本文對自制贗復體用硅橡膠材料的體外細胞毒性進行測定與評價,為后期臨床應用提供依據。參照國標GB/T16886.5-2003,采用CCK-8法檢測新型硅橡膠對小鼠成纖維細胞L929的細胞毒性,計算細胞相對增殖率,通過倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察細胞形態。結果表明新型硅橡膠材料的細胞相對增殖率為91.65%(24 h)、87.03%(48 h)和87.30%(72 h),細胞毒性1級,存在輕微細胞毒性。電鏡觀察24、48和72 h的細胞均呈現典型的長梭形、長三角形形態,細胞生長良好。結果顯示,新型硅橡膠材料在細胞毒性方面,符合生物醫學材料要求。
引用本文： 田艾, 陳悅, 廖健, 孫旭, 藤敏華, 梁星. 新型贗復體用硅橡膠材料的體外細胞毒性評價. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(5): 1046-1049,1056. doi: 10.7507/1001-5515.20140196 復制
引言
上頜骨缺損在口腔頜面缺損中最常見、發生率最高，常用修復方法分為外科重建和贗復體修復，由于贗復體修復風險小、費用低，能快速恢復美觀和功能，臨床應用廣泛[1-3]。近年來，贗復體材料與贗復體固位技術一直是贗復體修復的研究熱點。眾多贗復體材料中，硅橡膠因有著良好生物相容性，且質地柔軟富有彈性，能進入組織倒凹區固位，成為應用最為廣泛的材料之一[4-5]。但現用硅橡膠仍存在彈性不佳、易滋生細菌和真菌、耐老化時間短、撕裂和拉伸強度低、不易顏色修飾及導熱率差等缺點[6],目前尚無完全理想的贗復體材料，只能通過改性、補強、加入添加物等改善硅橡膠的相關性能[7]。
課題組擬研制一種具有高彈性、高強度的膜樣硅橡膠材料，借助CT圖像和計算機輔助設計與制造(computer aided design/computer aided manufacturing,CAD/CAM)技術加工，充氣后，形成贗復體的中空部分，以彈性固位方式代替傳統倒凹固位方式，同時大大減輕其重量，解決常規贗復體修復的瓶頸問題。此種硅橡膠材料，由二甲基乙烯基硅氧烷及相關有機硅單體在催化劑作用下聚合而成，經測試具有較好的生物力學性能(另文報道)。合格的生物醫學材料，除了一定的力學性能外，還需良好的生物相容性。本實驗按照國際標準化組織7405 技術報告(牙科材料的生物學評價)[8]要求 ，參照國標GB/T16886.5-2003,采用CCK-8(cell counting kit-8)法檢測新型硅橡膠對小鼠成纖維細胞L929的細胞毒性，利用硅橡膠浸提液與L929細胞共培養，計算細胞相對增殖率(relative growth rate,RGR)，通過倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察細胞形態，初步評價硅橡膠對L929細胞的生長、增殖及代謝的影響。
1 材料與方法
1.1 浸提液制備
新型硅橡膠薄膜經高溫高壓蒸汽滅菌，置于無菌青霉素瓶中充分剪碎,按0.2 g/mL的比例，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養基5 mL,置于(37±1) ℃培養箱中浸提72 h。浸提期間不得攪拌浸提介質和振蕩浸提容器。浸提完畢后，過濾，無菌容器分裝，室溫保存，24 h內使用。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞來源
小鼠成纖維細胞L929細胞株，由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供。取L929細胞株復蘇，用低糖DMEM培養基(10%胎牛血清，青鏈霉素100 U/mL)置于37 ℃，5%CO2 培養箱中培養，待細胞鋪滿培養瓶底80%～90%時，0.25%胰蛋白酶消化傳代，約2～3 d傳代一次。
1.2.2 細胞接種培養
