細胞1 mm長度作為實驗計數范圍，進行計數并照相。
1.5 統計分析
所有實驗數據以均數±標準差(
2 結果
2.1 體重和血糖檢測
檢測各組大鼠的血糖值和體重，結果如表 1所示。與對照組相比，發病20 d以上的糖尿病大鼠的體重明顯降低，差異有統計學意義。糖尿病大鼠由發病到處死一直處于高血糖狀態，與空白對照組相比差異有統計學意義。
表1
實驗動物的血糖值和體重(n=10)
Table1.
Blood glucose levels and body weights of the experimented rats (n=10)
2.2 行為學觀察
如表 2所示，行為觀察結果表明，糖尿病鼠在發病40 d內，認知能力無明顯下降；發病50 d能夠觀察到有輕微的認知變化，但差異無統計學意義；發病60 d以上開始表現出認知損傷，訓練次數、訓練天數、錯誤次數和反應時間與對照組比較差異均有統計學意義。
表2
Y-迷宮檢測認知能力(n=10)
Table2.
Cognitive function measured by using Y-maze (n=10)
2.3 形態學檢測
HE染色結果如圖 1所示。正常大鼠海馬CA1區神經元細胞規則排列，細胞圓而邊緣清晰，胞核、核仁、胞質清晰可見；糖尿病發病40 d，未表現出明顯的神經元細胞損傷；糖尿病發病50 d以后，神經元開始出現疏松，形態發生改變，排列松散，表現為細胞核固縮、胞質減少等凋亡細胞特有表現，或者是已經壞死消失；當發病60 d后，其CA1區神經元細胞發生大面積形態改變；發病70~100 d的檢測結果顯示，細胞損傷越來越嚴重。
圖1
大鼠海馬CA1區神經元細胞(HE染色，400×)
Figure1.
Histological examination of hippocampal CA1 regions(HE stain,400×)
2.4 大鼠海馬CA1區存活神經元計數
如圖 2所示，對照組的海馬CA1區每毫米存活神經元細胞為(298±21)個；糖尿病發病50 d海馬CA1區存活的神經元細胞數量明顯減少，差異有統計學意義；發病60 d以上時，凋亡或壞死的神經元細胞數量進一步增多，并且隨著發病時間的延長，細胞損傷越來越嚴重。
圖2
大鼠海馬CA1區存活神經元細胞計數(n=10)
與對照組相比較，#
compared with the control group. #
3 討論
本實驗中經STZ誘導的大鼠，表現為多飲、多食、體重逐漸減輕、排尿量增多，符合典型的糖尿病發病特征，因此本實驗糖尿病模型造模成功。很多研究報道已經闡述了糖尿病并發癥中出現的細胞凋亡與長期的高血糖和氧化損傷有關，長期的高血糖能夠引起實驗動物的認知能力下降[8]。已有很多學者利用不同的檢測方法(包括Y迷宮、水迷宮等)對不同的糖尿病模型進行實驗研究[9]。Y迷宮作為一種辨別動物學習能力、工作記憶及參考記憶的檢測手段，具有簡便、可行等優點，并且具有一定的實用性。Y迷宮利用了嚙齒類動物對新異環境天然探究的自然習性，不需要動物學習任何規則來趨利避害，能夠有效地反映動物對新異環境的識別記憶能力。因此，本實驗采用此方法檢測大鼠學習認知能力。結果表明，STZ誘導的糖尿病大鼠長期處于高血糖狀態(血糖值＞23 mmol/L)，隨著發病時間的延長，Y迷宮的檢測結果顯示其認知能力下降、反應時間延長。有研究表明STZ誘導糖尿病大鼠在發病13周(91 d左右)可出現晶狀體渾濁的白內障表現[10]，發病24周可出現嚴重晶狀體渾濁[11]。但是，本實驗中僅少數幾只大鼠出現眼病，實驗中已被排除。而且，Y迷宮實驗在暗室中進行，每個臂端裝有25度小燈泡，因此每臂的光強度足夠，即使大鼠出現輕微白內障也能感受光的存在，因此可以排除該因素對Y迷宮實驗結果的干擾。
