本研究目的是評價表面礦化修飾煅燒骨/P24活性多肽復合仿生骨材料對小鼠MC3T3-E1細胞黏附、增殖和誘導成骨分化的影響。實驗分三組:A組為表面礦化修飾煅燒骨加骨形態發生蛋白-2(BMP-2)活性多肽P24修飾的復合仿生骨材料,B組為表面礦化修飾煅燒骨材料,C組為單純的煅燒骨材料。三組材料在細胞實驗前行電鏡掃描觀察。然后將小鼠MC3T3-E1細胞分別種植在三種材料表面,測定細胞的黏附率,MTT法檢測細胞體外增殖活性,同時通過堿性磷酸酶(ALP)染色和ALP活性檢測,了解小鼠MC3T3-E1細胞成骨分化情況。電鏡觀察顯示三組材料均保留了天然的孔隙結構,孔徑為200~850 μm。細胞黏附率和MTT實驗顯示,A組MC3T3-E1細胞在材料表面的黏附性能和增殖能力明顯高于B組和C組,B組則高于C組,組間差異均有統計學意義(P＜0.05)。ALP染色和ALP活性檢測顯示:A組細胞ALP活性明顯高于B組和C組,B組則高于C組,組間差異均有統計學意義(P＜0.05)。研究表明表面礦化修飾煅燒骨/P24活性多肽仿生骨材料能促進小鼠MC3T3-E1細胞在骨基質材料表面的黏附、增殖與分化,并能較好地保持細胞的形態。
引用本文： 李景峰, 鄭啟新, 郭曉東, 陳廖斌. 表面礦化修飾煅燒骨/P24活性多肽仿生骨材料對MC3T3-E1細胞黏附、增殖和向成骨方向分化的影響. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(5): 1041-1045. doi: 10.7507/1001-5515.20140195 復制
引言
煅燒骨具有良好的組織相容性和可靠的生物安全性，而且孔隙率高有利于成骨細胞的長入和分化，是一種較理想的骨生物材料[1]。然而煅燒骨表面缺乏活性基團，不利于表面載藥。目前最簡單直接的方法是利用對羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)具有高親和性的重復氨基酸序列(如天冬氨酸D、谷氨酸E等)載藥[2]。Bellis等通過谷氨酸重復序列載膠原活性多肽，緩釋時間達2個月之久[3]。本課題組[4-5]自主設計并合成了骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)活性多肽--P24，是根據天然BMP-2具有誘導成骨功能的核心功能區設計合成的含24個氨基酸的寡肽，同時，此多肽序列中設計有磷酸絲氨酸[-S(P)-]和天冬氨酸(DDD)活性位點,與表面礦化修飾煅燒骨形成較強的親和力，能夠極好地模擬天然骨基質的促發及指導礦化的功能,在局部形成偏酸的環境,促進局部的鈣磷沉積、成核和生物自組裝礦化。
本實驗通過將BMP-2活性多肽P24與表面礦化修飾煅燒骨進行復合后與小鼠MC3T3-E1細胞復合培養，評價表面礦化修飾煅燒骨/P24活性多肽復合仿生骨材料對小鼠MC3T3-E1細胞的黏附、增殖和誘導成骨分化的影響，為擴大表面礦化修飾煅燒骨和BMP-2活性多肽在骨組織工程中的應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 表面礦化修飾煅燒骨/P24活性多肽復合仿生骨基質材料的制備
表面礦化修飾煅燒骨的制備方法同前[6]：首先通過兩次高溫煅燒制備出單純煅燒骨材料，然后將煅燒骨塊浸泡在37 ℃恒溫條件下的1.5倍模擬體液(simulated body fluid,SBF)中，每天更換SBF，連續浸泡14 d。浸泡結束后,用去離子三蒸水超聲清洗煅燒骨材料并放入70 ℃烘箱烘干，消毒后備用。接著將每塊制備好的表面礦化修飾煅燒骨放入充分溶解5 mg P24活性多肽[7]的1 mL去離子水中，然后將混合物放入低溫真空干燥箱負壓吸引24 h,再將其低溫(-55 ℃)冷凍干燥48 h后，酒精蒸氣消毒備用。