① 取對數生長期細胞，胰酶消化、計數，配制2.2×104個/mL細胞懸液，接種于96孔板，100 μL/孔。接種細胞孔分成浸提組、空白對照組、陽性對照組，每組6個平行孔，置于37 ℃，5%CO2 培養箱中培養24 h。24 h后鏡下觀察超過80%的細胞貼壁生長，移去原培養液，浸提組加浸提液100 μL，空白對照組加新鮮培養基100 μL，陽性對照組加含5%二甲基亞砜的培養基100 μL。將孔板置于37 ℃，5%CO2 培養箱中繼續培養24、48和72 h。② 取6孔板，每孔于孔底鋪經消毒的蓋玻片(18 mm×18 mm)，后取對數生長期細胞，胰酶消化、計數，配制2.2×105個/mL細胞懸液，接種于蓋玻片上，500 μL/孔，實驗分組及加液同前，37 ℃，5%CO2 培養箱中培養72 h。
1.2.3 CCK-8檢測
于24、48和72 h后各取一塊96孔板，倒置相差顯微鏡下觀察和記錄細胞形態和結構。之后每孔更換100 μL新鮮培養基，加10 μL的CCK-8溶液，輕輕振蕩培養板，使溶液充分混勻，培養箱內繼續培養2.5 h，酶聯免疫檢測儀在450 nm處測定吸光光度(optical density，OD)值。
1.2.4 掃描電鏡觀察細胞形態
72 h后取6孔板，移去原培養液，PBS輕輕漂洗兩次，3%戊二醛于4 ℃冰箱固定過夜，50%、70%、80%、90%、95%梯度酒精脫水各15 min，乙酸異戊酯浸透，臨界點干燥，表面鍍金，掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)下觀察L929細胞形態。
1.2.5 評價指標
計算細胞相對增殖率,評定細胞毒性等級和電鏡下觀察細胞形態、代謝、增殖情況。細胞相對增殖率(RGR)=(實驗組平均OD值/空白對照組平均OD值)×100% 。當 RGR≥100%，細胞毒性分級為0；75%≤RGR≤99%，細胞毒性為1；50%≤RGR≤74%，細胞毒性為2；24%≤RGR≤49%，細胞毒性為3；1%≤RGR＜24%，細胞毒性為4，RGR＜1%細胞毒性為5。醫用生物材料的細胞毒性0級或1級為合格，2級應結合細胞形態綜合分析，3~5級為不合格。
1.3 統計學處理
使用SPSS 13.0軟件，采用單因素方差分析對數據進行統計學分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。
2 實驗結果
在24 h和48 h時間點，浸提組和空白對照組細胞數量隨著時間延長顯著增加，同時間點的兩組間OD值比較，差異有統計學意義(P＜0.05)；72 h時間點，兩組OD值繼續增加，但差異無統計學意義(P＞0.05)。在24、48和72 h時間點，陽性對照組OD值先增加后減少，同時間點的浸提組與陽性對照組OD值比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。浸提組RGR分別為91.65%(24 h)、87.03%(48 h)和81.31%(72 h)，細胞毒性分級均為1級，硅橡膠材料存在輕微細胞毒性，細胞毒性檢測試驗合格。陽性對照組RGR在24 h為67.41%，細胞毒性2級；48 h為39.27%，細胞毒性3級；72 h為17.41%，細胞毒性4級，隨著時間延長5%濃度的二甲基亞砜細胞毒性逐漸增強(見表 1)。
表1
新型硅橡膠與對照組細胞毒性分級
Table1.
Results of cytotoxicity test
換液培養72 h后，倒置相差顯微鏡下觀察大部分L929細胞呈典型的長梭形或長三角形，細胞生長良好，浸提組和空白對照組細胞增殖明顯，均勻鋪滿96孔板底，兩組間無明顯差異，而陽性對照組細胞數量隨著時間延長急劇減少，形態逐漸變圓，正常細胞形態消失，直至細胞溶解呈空泡狀，如圖 1所示。掃描電鏡下觀察浸提組和空白對照組細胞較密集，形態為長梭形，伸出少量偽足，相鄰細胞間有突觸連接；而陽性對照組細胞稀少，正常形態消失，細胞團縮變圓，偽足減少變短甚至細胞裂解，與前兩組比較有顯著差異，如圖 2所示。
圖1
共培養72 h后L929細胞形態變化(100×)
Figure1.