細胞凋亡導致的退行性神經紊亂，可嚴重影響中樞神經系統功能，已在不同的實驗模型中被很多學者所闡述[12]。大量的研究表明，海馬組織作為大腦的重要組成部分，與學習、記憶功能密切相關，有學者認為海馬可能就是大腦的主存儲器，尤其是海馬的CA1區神經元與學習記憶功能的關系更為密切[13]。長期的糖尿病引起海馬組織神經元損傷，繼而引起細胞凋亡，最終導致學習、記憶功能下降[14]。因此，本實驗把檢測實驗大鼠海馬CA1區神經元細胞凋亡或丟失作為重要的指標。研究結果表明，長期高血糖狀態的大鼠，海馬CA1區神經元發生細胞凋亡或丟失，并且隨著發病時間的延長，細胞凋亡的數量明顯增加。發病50 d時，雖然認知功能未見異常，但已經出現相當數量的神經元丟失或凋亡；發病70 d以上時，無論是認知功能還是存活神經元細胞數都與對照組有明顯差異。
綜上所述，本組實驗的大鼠在糖尿病發病一定時間后，認知能力下降，海馬神經元出現明顯損傷，這為糖尿病腦病的研究提供了一定的理論依據，對進一步的臨床治療研究也有指導意義。
引言
糖尿病是一種全身代謝紊亂的綜合性疾病，長期的代謝紊亂會引起眼、腎、心臟及神經系統等損傷。其中，糖尿病腦病是一種常見的與中樞神經系統退行性病變和功能損傷相關的糖尿病并發癥[1]。在1922年便有報道糖尿病能夠引起認知功能損傷，隨后的大量研究表明這種認知的損傷在Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病中都有發生。研究發現，糖尿病腦病患者出現嚴重的認知功能障礙和不同程度生活自理困難，并且由糖尿病引發的癡呆比其他原因引起的癡呆發病率更高[2]。臨床癥狀主要表現為學習、記憶、解決問題和運動反應速度能力等障礙[3-4]。目前認為糖尿病腦病的發病機制可能是糖尿病患者長期的高血糖引起脂質代謝紊亂，血液黏稠度不斷升高，血管壁狹窄，最終造成腦部血供應不足，從而誘發與認知有關的腦神經元細胞損傷。研究發現，隨著發病時間的延長，與認知相關的海馬CA1和CA2區神經元細胞發生凋亡，進而表現出認知下降[5-6]。
糖尿病腦病的發病機制已受到越來越多的人關注，但由于患者腦標本難以獲得，因此把實驗動物作為研究糖尿病腦病發病機制和藥物治療機制的模型已成為當前研究的主要手段，科學實驗和臨床研究迫切需求成熟的糖尿病腦病動物模型。由于糖尿病腦病主要表現為學習和記憶等功能障礙，形態學檢查也發現患者海馬神經元細胞凋亡或丟失，因此本研究從學習記憶能力以及與認知相關的海馬神經元細胞形態變化的角度對鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)誘導的糖尿病腦病大鼠進行研究。首先通過腹腔注射STZ構建糖尿病大鼠模型，進一步檢測和觀察糖尿病大鼠發病后不同病程時間的血糖、體重、行為學和海馬神經元細胞形態學表現，對糖尿病腦病的發病情況進行探討，為糖尿病腦病的進一步藥物試驗提供指導依據。
1 材料和方法
1.1 主要試劑及儀器
STZ購自Sigma公司，蘇木精和伊紅購自北京中杉金橋生物技術有限公司，多聚甲醛購自北京化學試劑公司，其他試劑均為國產分析純試劑。快速血糖檢測血糖儀購自上海新立生物技術公司，熒光倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，旋轉式薄片切片機購自德國萊卡公司，Y迷宮購自中科院上海生理所。
1.2 實驗動物模型的構建
