膜片鉗技術是通過測量pA級細胞離子通道電流來研究各種離子通道及其調控機制,但測量對象和測量儀器本身引入的快電容(C-fast)和慢電容(C-slow)偽差信號,會改變動作電位的發放特性。本文首先討論快電容偽差信號對膜電容以及膜電位的影響,并且通過對H-H模型中膜電位變化的分析,得出膜電位變化對動作電位發放特性的影響。在此基礎上,主要通過對傳統快電容補償誤差的分析,討論其影響機制,并對電極電容形狀對快電容的影響進行了重點討論。通過這種方法不僅可以大大提高補償速度,而且從電極形狀上也可以盡量提高補償的精度。
引用本文： 鄭羽, 李靜, 蔡迪, 田磊, 黃超超, 王金海. 快電容補償方法對提高神經元細胞動作電位發放精度的影響. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(6): 1191-1194,1217. doi: 10.7507/1001-5515.20140226 復制
引言
膜片鉗技術作為一種先進的電生理技術，主要應用在各種離子通道及其調控機制方面，而分布電容的存在影響了通道電流的測量精度。
快電容補償是將瞬態偽差電流注入一個電容補償電路，提供大小相等方向相反的模擬抵消電流[1]。隨著膜片鉗技術的不斷發展，Sigworth等[1-2]設計了自動快電容補償迭代算法程序，代替了手動補償。快電容自動補償算法采用折半搜索τ值和最小二乘擬合迭代收斂法。通過根據搜索到的τ值，查表得到電容的補償值。τ值范圍的確定對于補償精度和速度有較大的影響。因此，本文將詳細討論電極電容和膜電容引入的偽差信號對動作電位發放特性的影響，并針對快電容主要補償的電極電容，通過對其形狀、環境改變的分析，從而提高補償精度。
1 全細胞測量方式下的電容補償原理
膜片鉗是利用負反饋電子線路，將玻璃微電極與細胞進行高阻封接，通過控制鉗位電壓Vc，來監測細胞膜上離子通道電流的變化[1]。由于電極尖端存在雜散的電極電容Cp、細胞膜電容Cm，在施加階躍刺激電壓時，膜片鉗放大器會產生瞬態電流偽差，影響記錄到的電流的正確性，快電容補償電路如圖 1所示。
圖1
快慢電容補償原理圖
Figure1.
Schematic diagram of C-fast and C-slow compensation
將快電容充放電電流If通過注入電容Ci，使這個電流不經過I-V變換器，達到補償的目的。通過調節R1、C補償C1/Ci和τ;通過調節R2補償C2/Ci[3]，其中τ=RC1。
| ${{A}_{fc}}=\frac{{{R}_{f}}}{{{R}_{1}}}\times \frac{1}{1+{{j}_{\omega }}{{R}_{m}}C}+\frac{{{R}_{f}}}{{{R}_{2}}}$ |
時間常數τ對電流的影響是非線性的，快電容自動補償算法搜索得到的τ值，通過擬合三個參量f0、f1、f2權重，查表得到電容的補償值[4]。f0、f1、f2分別為τ值改變一個步長時、帶延遲的補償通道提供1 pF快電容補償量時和不帶延遲的補償通道提供1 pF快電容補償量時，對輸出電流的影響。
在傳統快電容補償算法中，τ值范圍對補償的精度有較大的影響，當τ值搜索錯誤，不能達到最佳補償，將會引入2~3個數量級的快電容瞬態電流誤差，100 pA的偽差電流信號就會引入0.1 mV左右的膜電位誤差，0.1 mV的膜電位會引入一個20 ms的自主動作電位的發放，且當膜電位高于1 mV時將不能發放動作電位。因此，確定最佳τ值對于后面的補償計算是非常重要的，準確判定τ值范圍，不僅能夠提高快電容的補償精度，還能加快快電容的補償速度[3, 5-6]。
2 快電容偽差信號對動作電位的影響
階躍信號作為命令電壓加在I-V變換器上時，快電容將產生充放電，會導致監測信號信號失真并影響尖峰過后的細胞膜電流信號的觀測[7]。快電容的存在會引起跨膜電流在上升和下降沿產生尖峰，并且引入膜電壓的偽差信號，從而對動作電位的發放精度產生影響[1, 8-9]。