Morphological changes of all sample L929 after co-cultured for 72 h(100×)
圖2
共培養72 h后L929細胞掃描電鏡圖片
Figure2.
SEM Images of L929 cell after co-cultured for all samples for 72 h
3 討論
位于面中份三分之一突起部位的上頜骨，是口腔頜面部缺損中最常見、發生率最高的部位[1]。上頜骨缺損后修復一直是外科醫生和修復醫生共同面對的一大難題，隨著整形外科和種植技術的快速發展，結合使用上頜骨植體植入、轉移皮瓣及鈦板植入等技術部分病例可獲得滿意的效果[9-10]，但外科手術風險大、費用高、不利于腫瘤術后放化療以及復發觀察。且術后半年內，由于肌肉牽拉、骨框架失衡、軟組織的瘢痕收縮，單次手術無法準確恢復頜面部外形[1, 9, 11]。贗復體修復風險小、費用低、能快速恢復美觀和功能，提高患者生活質量，是臨床常用的上頜骨缺損修復方法[1-3]。近年來隨著種植贗復體和贗復體固位技術的發展，患者對贗復體的滿意度越來越高[12-13]。
贗復體材料從材質上分為硬質和軟質，硬質材料有聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate,PMMA)，軟質材料有丙烯酸酯類軟塑料、聚氨酯彈性體和硅橡膠[4-5]。臨床上常用的材料有PMMA和硅橡膠。PMMA質地較硬，所制作的傳統贗復體邊緣封閉不足，引起發音不清、食物反流，且不能進入軟組織倒凹獲得有利固位，易對基牙產生扭力和不力杠桿作用，當無基牙利用時難以獲得有效固位[14]。硅橡膠質地柔軟富有彈性，可以通過彈性變形緩解沖擊性咬合力，減輕壓痛并進入有利倒凹區增加固位與支持；同時便于制作整體或分段式中空贗復體以及充氣式贗復體，達到減輕重量和方便取戴的目的[15-17]。
用于頜面贗復體的硅橡膠分為高溫、中溫和室溫硫化硅橡膠三種類型，其中中溫和室溫硫化硅橡膠最常用。典型的高溫硫化硅橡膠有DowCorning公司生產的Silastic370、373和373系列，抗拉強度為2~7 mPa，撕裂強度小于10 KN/m，拉伸延長率可達400%[18]。但其硬度較大，加工過程中充填和調色不便。加成型中溫硫化硅橡膠硬度在一定范圍內可調，且硫化后生膠轉化率高，無副產物產生。其中DowCorning公司生產的MDX4-4210，FactorⅡ公司生產的A-2186的邵氏硬度為29/30,抗拉強度4~5 MPa/5 MPa,撕裂強度9.6~10.5 KN/m/13~14 KN/m,斷裂伸長率 470%~490%/600%~650%[19]。縮合室溫硫化硅橡膠力學性能不穩定，受到橡膠基質分子量和催化劑用量的顯著影響，FactorⅡ公司生產的A-1016328硅橡膠的邵氏硬度45，抗拉強度2.0 MPa,撕裂強度19~24 KN/m,斷裂伸長率160%[19]。以上介紹的常用硅橡膠仍然存在彈性不佳、撕裂和低拉伸強度低等缺點，且易滋生細菌，色彩選擇少、易剝脫、不易清潔，尚需要通過改性、補強、加入添加物等改善相關性能[6, 13]。
醫用生物材料必須具備良好生物安全性能，國家醫用有機硅材料生物學安全性評價標準中規定體外細胞毒性試驗為必須檢測項目。CCK-8檢測就是目前較好的評價材料體外細胞毒性的方法之一，實驗有著定量、精確性好，客觀、重復度高等優點[20-21]。 CCK-8試劑被細胞線粒體中的乳酸脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜染料，所生成染料量與活細胞數量呈正比，酶聯免疫檢測儀在450 nm波長處測定其OD值，可間接反映活細胞數量。CCK-8 法的中間代謝產物為可溶性的，且不需要棄上清液，操作相對較為簡便，減少細胞損失，已被廣泛用于細胞毒性檢測。