1.2 電鏡觀察
實驗分為三組：A組為表面礦化修飾煅燒骨/P24活性多肽復合仿生骨材料，B組為表面礦化修飾煅燒骨材料，C組為單純的煅燒骨材料。將三組材料進行隨機取樣，噴鉑，在掃描電鏡下觀察三種煅燒骨材料表面結構以及P24活性多肽的復合情況。
1.3 小鼠MC3T3-E1的培養
小鼠胚胎成骨細胞株MC3T3-E1購買于武漢大學中國典型培養物保藏中心。將MC3T3-E1細胞株置于37 ℃、體積分數5%的CO2培養箱內常規培養。隔天換液一次，待細胞長至接近鋪滿瓶底時，用0.25%胰酶消化，1∶3傳代，按3×104/mL接種進行傳代培養。
1.4 生物學特性檢測
1.4.1 細胞與材料復合培養及黏附率檢測
三組材料分別用完全培養基浸泡1 d后,置于培養板中備用。將傳至第3代的小鼠MC3T3-E1細胞以1×105/塊的密度在負壓抽吸條件下均勻接種于三組材料中，常規培養，每組材料9塊。共培養24 h后，每組各取出三塊材料用鈣黃綠素染色觀察細胞在材料表面黏附情況。實驗方法同前[8]：吸棄孔內培養基，用PBS洗滌去除殘余脂酶活性，將鈣黃綠素工作液(濃度2 μmol/L)200 μL分別加至材料上，常規培養15 min，然后在490 nm激發波長條件下熒光顯微鏡觀察細胞形態。細胞黏附率的測定采用間接計數法計算，即材料的細胞黏附率(%)=(總細胞數－未黏附細胞數)/總細胞數×100%。
1.4.2 MTT法
三組材料分別用完全培養基浸泡1 d后,分別置于96孔板中，收集第3代MC3T3-E1細胞，調整細胞密度為1×104/mL，每孔加100 μL細胞懸液，常規培養，分別共培養1、3、5、7、10、12和15 d后通過MTT法檢測MC3T3-E1細胞增殖活性，每組5個復孔。
1.4.3 浸提液的提取
稱取三種煅燒骨樣品，酒精蒸汽消毒滅菌，按1 mg∶5 mL的比例，浸入無菌生理鹽水中，37 ℃恒溫箱中浸提3 d。
1.4.4 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色與ALP活性檢測
將三種材料浸提液分別加入24孔培養板中，每種5孔。取第3代小鼠MC3T3-E1細胞，調整細胞密度為1×105/mL，每塊材料上加0.5 mL細胞懸液，常規培養，每2 d更換培養基。培養14 d后，采用ALP染色試劑盒(南京建成生物制品有限公司)進行ALP染色。同時將MC3T3-E1細胞分別培養5、10、15及20 d，用PBS沖洗三次，然后用0.25%胰蛋白酶消化5～8 min，每孔加入培養基1 mL終止消化，4 ℃條件下10 000 r/min離心5 min，再用PBS沖洗三次，加細胞裂解液破膜。按ALP定量檢測試劑盒(南京建成生物制品有限公司)進行ALP活性檢測。最后，在520 nm波長處通過紫外分光光度計測定光密度(OD520)。
2 結果
2.1 電鏡觀察
電鏡觀察顯示三組材料均保留了天然的空隙結構，孔徑為200～850 μm。其中，A組材料可見白色絮狀或纖維狀活性多肽緊貼在礦化修飾煅燒骨孔壁表面(見圖 1)，B組材料煅燒骨表面可見一層較完整、均一的類骨磷灰石層形成。
圖1
電鏡顯示A組材料表面可見白色絮狀或纖維狀活性多肽緊貼在礦化修飾煅燒骨孔壁表面(10 000×)
Figure1.