2.1 電極電容對膜電容和跨膜電流的影響
根據慢電容的補償原理，在完成快電容瞬態偽差補償以后，當命令電壓Vc發生階躍變化時，會引起細胞膜電容Cm充(放)電引起的瞬態失真[10]。階躍響應下的膜電容信號如圖 2所示，顯示了跨膜電流在充放電時的變化情況。由慢電容補償原理可得Rs、Rm和Cm的計算公式如下[4]，
| $\begin{align} & {{R}_{s}}=\frac{{{V}_{o}}}{{{I}_{peak}}},{{R}_{m}}=\frac{{{V}_{o}}}{{{I}_{peak}}}-{{R}_{s}},{{C}_{m}}=\tau \left( \frac{1}{{{R}_{s}}}+\frac{1}{{{R}_{m}}} \right)\text{ ,} \\ & \tau ={{R}_{m}}{{C}_{m}}~ \\ \end{align}$ |
其中Ipeak、Iss分別是慢電容電流的峰值與穩態值。由式(2)可得：Ipeak=4 nA、Iss=39.6 pA、τ=110 μs、Vo=20 mV時，Rs=5 MΩ、Rm=500 MΩ、Cm=22 pF。 快電容自動補償后的偽差電流值一般下降了2~3個數量級，當10 nA的快電容偽差信號經過補償后，偽差電流信號峰值將變為100 pA，使Ipeak=4.1 nA時，得到Cm=22.77 pF，因此100 pA的快電容偽差信號引入了約為0.77 pF的膜電容誤差值。
圖2
膜電容充(放)電時的跨膜電流
Figure2.
Membrane current during membrane capacitance charging and discharging
圖 2顯示了細胞膜電容充放電時，跨膜電流的變化情況[8, 11]。在電極電容充分補償后，破膜形成全細胞記錄模式，當t=0時，刺激電壓Vc進行躍變，細胞膜電容開始充電，流經膜電阻的電流IRm=0，當充電結束后，膜電容相當于與斷路，膜電阻電流達到最大[9, 12]。
2.2 跨膜電流對膜電位的影響
| ${{I}_{m}}\left( s \right)=\frac{{{V}_{m}}\left( s \right)}{{{R}_{th}}}-\frac{{{V}_{th}}}{s{{R}_{th}}}+s{{C}_{m}}{{V}_{m}}\left( s \right)-{{C}_{m}}{{V}_{m}}({{0}^{+}})$ |
理想情況下，電流脈沖信號如圖 3(b)所示，得：
| ${{V}_{m}}\left( s \right)=K{{R}_{th}}\left| \frac{1}{s}-\frac{1}{s+\frac{1}{{{C}_{m}}{{R}_{th}}}} \right|\left( 1-{{e}^{-{{t}_{0}}s}} \right)+\frac{{{V}_{th}}}{s}$ |
當電極尖端與細胞膜形成GΩ封接時，由于電容的存在會產生尖峰電流信號，如圖 3(c)所示，這里的尖峰信號假設由沖擊函數表示，得到的跨膜電流信號為
| ${{I}_{m}}\left( t \right)=K[\xi \left( t \right)-\xi (t-{{t}_{0}})+\Delta \left( t \right)-\Delta (t-{{t}_{0}})]$ |
圖3
刺激電流對細胞膜的作用
(a)神經細胞細胞膜電路模型； (b)跨膜脈沖電流； (c)電極電容引起的跨膜偽差電流
Figure3. Effect of stimulating current on cell membrane(a) circuit mode of nerve cell membrane circuit model; (b) transmembrane current pulse； (c) transient currents caused by electrode capacitance
