間充質干細胞(MSCs)是來源于中胚層的一類具有自我更新、增殖和多向分化潛能的非造血干細胞,具有取材方便、低免疫原性和遺傳性穩定等優點,已成為近幾年治療心肌梗死的主要種子細胞。本文主要概述MSCs的生物學及免疫學特性,介紹MSCs及經肝細胞生長因子(HGF)修飾后的MSCs治療缺血性心臟病的安全性及有效性,并闡述其改善心功能的可能機制及目前存在的問題。
引用本文： 陳薈竹, 郭應坤, 寧剛. 間充質干細胞移植治療心肌梗死的研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(4): 939-944. doi: 10.7507/1001-5515.20140177 復制
引言
急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是冠心病患者死亡的主要原因之一，據報告2007年占美國死亡率的1/9[1]。心肌梗死后，由于成熟心肌細胞的增殖、分裂能力有限，所以心肌細胞數量減少，殘存心肌細胞代償性肥大，心室重構，心功能下降，最終導致心功能不全及心力衰竭。目前內科藥物、介入及外科冠狀動脈旁路移植術為AMI的主要治療方法，但這些方法僅能改善癥狀，使閉塞血管再通，減慢充血性心力衰竭的進展，而不能修復已死亡或瀕臨死亡的心肌。隨著組織醫學工程的發展，干細胞移植治療心肌梗死已經成為心血管研究的熱點問題。其中，間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)由于取材方便，同時具有較高的增殖、分化潛能，低免疫原性和遺傳性穩定等優點，已成為近幾年治療心肌梗死的主要種子細胞。本文將概述間充質干細胞的生物學及免疫學特性，介紹MSCs治療缺血性心臟病的安全性及有效性，并闡述其改善心功能的可能機制及目前存在的問題。
1 MSCs的分布及生物學特性
MSCs是來源于中胚層的一類具有自我更新、增殖和多向分化潛能的非造血干細胞[2]。在人和動物體內，MSCs主要分布于骨髓(0.001%～0.01%)，也可從脂肪、肌肉、骨膜、胎盤和臍血中獲得。MSCs易于貼壁生長，在體外具有很強的增殖能力，可以大量擴增和長期培養，并且能長時間保持其分化狀態。MSCs還具有多向分化潛能，在特定的微環境和適宜的細胞因子作用下，能夠向不同譜系的細胞分化，如心肌細胞、成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等[3]。因而，MSCs具有來源廣泛、取材方便、易于體外擴增等特點及多向分化的潛能。
2 MSCs免疫學特性及免疫抑制機制
MSCs具有低免疫原性，主要原因在于不表達MHC Ⅱ類分子、FasL及共刺激分子(B721和B722)，低水平表達MHC Ⅰ類分子，因而可以逃避CD4+和CD8+T細胞的識別[4]；此外MSCs可抑制IL-2介導的NK細胞活化，從而達到免疫耐受，避免遲發型移植物宿主反應[5]。研究顯示骨髓MSCs可以抑制淋巴細胞增殖、樹突細胞成熟和同種異體免疫排斥[6]。雖然大量實驗證明MSCs具有低免疫原性及免疫調節功能，但也有實驗報道MSCs的免疫狀態會發生從免疫調制狀態到免疫刺激狀態的改變。Badillo等[7]發現小鼠體內實驗中，骨髓來源MSCs被機體的免疫系統識別后，誘發細胞和體液免疫反應的發生。因此，盡管MSCs具有低免疫原性特點，但在同種異體移植過程中，免疫排斥反應是可能發生的。在動物及臨床試驗中，應考慮采取適當方法降低免疫排斥反應的程度，從而達到預期效果。
3 MSCs治療心肌梗死的研究進展