Wistar大鼠購自大連醫科大學實驗動物中心，2月齡，體重230~250 g，雄性，適應一周之后，經Y迷宮篩選除去認知過于敏感或遲鈍的大鼠。糖尿病造模：一次性腹腔注射STZ(60 mg/kg)，給藥后分別在第3天和第7天2次檢測血糖，空腹血糖≥11.1 mmol/L為造模成功，未成模者除去，給藥后第8天記作糖尿病發病第1天，最終取90只成功造模大鼠進行實驗。
以90只造模成功的大鼠作為糖尿病組進行實驗，共分為9組，每組10只，分別在第20、30、40、50、60、70、80、90、100天進行檢查。另取10只正常大鼠注射相應劑量生理鹽水作為對照組。各組大鼠分籠飼養，溫度為(24±1)℃，自由進食進水，12 h光照。所有動物進行血糖、體重、Y迷宮測試，然后處死、取腦、固定、染色、細胞計數觀察。
1.3 行為學觀察
鼠具有喜暗避明習性，Y迷宮的工作原理就是通過對鼠明暗辨別特性學習記憶能力考查來評價其認知能力[7]。Y迷宮的實驗操作條件為：40 V直流電電壓，0.7 mA電流。具體步驟為：首先將大鼠放入其中一個臂箱，適應2 min，隨機開啟另外兩個臂箱中的一個信號燈，短時間后如果大鼠一直停留在暗處或者跑到另外一黑暗處，就會遭到足底電擊，最終跑到亮燈的安全區域一次學習完成。間隔2 min，進行下一次訓練。檢測要求為：大鼠由所在區域直接跑向安全區即為學習正確。每日訓練20次，直到正確率連續達80%為學會。記錄訓練次數、訓練天數、錯誤的次數和反應時間(到達安全區的時間，單位為s)。
1.4 形態學檢測并計數
大鼠進行乙醚深度麻醉，安樂處死，在冰臺上快速取出全腦，冰冷生理鹽水中洗凈組織表面血液，4%多聚甲醛固定48 h(4 ℃保存)，隨后用石蠟進行包埋，切片(厚度6 μm)，進行蘇木精-伊紅(HE)染色。具體操作步驟：固定，脫水，蘇木精染色5 min，分化，沖洗，再伊紅染色，酒精梯度脫水，透明，封片，400倍鏡下觀察。
海馬神經元細胞計數方法：以海馬組織齒狀回上下側分支末端連線延長與海馬CA1區交界為中點，沿海馬神經元走向以交界中點為中心，向兩方向各延長0.5 mm，取海馬CA1區細胞1 mm長度作為實驗計數范圍，進行計數并照相。
1.5 統計分析
所有實驗數據以均數±標準差(
2 結果
2.1 體重和血糖檢測
檢測各組大鼠的血糖值和體重，結果如表 1所示。與對照組相比，發病20 d以上的糖尿病大鼠的體重明顯降低，差異有統計學意義。糖尿病大鼠由發病到處死一直處于高血糖狀態，與空白對照組相比差異有統計學意義。
表1
實驗動物的血糖值和體重(n=10)
Table1.
Blood glucose levels and body weights of the experimented rats (n=10)
2.2 行為學觀察
如表 2所示，行為觀察結果表明，糖尿病鼠在發病40 d內，認知能力無明顯下降；發病50 d能夠觀察到有輕微的認知變化，但差異無統計學意義；發病60 d以上開始表現出認知損傷，訓練次數、訓練天數、錯誤次數和反應時間與對照組比較差異均有統計學意義。
表2
Y-迷宮檢測認知能力(n=10)
Table2.
Cognitive function measured by using Y-maze (n=10)
2.3 形態學檢測
HE染色結果如圖 1所示。正常大鼠海馬CA1區神經元細胞規則排列，細胞圓而邊緣清晰，胞核、核仁、胞質清晰可見；糖尿病發病40 d，未表現出明顯的神經元細胞損傷；糖尿病發病50 d以后，神經元開始出現疏松，形態發生改變，排列松散，表現為細胞核固縮、胞質減少等凋亡細胞特有表現，或者是已經壞死消失；當發病60 d后，其CA1區神經元細胞發生大面積形態改變；發病70~100 d的檢測結果顯示，細胞損傷越來越嚴重。
圖1
大鼠海馬CA1區神經元細胞(HE染色，400×)
Figure1.