該仿真模型的初始條件如下： Vth=85 mV、Rth=1 kΩ、Cm=1 μF、t0=6 ms。由于快電容補償后殘余偽差信號一般在2~3個pA量級，為了研究電極電容偽差電流對膜電位的影響，暫不考慮外加刺激電流，只考慮電極電容偽差電流的影響，選擇大小為100~1 000 pA的五組值進行仿真，偽差電流越大，引入的膜電位的誤差值越大，如100 pA的偽差電流信號就會引入0.1 mV左右的膜電位誤差。
3 快電容補償方法的改進
提高快電容的補償精度，能夠有效地提高動作電位的測量精度，因此需要提高快電容偽差電流的補償精度。
3.1 影響電極電容大小的因素
在實驗過程中，電極入液等因素會影響到電極電容的大小，而這個問題一直沒有統一的定論，因此本文通過建模方法對電極電容大小進行分析。電極電容Cp包括電極浸入內液與浴液部分形成的跨壁電容Ct和電極未入液部分與地表形成的漂浮電容Cs[14]。Ct是電極電容的主要部分，在實驗中會受到微電極幾何尺寸、生理溶液類型、入液深度及濃度等不確定因素的影響。因此，本文通過COMSOL對Ct從微電極柱狀部分浸入生理溶液的長度、電極尖端開口夾角、玻璃電極厚度以及溫度這四個方面進行分析，仿真模型圖如圖 4所示。
圖4
電極電容影響因素的仿真模型
(a)電極入液長度的影響； (b)電極尖端開口角度的影響； (c)微電極玻璃壁厚度的影響
Figure4. Simulation models of effects of three factors on electrode capacitance(a) liquid electrode length; (b) opening angle of electrode tip; (c) microelectrode glass wall thickness
實驗溫度T為25 ℃，在圖 4(a)中，電極尖端開口夾角θ為10°；根據實驗實際條件，電極入液長度l分別為2、3和4 mm。圖 4(b)中，電極電容入液長度l為2 mm，玻璃壁厚度R為300 nm，電極尖端開口夾角θ分別為20°、30°和40°。圖 4(c)中，電極電容入液長度l為2 mm，電極尖端開口夾角θ為20°，玻璃壁厚度R分別為200、300和400 nm。
仿真結果如表 1所示，電極入液越深，Ct越大，選擇800~1 400 nm的玻璃管拉制開口夾角為20°的微電極，每入液加深1 mm，電極電容將會增加0.3 pF左右。電極開口越大，Ct越大。電極玻璃壁越厚，Ct越小，且與厚度成反比。玻璃的靜介電常數和交流介電常數都隨著溫度的升高而增大,溫度從275 K上升到2500 K時,介電常數僅變化5%左右[15]。在實驗中，由于要考慮到細胞的活性等問題，溫度一般控制在25~40 ℃，因此可忽略溫度對電極電容的影響。
表1
不同電極形狀下的電極電容值
Table1.
Electrode capacitance under different electrode shapes
3.2 電極電容補償算法的誤差分析
膜片鉗放大器的電容補償并不是通過減小電極電容的方法降低誤差，而是通過降低快電容影響的方法進行補償。時間常數τ=RCs，當玻璃微電極浸入生理溶液時，其分布電容為pF量級，而R主要取決于玻璃微電極尖端[3]。神經元細胞的電容約為1 μF/cm2[6, 12]。玻璃微電極尖端開口的半徑rt約為1 μm，小塊膜片電容大小約為0.031 4 pF。電極電阻值估算值一般為1 MΩ，由小塊細胞膜引起的τ的大小為0.031 4 μs。在膜片鉗快電容補償電路中，為了簡化計算，τ值取0.5 μs作為一個步進，Cm對τ的影響比一個步進單位小1~2個數量級，因此Cm對τ的影響較小。
4 討論
神經元具有傳遞動作電位的能力，當神經元細胞膜電壓Vm達到閥值時就會誘發神經細胞發放動作電位。根據H-H模型分析膜電位的變化對動作電位的影響[8, 11, 16-17]，仿真模型的初始條件如下：
圖5
膜電位對動作電位的影響
Figure5.