課題組基于設計球囊式中空贗復體的設想，自主研發的新型硅橡膠材料，具有較好的生物力學性能(另文報道)。本實驗結果顯示新型硅橡膠的細胞毒性反應分級為1，存在輕微細胞毒性；且24、48和72 h細胞均觀察到典型長梭形或長三角形形態，細胞生長良好，與空白對照組比較沒有明顯差異。提示新型硅橡膠材料在細胞毒性方面，符合生物醫學材料要求。
引言
上頜骨缺損在口腔頜面缺損中最常見、發生率最高，常用修復方法分為外科重建和贗復體修復，由于贗復體修復風險小、費用低，能快速恢復美觀和功能，臨床應用廣泛[1-3]。近年來，贗復體材料與贗復體固位技術一直是贗復體修復的研究熱點。眾多贗復體材料中，硅橡膠因有著良好生物相容性，且質地柔軟富有彈性，能進入組織倒凹區固位，成為應用最為廣泛的材料之一[4-5]。但現用硅橡膠仍存在彈性不佳、易滋生細菌和真菌、耐老化時間短、撕裂和拉伸強度低、不易顏色修飾及導熱率差等缺點[6],目前尚無完全理想的贗復體材料，只能通過改性、補強、加入添加物等改善硅橡膠的相關性能[7]。
課題組擬研制一種具有高彈性、高強度的膜樣硅橡膠材料，借助CT圖像和計算機輔助設計與制造(computer aided design/computer aided manufacturing,CAD/CAM)技術加工，充氣后，形成贗復體的中空部分，以彈性固位方式代替傳統倒凹固位方式，同時大大減輕其重量，解決常規贗復體修復的瓶頸問題。此種硅橡膠材料，由二甲基乙烯基硅氧烷及相關有機硅單體在催化劑作用下聚合而成，經測試具有較好的生物力學性能(另文報道)。合格的生物醫學材料，除了一定的力學性能外，還需良好的生物相容性。本實驗按照國際標準化組織7405 技術報告(牙科材料的生物學評價)[8]要求 ，參照國標GB/T16886.5-2003,采用CCK-8(cell counting kit-8)法檢測新型硅橡膠對小鼠成纖維細胞L929的細胞毒性，利用硅橡膠浸提液與L929細胞共培養，計算細胞相對增殖率(relative growth rate,RGR)，通過倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察細胞形態，初步評價硅橡膠對L929細胞的生長、增殖及代謝的影響。
1 材料與方法
1.1 浸提液制備
新型硅橡膠薄膜經高溫高壓蒸汽滅菌，置于無菌青霉素瓶中充分剪碎,按0.2 g/mL的比例，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養基5 mL,置于(37±1) ℃培養箱中浸提72 h。浸提期間不得攪拌浸提介質和振蕩浸提容器。浸提完畢后，過濾，無菌容器分裝，室溫保存，24 h內使用。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞來源
小鼠成纖維細胞L929細胞株，由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供。取L929細胞株復蘇，用低糖DMEM培養基(10%胎牛血清，青鏈霉素100 U/mL)置于37 ℃，5%CO2 培養箱中培養，待細胞鋪滿培養瓶底80%～90%時，0.25%胰蛋白酶消化傳代，約2～3 d傳代一次。
1.2.2 細胞接種培養
① 取對數生長期細胞，胰酶消化、計數，配制2.2×104個/mL細胞懸液，接種于96孔板，100 μL/孔。接種細胞孔分成浸提組、空白對照組、陽性對照組，每組6個平行孔，置于37 ℃，5%CO2 培養箱中培養24 h。24 h后鏡下觀察超過80%的細胞貼壁生長，移去原培養液，浸提組加浸提液100 μL，空白對照組加新鮮培養基100 μL，陽性對照組加含5%二甲基亞砜的培養基100 μL。將孔板置于37 ℃，5%CO2 培養箱中繼續培養24、48和72 h。② 取6孔板，每孔于孔底鋪經消毒的蓋玻片(18 mm×18 mm)，后取對數生長期細胞，胰酶消化、計數，配制2.2×105個/mL細胞懸液，接種于蓋玻片上，500 μL/孔，實驗分組及加液同前，37 ℃，5%CO2 培養箱中培養72 h。