Histological examination of hippocampal CA1 regions(HE stain,400×)
2.4 大鼠海馬CA1區存活神經元計數
如圖 2所示，對照組的海馬CA1區每毫米存活神經元細胞為(298±21)個；糖尿病發病50 d海馬CA1區存活的神經元細胞數量明顯減少，差異有統計學意義；發病60 d以上時，凋亡或壞死的神經元細胞數量進一步增多，并且隨著發病時間的延長，細胞損傷越來越嚴重。
圖2
大鼠海馬CA1區存活神經元細胞計數(n=10)
與對照組相比較，#
compared with the control group. #
3 討論
本實驗中經STZ誘導的大鼠，表現為多飲、多食、體重逐漸減輕、排尿量增多，符合典型的糖尿病發病特征，因此本實驗糖尿病模型造模成功。很多研究報道已經闡述了糖尿病并發癥中出現的細胞凋亡與長期的高血糖和氧化損傷有關，長期的高血糖能夠引起實驗動物的認知能力下降[8]。已有很多學者利用不同的檢測方法(包括Y迷宮、水迷宮等)對不同的糖尿病模型進行實驗研究[9]。Y迷宮作為一種辨別動物學習能力、工作記憶及參考記憶的檢測手段，具有簡便、可行等優點，并且具有一定的實用性。Y迷宮利用了嚙齒類動物對新異環境天然探究的自然習性，不需要動物學習任何規則來趨利避害，能夠有效地反映動物對新異環境的識別記憶能力。因此，本實驗采用此方法檢測大鼠學習認知能力。結果表明，STZ誘導的糖尿病大鼠長期處于高血糖狀態(血糖值＞23 mmol/L)，隨著發病時間的延長，Y迷宮的檢測結果顯示其認知能力下降、反應時間延長。有研究表明STZ誘導糖尿病大鼠在發病13周(91 d左右)可出現晶狀體渾濁的白內障表現[10]，發病24周可出現嚴重晶狀體渾濁[11]。但是，本實驗中僅少數幾只大鼠出現眼病，實驗中已被排除。而且，Y迷宮實驗在暗室中進行，每個臂端裝有25度小燈泡，因此每臂的光強度足夠，即使大鼠出現輕微白內障也能感受光的存在，因此可以排除該因素對Y迷宮實驗結果的干擾。
細胞凋亡導致的退行性神經紊亂，可嚴重影響中樞神經系統功能，已在不同的實驗模型中被很多學者所闡述[12]。大量的研究表明，海馬組織作為大腦的重要組成部分，與學習、記憶功能密切相關，有學者認為海馬可能就是大腦的主存儲器，尤其是海馬的CA1區神經元與學習記憶功能的關系更為密切[13]。長期的糖尿病引起海馬組織神經元損傷，繼而引起細胞凋亡，最終導致學習、記憶功能下降[14]。因此，本實驗把檢測實驗大鼠海馬CA1區神經元細胞凋亡或丟失作為重要的指標。研究結果表明，長期高血糖狀態的大鼠，海馬CA1區神經元發生細胞凋亡或丟失，并且隨著發病時間的延長，細胞凋亡的數量明顯增加。發病50 d時，雖然認知功能未見異常，但已經出現相當數量的神經元丟失或凋亡；發病70 d以上時，無論是認知功能還是存活神經元細胞數都與對照組有明顯差異。
綜上所述，本組實驗的大鼠在糖尿病發病一定時間后，認知能力下降，海馬神經元出現明顯損傷，這為糖尿病腦病的研究提供了一定的理論依據，對進一步的臨床治療研究也有指導意義。