Scanning electron microscopy image of Group A exhibited white flocculent or fibrous active peptide close to the surface of the modified sintered bone (10 000×)
2.2 細胞與材料復合后生長情況及細胞黏附率檢測
鈣黃綠素染色熒光顯微鏡下觀察：小鼠MC3T3-E1細胞與三種支架材料共培養24 h后，A組材料表面細胞黏附量最多，生長良好，呈長梭形；B組材料表面細胞黏附量較A組少，細胞呈圓形或橢圓形；C組材料表面細胞數量明顯少于A組和B組(見圖 2)。通過對三種材料細胞黏附率的測定，A、B、C三組材料細胞黏附率分別為80.33%±4.94%、74.37%±2.50%和70.52%±3.77%。A組黏附率明顯高于B組，B組黏附率高于C組，組間差異均有統計學意義(P＜0.05)。
圖2
鈣黃綠素染色顯示MC3T3-E1細胞在三種材料表面培養24 h時的黏附情況(100×)
Figure2.
Calcein staining showed the adhesion of MC3T3-E1 cells after 24 hour culturing on the surface of three materials (100×)
2.3 細胞生長曲線
MTT試驗結果顯示：在培養前10 d，三組材料中MC3T3-E1細胞的數量均逐步增加，10 d后進入細胞生長平臺期。實驗中A組細胞的數量明顯多于B組和C組，B組細胞的數量明顯多于C組，統計學分析顯示組間差異均有統計學意義(P＜0.05)(見圖 3)。
圖3
小鼠MC3T3-E1細胞在三種材料表面增殖情況
Figure3.
Proliferation of MC3T3-E1 cells on the surface of three materials
2.4 ALP染色
MC3T3-E1細胞與A組材料浸提液復合培養14 d后，細胞聚集，呈復層生長，細胞形態由圓形或類圓形逐漸變為多角形或立方形，細胞外基質分泌明顯增多，ALP染色可見細胞胞質中出現紅棕色、棕褐色或咖啡色顆粒，是為ALP陽性細胞(見圖 4)。
圖4
A組MC3T3-E1細胞的ALP染色情況
Figure4.
Alkaline phosphatase staining of MC3T3-E1 cells in group A
2.5 ALP活性檢測
ALP活性檢測結果顯示，MC3T3-E1細胞與三種材料浸提液復合培養期間，三組MC3T3-E1細胞的ALP活性均持續增高。其中，A組MC3T3-E1細胞的ALP活性明顯高于B組和C組，而B組ALP活性高于C組，統計學分析顯示組間差異均有統計學意義(P＜0.05)。具體結果如表 1所示。
表1
三組MC3T3-E1細胞的ALP活性檢測結果(U/L，n=5)
Table1.
ALP activities of MC3T3-E1 cells in three groups (U/L,n=5)
3 討論
小鼠MC3T3-E1細胞是目前公認的組織工程學中的種子細胞，已被廣泛應用于體外成骨實驗中[9]。煅燒骨支架材料是一種具有天然孔隙結構的骨生物支架材料，通過煅燒已完全去除有機物，因而沒有免疫原性，不會引起排斥反應和炎性反應。但是，因其表面缺乏骨誘導活性因子，阻礙了煅燒骨作為支架材料在組織工程中的應用。基于此，我們對煅燒骨支架材料進行表面改性，包括表面礦化沉積修飾和BMP-2活性肽復合修飾。通過體外實驗證實表面礦化修飾煅燒骨/P24活性多肽仿生骨材料具有良好的細胞相容性，能夠促進小鼠MC3T3-E1細胞在其表面黏附、增殖和向成骨細胞分化。