Effect of membrane potential on action potential
從上面的分析結果可知，兩個單位量級的膜電位變化就會對于動作電位的發放會產生很大的影響，在整個細胞的測量過程中由于快電容的存在，將不能正確區分快電容與膜電容，導致在計算膜電容時被過高地估計。被過高估計的膜電容引入了跨膜電流偽差信號，偽差電流越大，引入的膜電位的誤差值越大，從而影響了動作電位的發放。
從對電極電容的模型仿真結果可知，電極的入液深度對跨壁電容Ct有明顯影響，兩者成正比；同時，在拉制玻璃微電極時，拉制得越薄，引入的電極電容值越大，因此我們最好選用后壁玻璃毛坯拉制電極，或采用在玻璃電極外套粗電極的方法。漂浮電容Cs和微電極尖端的徑向分布電阻可影響τ值大小，漂浮電容Cs與入液深度成反比，通過控制實驗中電極的入液和計算徑向分布電阻的大小，能夠較為準確地選定τ值，從而減少τ值對補償精度的影響。電極電容作為快電容的重要組成部分，提高其補償精度是十分重要的，提高快電容的補償精度，可以大大提高測量的準確性。
引言
膜片鉗技術作為一種先進的電生理技術，主要應用在各種離子通道及其調控機制方面，而分布電容的存在影響了通道電流的測量精度。
快電容補償是將瞬態偽差電流注入一個電容補償電路，提供大小相等方向相反的模擬抵消電流[1]。隨著膜片鉗技術的不斷發展，Sigworth等[1-2]設計了自動快電容補償迭代算法程序，代替了手動補償。快電容自動補償算法采用折半搜索τ值和最小二乘擬合迭代收斂法。通過根據搜索到的τ值，查表得到電容的補償值。τ值范圍的確定對于補償精度和速度有較大的影響。因此，本文將詳細討論電極電容和膜電容引入的偽差信號對動作電位發放特性的影響，并針對快電容主要補償的電極電容，通過對其形狀、環境改變的分析，從而提高補償精度。
1 全細胞測量方式下的電容補償原理
膜片鉗是利用負反饋電子線路，將玻璃微電極與細胞進行高阻封接，通過控制鉗位電壓Vc，來監測細胞膜上離子通道電流的變化[1]。由于電極尖端存在雜散的電極電容Cp、細胞膜電容Cm，在施加階躍刺激電壓時，膜片鉗放大器會產生瞬態電流偽差，影響記錄到的電流的正確性，快電容補償電路如圖 1所示。
圖1
快慢電容補償原理圖
Figure1.
Schematic diagram of C-fast and C-slow compensation
將快電容充放電電流If通過注入電容Ci，使這個電流不經過I-V變換器，達到補償的目的。通過調節R1、C補償C1/Ci和τ;通過調節R2補償C2/Ci[3]，其中τ=RC1。
| ${{A}_{fc}}=\frac{{{R}_{f}}}{{{R}_{1}}}\times \frac{1}{1+{{j}_{\omega }}{{R}_{m}}C}+\frac{{{R}_{f}}}{{{R}_{2}}}$ |
時間常數τ對電流的影響是非線性的，快電容自動補償算法搜索得到的τ值，通過擬合三個參量f0、f1、f2權重，查表得到電容的補償值[4]。f0、f1、f2分別為τ值改變一個步長時、帶延遲的補償通道提供1 pF快電容補償量時和不帶延遲的補償通道提供1 pF快電容補償量時，對輸出電流的影響。
在傳統快電容補償算法中，τ值范圍對補償的精度有較大的影響，當τ值搜索錯誤，不能達到最佳補償，將會引入2~3個數量級的快電容瞬態電流誤差，100 pA的偽差電流信號就會引入0.1 mV左右的膜電位誤差，0.1 mV的膜電位會引入一個20 ms的自主動作電位的發放，且當膜電位高于1 mV時將不能發放動作電位。因此，確定最佳τ值對于后面的補償計算是非常重要的，準確判定τ值范圍，不僅能夠提高快電容的補償精度，還能加快快電容的補償速度[3, 5-6]。
2 快電容偽差信號對動作電位的影響
階躍信號作為命令電壓加在I-V變換器上時，快電容將產生充放電，會導致監測信號信號失真并影響尖峰過后的細胞膜電流信號的觀測[7]。快電容的存在會引起跨膜電流在上升和下降沿產生尖峰，并且引入膜電壓的偽差信號，從而對動作電位的發放精度產生影響[1, 8-9]。
2.1 電極電容對膜電容和跨膜電流的影響
根據慢電容的補償原理，在完成快電容瞬態偽差補償以后，當命令電壓Vc發生階躍變化時，會引起細胞膜電容Cm充(放)電引起的瞬態失真[10]。階躍響應下的膜電容信號如圖 2所示，顯示了跨膜電流在充放電時的變化情況。由慢電容補償原理可得Rs、Rm和Cm的計算公式如下[4]，
| $\begin{align} & {{R}_{s}}=\frac{{{V}_{o}}}{{{I}_{peak}}},{{R}_{m}}=\frac{{{V}_{o}}}{{{I}_{peak}}}-{{R}_{s}},{{C}_{m}}=\tau \left( \frac{1}{{{R}_{s}}}+\frac{1}{{{R}_{m}}} \right)\text{ ,} \\ & \tau ={{R}_{m}}{{C}_{m}}~ \\ \end{align}$ |
其中Ipeak、Iss分別是慢電容電流的峰值與穩態值。由式(2)可得：Ipeak=4 nA、Iss=39.6 pA、τ=110 μs、Vo=20 mV時，Rs=5 MΩ、Rm=500 MΩ、Cm=22 pF。 快電容自動補償后的偽差電流值一般下降了2~3個數量級，當10 nA的快電容偽差信號經過補償后，偽差電流信號峰值將變為100 pA，使Ipeak=4.1 nA時，得到Cm=22.77 pF，因此100 pA的快電容偽差信號引入了約為0.77 pF的膜電容誤差值。
圖2
膜電容充(放)電時的跨膜電流
Figure2.