1.2.3 CCK-8檢測
于24、48和72 h后各取一塊96孔板，倒置相差顯微鏡下觀察和記錄細胞形態和結構。之后每孔更換100 μL新鮮培養基，加10 μL的CCK-8溶液，輕輕振蕩培養板，使溶液充分混勻，培養箱內繼續培養2.5 h，酶聯免疫檢測儀在450 nm處測定吸光光度(optical density，OD)值。
1.2.4 掃描電鏡觀察細胞形態
72 h后取6孔板，移去原培養液，PBS輕輕漂洗兩次，3%戊二醛于4 ℃冰箱固定過夜，50%、70%、80%、90%、95%梯度酒精脫水各15 min，乙酸異戊酯浸透，臨界點干燥，表面鍍金，掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)下觀察L929細胞形態。
1.2.5 評價指標
計算細胞相對增殖率,評定細胞毒性等級和電鏡下觀察細胞形態、代謝、增殖情況。細胞相對增殖率(RGR)=(實驗組平均OD值/空白對照組平均OD值)×100% 。當 RGR≥100%，細胞毒性分級為0；75%≤RGR≤99%，細胞毒性為1；50%≤RGR≤74%，細胞毒性為2；24%≤RGR≤49%，細胞毒性為3；1%≤RGR＜24%，細胞毒性為4，RGR＜1%細胞毒性為5。醫用生物材料的細胞毒性0級或1級為合格，2級應結合細胞形態綜合分析，3~5級為不合格。
1.3 統計學處理
使用SPSS 13.0軟件，采用單因素方差分析對數據進行統計學分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。
2 實驗結果
在24 h和48 h時間點，浸提組和空白對照組細胞數量隨著時間延長顯著增加，同時間點的兩組間OD值比較，差異有統計學意義(P＜0.05)；72 h時間點，兩組OD值繼續增加，但差異無統計學意義(P＞0.05)。在24、48和72 h時間點，陽性對照組OD值先增加后減少，同時間點的浸提組與陽性對照組OD值比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。浸提組RGR分別為91.65%(24 h)、87.03%(48 h)和81.31%(72 h)，細胞毒性分級均為1級，硅橡膠材料存在輕微細胞毒性，細胞毒性檢測試驗合格。陽性對照組RGR在24 h為67.41%，細胞毒性2級；48 h為39.27%，細胞毒性3級；72 h為17.41%，細胞毒性4級，隨著時間延長5%濃度的二甲基亞砜細胞毒性逐漸增強(見表 1)。
表1
新型硅橡膠與對照組細胞毒性分級
Table1.
Results of cytotoxicity test
換液培養72 h后，倒置相差顯微鏡下觀察大部分L929細胞呈典型的長梭形或長三角形，細胞生長良好，浸提組和空白對照組細胞增殖明顯，均勻鋪滿96孔板底，兩組間無明顯差異，而陽性對照組細胞數量隨著時間延長急劇減少，形態逐漸變圓，正常細胞形態消失，直至細胞溶解呈空泡狀，如圖 1所示。掃描電鏡下觀察浸提組和空白對照組細胞較密集，形態為長梭形，伸出少量偽足，相鄰細胞間有突觸連接；而陽性對照組細胞稀少，正常形態消失，細胞團縮變圓，偽足減少變短甚至細胞裂解，與前兩組比較有顯著差異，如圖 2所示。
圖1
共培養72 h后L929細胞形態變化(100×)
Figure1.
Morphological changes of all sample L929 after co-cultured for 72 h(100×)
圖2
共培養72 h后L929細胞掃描電鏡圖片
Figure2.