天然骨具有良好骨誘導活性和精巧的分級結構。一方面，天然骨基質攜帶BMP等多種誘導信號，即具有獨特的“骨誘導活性”。另一方面，天然骨也可看作是具有精巧分級結構的有機/無機納米復合材料。有機成分主要為膠原，無機成分主要是納米晶羥基磷灰石(nano-HA,n-HA)。天然骨基質的形成實際上是一個典型的有機基質介導的生物礦化過程，n-HA是以由原膠原分子自組裝而成的膠原纖維為模板，成核生長而成。其中促發并指導礦化的功能位點是一類富含磷酸絲氨酸[-S(P)-]或天冬氨酸(D)的磷蛋白，它們對HA具有很高的親和力，控制著HA晶體形核的位點、結構和分子取向。煅燒骨通過1.5倍SBF浸泡14 d后，在其表面形成了一層較完整、均一類骨磷灰石層，這與人體骨的成分和結構相似。表面礦化修飾煅燒骨保留了天然骨原有的孔隙率(＞100 μm)及力學性能，有利于成骨細胞在材料表面黏附、增殖、分化，同時表面礦化修飾提高了煅燒骨材料的生物相容性與骨結合能力，有利于骨缺損修復。
BMP-2活性多肽P24通過肽鍵和重復的天冬氨酸序列(DDD)與表面礦化修飾煅燒骨直接復合形成較強的親和力，不需要有機試劑的參入，可以有效地保護P24的活性，并通過肽鍵的裂解實現緩慢控制釋放。相關文獻報道其緩釋過程可達2月之久[3]。而目前用微球或硅烷化處理HA或磷酸三鈣(tricalcium phosphate,TCP)表面均需較復雜的有機試劑，載藥量亦不大，對HA或TCP表面的理化性能和骨傳導活性也有一定影響。因此，在實驗中我們選擇直接將P24活性多肽與表面礦化修飾煅燒骨進行復合。
本實驗中，通過對小鼠MC3T3-E1細胞與三種材料共培養發現，MC3T3-E1細胞在表面礦化修飾煅燒骨/P24活性多肽材料表面貼壁生長，細胞數目明顯多于表面礦化修飾煅燒骨和單純煅燒骨材料表面。細胞黏附率檢測表明，表面礦化修飾煅燒骨/BMP-2活性多肽材料表面細胞黏附率為80.33%±4.94%，明顯高于表面礦化修飾煅燒骨組(74.37%±2.50%)和單純煅燒骨組(70.52%±3.77%)(P＜0.05)。MTT測定是檢測細胞存活與生長的方法，可以間接反映活細胞的數量和增殖情況。結果顯示，在培養前10 d，三組材料中MC3T3-E1細胞的數量均逐步增加，10 d后進入細胞生長平臺期，其中A組細胞的數量明顯多于B組和C組，B組細胞的數量明顯多于C組。這一結果表明表面礦化修飾煅燒骨/BMP-2活性肽材料生物相容性好，細胞黏附力強。
MC3T3-E1細胞向成骨細胞分化的情況可以通過檢測成骨細胞的功能標志物如ALP來鑒定。本實驗中成骨細胞功能檢測表明，表面礦化修飾煅燒骨/P24活性多肽材料誘導的MC3T3-E1細胞ALP活性明顯高于表面礦化修飾煅燒骨材料組和單純煅燒骨材料組。在ALP染色和ALP定量檢測實驗中，表面礦化修飾煅燒骨/P24活性多肽材料組出現ALP陽性表現的時間最早。
本研究結果顯示，表面礦化修飾煅燒骨能促進小鼠MC3T3-E1細胞在骨基質材料表面的黏附、增殖與分化，并能較好地保持細胞的形態。表面礦化修飾煅燒骨是P24活性多肽較理想的一種載體材料。如果能成功應用于臨床，將為廣大骨病患者帶來福音。
引言
煅燒骨具有良好的組織相容性和可靠的生物安全性，而且孔隙率高有利于成骨細胞的長入和分化，是一種較理想的骨生物材料[1]。然而煅燒骨表面缺乏活性基團，不利于表面載藥。目前最簡單直接的方法是利用對羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)具有高親和性的重復氨基酸序列(如天冬氨酸D、谷氨酸E等)載藥[2]。Bellis等通過谷氨酸重復序列載膠原活性多肽，緩釋時間達2個月之久[3]。本課題組[4-5]自主設計并合成了骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)活性多肽--P24，是根據天然BMP-2具有誘導成骨功能的核心功能區設計合成的含24個氨基酸的寡肽，同時，此多肽序列中設計有磷酸絲氨酸[-S(P)-]和天冬氨酸(DDD)活性位點,與表面礦化修飾煅燒骨形成較強的親和力，能夠極好地模擬天然骨基質的促發及指導礦化的功能,在局部形成偏酸的環境,促進局部的鈣磷沉積、成核和生物自組裝礦化。
本實驗通過將BMP-2活性多肽P24與表面礦化修飾煅燒骨進行復合后與小鼠MC3T3-E1細胞復合培養，評價表面礦化修飾煅燒骨/P24活性多肽復合仿生骨材料對小鼠MC3T3-E1細胞的黏附、增殖和誘導成骨分化的影響，為擴大表面礦化修飾煅燒骨和BMP-2活性多肽在骨組織工程中的應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 表面礦化修飾煅燒骨/P24活性多肽復合仿生骨基質材料的制備