Membrane current during membrane capacitance charging and discharging
圖 2顯示了細胞膜電容充放電時，跨膜電流的變化情況[8, 11]。在電極電容充分補償后，破膜形成全細胞記錄模式，當t=0時，刺激電壓Vc進行躍變，細胞膜電容開始充電，流經膜電阻的電流IRm=0，當充電結束后，膜電容相當于與斷路，膜電阻電流達到最大[9, 12]。
2.2 跨膜電流對膜電位的影響
| ${{I}_{m}}\left( s \right)=\frac{{{V}_{m}}\left( s \right)}{{{R}_{th}}}-\frac{{{V}_{th}}}{s{{R}_{th}}}+s{{C}_{m}}{{V}_{m}}\left( s \right)-{{C}_{m}}{{V}_{m}}({{0}^{+}})$ |
理想情況下，電流脈沖信號如圖 3(b)所示，得：
| ${{V}_{m}}\left( s \right)=K{{R}_{th}}\left| \frac{1}{s}-\frac{1}{s+\frac{1}{{{C}_{m}}{{R}_{th}}}} \right|\left( 1-{{e}^{-{{t}_{0}}s}} \right)+\frac{{{V}_{th}}}{s}$ |
當電極尖端與細胞膜形成GΩ封接時，由于電容的存在會產生尖峰電流信號，如圖 3(c)所示，這里的尖峰信號假設由沖擊函數表示，得到的跨膜電流信號為
| ${{I}_{m}}\left( t \right)=K[\xi \left( t \right)-\xi (t-{{t}_{0}})+\Delta \left( t \right)-\Delta (t-{{t}_{0}})]$ |
圖3
刺激電流對細胞膜的作用
(a)神經細胞細胞膜電路模型； (b)跨膜脈沖電流； (c)電極電容引起的跨膜偽差電流
Figure3. Effect of stimulating current on cell membrane(a) circuit mode of nerve cell membrane circuit model; (b) transmembrane current pulse； (c) transient currents caused by electrode capacitance
該仿真模型的初始條件如下： Vth=85 mV、Rth=1 kΩ、Cm=1 μF、t0=6 ms。由于快電容補償后殘余偽差信號一般在2~3個pA量級，為了研究電極電容偽差電流對膜電位的影響，暫不考慮外加刺激電流，只考慮電極電容偽差電流的影響，選擇大小為100~1 000 pA的五組值進行仿真，偽差電流越大，引入的膜電位的誤差值越大，如100 pA的偽差電流信號就會引入0.1 mV左右的膜電位誤差。
3 快電容補償方法的改進
提高快電容的補償精度，能夠有效地提高動作電位的測量精度，因此需要提高快電容偽差電流的補償精度。
3.1 影響電極電容大小的因素
在實驗過程中，電極入液等因素會影響到電極電容的大小，而這個問題一直沒有統一的定論，因此本文通過建模方法對電極電容大小進行分析。電極電容Cp包括電極浸入內液與浴液部分形成的跨壁電容Ct和電極未入液部分與地表形成的漂浮電容Cs[14]。Ct是電極電容的主要部分，在實驗中會受到微電極幾何尺寸、生理溶液類型、入液深度及濃度等不確定因素的影響。因此，本文通過COMSOL對Ct從微電極柱狀部分浸入生理溶液的長度、電極尖端開口夾角、玻璃電極厚度以及溫度這四個方面進行分析，仿真模型圖如圖 4所示。
圖4
電極電容影響因素的仿真模型