SEM Images of L929 cell after co-cultured for all samples for 72 h
3 討論
位于面中份三分之一突起部位的上頜骨，是口腔頜面部缺損中最常見、發生率最高的部位[1]。上頜骨缺損后修復一直是外科醫生和修復醫生共同面對的一大難題，隨著整形外科和種植技術的快速發展，結合使用上頜骨植體植入、轉移皮瓣及鈦板植入等技術部分病例可獲得滿意的效果[9-10]，但外科手術風險大、費用高、不利于腫瘤術后放化療以及復發觀察。且術后半年內，由于肌肉牽拉、骨框架失衡、軟組織的瘢痕收縮，單次手術無法準確恢復頜面部外形[1, 9, 11]。贗復體修復風險小、費用低、能快速恢復美觀和功能，提高患者生活質量，是臨床常用的上頜骨缺損修復方法[1-3]。近年來隨著種植贗復體和贗復體固位技術的發展，患者對贗復體的滿意度越來越高[12-13]。
贗復體材料從材質上分為硬質和軟質，硬質材料有聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate,PMMA)，軟質材料有丙烯酸酯類軟塑料、聚氨酯彈性體和硅橡膠[4-5]。臨床上常用的材料有PMMA和硅橡膠。PMMA質地較硬，所制作的傳統贗復體邊緣封閉不足，引起發音不清、食物反流，且不能進入軟組織倒凹獲得有利固位，易對基牙產生扭力和不力杠桿作用，當無基牙利用時難以獲得有效固位[14]。硅橡膠質地柔軟富有彈性，可以通過彈性變形緩解沖擊性咬合力，減輕壓痛并進入有利倒凹區增加固位與支持；同時便于制作整體或分段式中空贗復體以及充氣式贗復體，達到減輕重量和方便取戴的目的[15-17]。
用于頜面贗復體的硅橡膠分為高溫、中溫和室溫硫化硅橡膠三種類型，其中中溫和室溫硫化硅橡膠最常用。典型的高溫硫化硅橡膠有DowCorning公司生產的Silastic370、373和373系列，抗拉強度為2~7 mPa，撕裂強度小于10 KN/m，拉伸延長率可達400%[18]。但其硬度較大，加工過程中充填和調色不便。加成型中溫硫化硅橡膠硬度在一定范圍內可調，且硫化后生膠轉化率高，無副產物產生。其中DowCorning公司生產的MDX4-4210，FactorⅡ公司生產的A-2186的邵氏硬度為29/30,抗拉強度4~5 MPa/5 MPa,撕裂強度9.6~10.5 KN/m/13~14 KN/m,斷裂伸長率 470%~490%/600%~650%[19]。縮合室溫硫化硅橡膠力學性能不穩定，受到橡膠基質分子量和催化劑用量的顯著影響，FactorⅡ公司生產的A-1016328硅橡膠的邵氏硬度45，抗拉強度2.0 MPa,撕裂強度19~24 KN/m,斷裂伸長率160%[19]。以上介紹的常用硅橡膠仍然存在彈性不佳、撕裂和低拉伸強度低等缺點，且易滋生細菌，色彩選擇少、易剝脫、不易清潔，尚需要通過改性、補強、加入添加物等改善相關性能[6, 13]。
醫用生物材料必須具備良好生物安全性能，國家醫用有機硅材料生物學安全性評價標準中規定體外細胞毒性試驗為必須檢測項目。CCK-8檢測就是目前較好的評價材料體外細胞毒性的方法之一，實驗有著定量、精確性好，客觀、重復度高等優點[20-21]。 CCK-8試劑被細胞線粒體中的乳酸脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜染料，所生成染料量與活細胞數量呈正比，酶聯免疫檢測儀在450 nm波長處測定其OD值，可間接反映活細胞數量。CCK-8 法的中間代謝產物為可溶性的，且不需要棄上清液，操作相對較為簡便，減少細胞損失，已被廣泛用于細胞毒性檢測。
課題組基于設計球囊式中空贗復體的設想，自主研發的新型硅橡膠材料，具有較好的生物力學性能(另文報道)。本實驗結果顯示新型硅橡膠的細胞毒性反應分級為1，存在輕微細胞毒性；且24、48和72 h細胞均觀察到典型長梭形或長三角形形態，細胞生長良好，與空白對照組比較沒有明顯差異。提示新型硅橡膠材料在細胞毒性方面，符合生物醫學材料要求。