表面礦化修飾煅燒骨的制備方法同前[6]：首先通過兩次高溫煅燒制備出單純煅燒骨材料，然后將煅燒骨塊浸泡在37 ℃恒溫條件下的1.5倍模擬體液(simulated body fluid,SBF)中，每天更換SBF，連續浸泡14 d。浸泡結束后,用去離子三蒸水超聲清洗煅燒骨材料并放入70 ℃烘箱烘干，消毒后備用。接著將每塊制備好的表面礦化修飾煅燒骨放入充分溶解5 mg P24活性多肽[7]的1 mL去離子水中，然后將混合物放入低溫真空干燥箱負壓吸引24 h,再將其低溫(-55 ℃)冷凍干燥48 h后，酒精蒸氣消毒備用。
1.2 電鏡觀察
實驗分為三組：A組為表面礦化修飾煅燒骨/P24活性多肽復合仿生骨材料，B組為表面礦化修飾煅燒骨材料，C組為單純的煅燒骨材料。將三組材料進行隨機取樣，噴鉑，在掃描電鏡下觀察三種煅燒骨材料表面結構以及P24活性多肽的復合情況。
1.3 小鼠MC3T3-E1的培養
小鼠胚胎成骨細胞株MC3T3-E1購買于武漢大學中國典型培養物保藏中心。將MC3T3-E1細胞株置于37 ℃、體積分數5%的CO2培養箱內常規培養。隔天換液一次，待細胞長至接近鋪滿瓶底時，用0.25%胰酶消化，1∶3傳代，按3×104/mL接種進行傳代培養。
1.4 生物學特性檢測
1.4.1 細胞與材料復合培養及黏附率檢測
三組材料分別用完全培養基浸泡1 d后,置于培養板中備用。將傳至第3代的小鼠MC3T3-E1細胞以1×105/塊的密度在負壓抽吸條件下均勻接種于三組材料中，常規培養，每組材料9塊。共培養24 h后，每組各取出三塊材料用鈣黃綠素染色觀察細胞在材料表面黏附情況。實驗方法同前[8]：吸棄孔內培養基，用PBS洗滌去除殘余脂酶活性，將鈣黃綠素工作液(濃度2 μmol/L)200 μL分別加至材料上，常規培養15 min，然后在490 nm激發波長條件下熒光顯微鏡觀察細胞形態。細胞黏附率的測定采用間接計數法計算，即材料的細胞黏附率(%)=(總細胞數－未黏附細胞數)/總細胞數×100%。
1.4.2 MTT法
三組材料分別用完全培養基浸泡1 d后,分別置于96孔板中，收集第3代MC3T3-E1細胞，調整細胞密度為1×104/mL，每孔加100 μL細胞懸液，常規培養，分別共培養1、3、5、7、10、12和15 d后通過MTT法檢測MC3T3-E1細胞增殖活性，每組5個復孔。
1.4.3 浸提液的提取
稱取三種煅燒骨樣品，酒精蒸汽消毒滅菌，按1 mg∶5 mL的比例，浸入無菌生理鹽水中，37 ℃恒溫箱中浸提3 d。
1.4.4 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色與ALP活性檢測
將三種材料浸提液分別加入24孔培養板中，每種5孔。取第3代小鼠MC3T3-E1細胞，調整細胞密度為1×105/mL，每塊材料上加0.5 mL細胞懸液，常規培養，每2 d更換培養基。培養14 d后，采用ALP染色試劑盒(南京建成生物制品有限公司)進行ALP染色。同時將MC3T3-E1細胞分別培養5、10、15及20 d，用PBS沖洗三次，然后用0.25%胰蛋白酶消化5～8 min，每孔加入培養基1 mL終止消化，4 ℃條件下10 000 r/min離心5 min，再用PBS沖洗三次，加細胞裂解液破膜。按ALP定量檢測試劑盒(南京建成生物制品有限公司)進行ALP活性檢測。最后，在520 nm波長處通過紫外分光光度計測定光密度(OD520)。
2 結果
2.1 電鏡觀察
電鏡觀察顯示三組材料均保留了天然的空隙結構，孔徑為200～850 μm。其中，A組材料可見白色絮狀或纖維狀活性多肽緊貼在礦化修飾煅燒骨孔壁表面(見圖 1)，B組材料煅燒骨表面可見一層較完整、均一的類骨磷灰石層形成。
圖1
電鏡顯示A組材料表面可見白色絮狀或纖維狀活性多肽緊貼在礦化修飾煅燒骨孔壁表面(10 000×)
Figure1.