(a)電極入液長度的影響； (b)電極尖端開口角度的影響； (c)微電極玻璃壁厚度的影響
Figure4. Simulation models of effects of three factors on electrode capacitance(a) liquid electrode length; (b) opening angle of electrode tip; (c) microelectrode glass wall thickness
實驗溫度T為25 ℃，在圖 4(a)中，電極尖端開口夾角θ為10°；根據實驗實際條件，電極入液長度l分別為2、3和4 mm。圖 4(b)中，電極電容入液長度l為2 mm，玻璃壁厚度R為300 nm，電極尖端開口夾角θ分別為20°、30°和40°。圖 4(c)中，電極電容入液長度l為2 mm，電極尖端開口夾角θ為20°，玻璃壁厚度R分別為200、300和400 nm。
仿真結果如表 1所示，電極入液越深，Ct越大，選擇800~1 400 nm的玻璃管拉制開口夾角為20°的微電極，每入液加深1 mm，電極電容將會增加0.3 pF左右。電極開口越大，Ct越大。電極玻璃壁越厚，Ct越小，且與厚度成反比。玻璃的靜介電常數和交流介電常數都隨著溫度的升高而增大,溫度從275 K上升到2500 K時,介電常數僅變化5%左右[15]。在實驗中，由于要考慮到細胞的活性等問題，溫度一般控制在25~40 ℃，因此可忽略溫度對電極電容的影響。
表1
不同電極形狀下的電極電容值
Table1.
Electrode capacitance under different electrode shapes
3.2 電極電容補償算法的誤差分析
膜片鉗放大器的電容補償并不是通過減小電極電容的方法降低誤差，而是通過降低快電容影響的方法進行補償。時間常數τ=RCs，當玻璃微電極浸入生理溶液時，其分布電容為pF量級，而R主要取決于玻璃微電極尖端[3]。神經元細胞的電容約為1 μF/cm2[6, 12]。玻璃微電極尖端開口的半徑rt約為1 μm，小塊膜片電容大小約為0.031 4 pF。電極電阻值估算值一般為1 MΩ，由小塊細胞膜引起的τ的大小為0.031 4 μs。在膜片鉗快電容補償電路中，為了簡化計算，τ值取0.5 μs作為一個步進，Cm對τ的影響比一個步進單位小1~2個數量級，因此Cm對τ的影響較小。
4 討論
神經元具有傳遞動作電位的能力，當神經元細胞膜電壓Vm達到閥值時就會誘發神經細胞發放動作電位。根據H-H模型分析膜電位的變化對動作電位的影響[8, 11, 16-17]，仿真模型的初始條件如下：
圖5
膜電位對動作電位的影響
Figure5.
Effect of membrane potential on action potential
從上面的分析結果可知，兩個單位量級的膜電位變化就會對于動作電位的發放會產生很大的影響，在整個細胞的測量過程中由于快電容的存在，將不能正確區分快電容與膜電容，導致在計算膜電容時被過高地估計。被過高估計的膜電容引入了跨膜電流偽差信號，偽差電流越大，引入的膜電位的誤差值越大，從而影響了動作電位的發放。
從對電極電容的模型仿真結果可知，電極的入液深度對跨壁電容Ct有明顯影響，兩者成正比；同時，在拉制玻璃微電極時，拉制得越薄，引入的電極電容值越大，因此我們最好選用后壁玻璃毛坯拉制電極，或采用在玻璃電極外套粗電極的方法。漂浮電容Cs和微電極尖端的徑向分布電阻可影響τ值大小，漂浮電容Cs與入液深度成反比，通過控制實驗中電極的入液和計算徑向分布電阻的大小，能夠較為準確地選定τ值，從而減少τ值對補償精度的影響。電極電容作為快電容的重要組成部分，提高其補償精度是十分重要的，提高快電容的補償精度，可以大大提高測量的準確性。