Scanning electron microscopy image of Group A exhibited white flocculent or fibrous active peptide close to the surface of the modified sintered bone (10 000×)
2.2 細胞與材料復合后生長情況及細胞黏附率檢測
鈣黃綠素染色熒光顯微鏡下觀察：小鼠MC3T3-E1細胞與三種支架材料共培養24 h后，A組材料表面細胞黏附量最多，生長良好，呈長梭形；B組材料表面細胞黏附量較A組少，細胞呈圓形或橢圓形；C組材料表面細胞數量明顯少于A組和B組(見圖 2)。通過對三種材料細胞黏附率的測定，A、B、C三組材料細胞黏附率分別為80.33%±4.94%、74.37%±2.50%和70.52%±3.77%。A組黏附率明顯高于B組，B組黏附率高于C組，組間差異均有統計學意義(P＜0.05)。
圖2
鈣黃綠素染色顯示MC3T3-E1細胞在三種材料表面培養24 h時的黏附情況(100×)
Figure2.
Calcein staining showed the adhesion of MC3T3-E1 cells after 24 hour culturing on the surface of three materials (100×)
2.3 細胞生長曲線
MTT試驗結果顯示：在培養前10 d，三組材料中MC3T3-E1細胞的數量均逐步增加，10 d后進入細胞生長平臺期。實驗中A組細胞的數量明顯多于B組和C組，B組細胞的數量明顯多于C組，統計學分析顯示組間差異均有統計學意義(P＜0.05)(見圖 3)。
圖3
小鼠MC3T3-E1細胞在三種材料表面增殖情況
Figure3.
Proliferation of MC3T3-E1 cells on the surface of three materials
2.4 ALP染色
MC3T3-E1細胞與A組材料浸提液復合培養14 d后，細胞聚集，呈復層生長，細胞形態由圓形或類圓形逐漸變為多角形或立方形，細胞外基質分泌明顯增多，ALP染色可見細胞胞質中出現紅棕色、棕褐色或咖啡色顆粒，是為ALP陽性細胞(見圖 4)。
圖4
A組MC3T3-E1細胞的ALP染色情況
Figure4.
Alkaline phosphatase staining of MC3T3-E1 cells in group A
2.5 ALP活性檢測
ALP活性檢測結果顯示，MC3T3-E1細胞與三種材料浸提液復合培養期間，三組MC3T3-E1細胞的ALP活性均持續增高。其中，A組MC3T3-E1細胞的ALP活性明顯高于B組和C組，而B組ALP活性高于C組，統計學分析顯示組間差異均有統計學意義(P＜0.05)。具體結果如表 1所示。
表1
三組MC3T3-E1細胞的ALP活性檢測結果(U/L，n=5)
Table1.
ALP activities of MC3T3-E1 cells in three groups (U/L,n=5)
3 討論
小鼠MC3T3-E1細胞是目前公認的組織工程學中的種子細胞，已被廣泛應用于體外成骨實驗中[9]。煅燒骨支架材料是一種具有天然孔隙結構的骨生物支架材料，通過煅燒已完全去除有機物，因而沒有免疫原性，不會引起排斥反應和炎性反應。但是，因其表面缺乏骨誘導活性因子，阻礙了煅燒骨作為支架材料在組織工程中的應用。基于此，我們對煅燒骨支架材料進行表面改性，包括表面礦化沉積修飾和BMP-2活性肽復合修飾。通過體外實驗證實表面礦化修飾煅燒骨/P24活性多肽仿生骨材料具有良好的細胞相容性，能夠促進小鼠MC3T3-E1細胞在其表面黏附、增殖和向成骨細胞分化。
天然骨具有良好骨誘導活性和精巧的分級結構。一方面，天然骨基質攜帶BMP等多種誘導信號，即具有獨特的“骨誘導活性”。另一方面，天然骨也可看作是具有精巧分級結構的有機/無機納米復合材料。有機成分主要為膠原，無機成分主要是納米晶羥基磷灰石(nano-HA,n-HA)。天然骨基質的形成實際上是一個典型的有機基質介導的生物礦化過程，n-HA是以由原膠原分子自組裝而成的膠原纖維為模板，成核生長而成。其中促發并指導礦化的功能位點是一類富含磷酸絲氨酸[-S(P)-]或天冬氨酸(D)的磷蛋白，它們對HA具有很高的親和力，控制著HA晶體形核的位點、結構和分子取向。煅燒骨通過1.5倍SBF浸泡14 d后，在其表面形成了一層較完整、均一類骨磷灰石層，這與人體骨的成分和結構相似。表面礦化修飾煅燒骨保留了天然骨原有的孔隙率(＞100 μm)及力學性能，有利于成骨細胞在材料表面黏附、增殖、分化，同時表面礦化修飾提高了煅燒骨材料的生物相容性與骨結合能力，有利于骨缺損修復。
BMP-2活性多肽P24通過肽鍵和重復的天冬氨酸序列(DDD)與表面礦化修飾煅燒骨直接復合形成較強的親和力，不需要有機試劑的參入，可以有效地保護P24的活性，并通過肽鍵的裂解實現緩慢控制釋放。相關文獻報道其緩釋過程可達2月之久[3]。而目前用微球或硅烷化處理HA或磷酸三鈣(tricalcium phosphate,TCP)表面均需較復雜的有機試劑，載藥量亦不大，對HA或TCP表面的理化性能和骨傳導活性也有一定影響。因此，在實驗中我們選擇直接將P24活性多肽與表面礦化修飾煅燒骨進行復合。
本實驗中，通過對小鼠MC3T3-E1細胞與三種材料共培養發現，MC3T3-E1細胞在表面礦化修飾煅燒骨/P24活性多肽材料表面貼壁生長，細胞數目明顯多于表面礦化修飾煅燒骨和單純煅燒骨材料表面。細胞黏附率檢測表明，表面礦化修飾煅燒骨/BMP-2活性多肽材料表面細胞黏附率為80.33%±4.94%，明顯高于表面礦化修飾煅燒骨組(74.37%±2.50%)和單純煅燒骨組(70.52%±3.77%)(P＜0.05)。MTT測定是檢測細胞存活與生長的方法，可以間接反映活細胞的數量和增殖情況。結果顯示，在培養前10 d，三組材料中MC3T3-E1細胞的數量均逐步增加，10 d后進入細胞生長平臺期，其中A組細胞的數量明顯多于B組和C組，B組細胞的數量明顯多于C組。這一結果表明表面礦化修飾煅燒骨/BMP-2活性肽材料生物相容性好，細胞黏附力強。
MC3T3-E1細胞向成骨細胞分化的情況可以通過檢測成骨細胞的功能標志物如ALP來鑒定。本實驗中成骨細胞功能檢測表明，表面礦化修飾煅燒骨/P24活性多肽材料誘導的MC3T3-E1細胞ALP活性明顯高于表面礦化修飾煅燒骨材料組和單純煅燒骨材料組。在ALP染色和ALP定量檢測實驗中，表面礦化修飾煅燒骨/P24活性多肽材料組出現ALP陽性表現的時間最早。
本研究結果顯示，表面礦化修飾煅燒骨能促進小鼠MC3T3-E1細胞在骨基質材料表面的黏附、增殖與分化，并能較好地保持細胞的形態。表面礦化修飾煅燒骨是P24活性多肽較理想的一種載體材料。如果能成功應用于臨床，將為廣大骨病患者帶來福音。