目前，干細胞治療已經被認為是治療心肌梗死最有前途的方法。在心梗模型動物體內進行MSCs移植后，大多會引起梗死面積縮小，左室射血分數提高，血管密度增加和心肌灌注量增加(見表 1)。而且MSCs已被應用于Ⅰ期和Ⅱ期臨床實驗治療心血管疾病。在Ⅰ期隨機、雙盲、安慰劑對照的劑量增大的臨床試驗中，向心肌梗死患者輸入同種異體MSCs后，短時間內顯示MSCs移植治療能夠降低心律失常，提高肺功能、左室功能和心臟整體功能[8]。雖然也有小樣本實驗通過對心梗患者進行分組對照研究表明，骨髓干細胞并不能提高左室射血分數和減小梗死面積，但這只屬于個案報道[9]。總的來說，MSCs移植在治療心肌梗死方面是有作用的，具有較好的前景，能獲得良好的收益。
除單獨應用MSCs治療外，心肌再生領域中還涌現了不少新技術，如基因轉染修飾、細胞因子或藥物預處理等，這些方法與MSCs移植聯合應用也取得了一定效果(見表 1)。細胞因子或藥物預處理是將MSCs與其共同培養后，再將MSCs注射到動物體內，或是在細胞移植前和移植后，對實驗動物注射相應的藥物，這種方法可以提高MSCs的分化效率、旁分泌功能、歸巢能力或移植細胞存活率等；基因轉染修飾是以病毒為載體，將特定基因轉染到MSCs中，使轉染的細胞表達特定細胞因子。基因轉染修飾干細胞是近年來干細胞移植治療心肌梗死研究的新方向，現以肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)為例，簡述基因轉染修飾MSCs治療心肌梗死的進展及相關機制。
HGF是一種多功能細胞因子，具有多種生物學活性，它能誘導有絲分裂、血管生成、組織再生，并有抗凋亡、抗纖維化等作用[10]。Jin等[11]在心肌梗死大鼠模型中研究HGF基因治療的長期療效時發現，單純HGF基因治療可以誘導生成不成熟和不規則的微血管。Lu等[12]分別將MSCs、轉染了血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的MSCs和轉染了HGF的MSCs經冠脈植入心肌梗死豬模型中，發現MSCs組、MSCs/VEGF組和MSCs/HGF組的左室心功能及血流灌注較生理鹽水組有顯著提高，而MSCs/HGF組比MSCs/VEGF組的效果更好，這與HGF具有較好的抗纖維化能力有關。因此HGF感染MSCs聯合移植抑制缺血心肌纖維化，理論上可能基于如下機制：① HGF抑制心肌纖維化，促進血管生成，減少心肌細胞凋亡[13]；② 局部高分泌的HGF可能對MSCs有趨化作用，使MSCs聚集在損傷組織局部，利于MSCs向損傷組織細胞(即心肌細胞)分化[14]；③ HGF借助MSCs為載體感染后移植到心肌缺血區，既可降低因脂質體與機體直接接觸所致的潛在毒性，又可使HGF在較長時間內維持一定水平的表達，從而提高移植效率[15]。因此這種經基因轉染修飾后的MSCs移植治療心肌梗死是將現有干細胞治療方法與基因工程、組織工程結合，具有增強原有治療效果的優勢，甚至開辟了新的治療途徑。
4 MSCs移植治療心肌梗死的機制
大量動物實驗及臨床研究證明MSCs移植可以改善心肌梗死后的心臟功能，但其機制仍不十分清楚，結合傳統的理論及近期大量的研究歸納，可能與以下4個因素有關：① MSCs可以分化為具有收縮功能的心肌細胞和血管內皮細胞，表達心肌特異性收縮蛋白，并形成間隙連接蛋白-43，與鄰近宿主心肌細胞相連，參與宿主心肌的同步收縮[5]；② MSCs可通過自分泌或旁分泌作用釋放生長因子，如VEGF，進一步促進心肌血管循環的重建，提高心肌的再灌注能力[4, 16]；③ 通過細胞與細胞間的相互作用誘導內源性c-kit+心肌細胞的增殖，也可通過激活或促進其他細胞向心臟歸巢、再生為心肌細胞而發揮作用[5]；④ 抗炎作用：研究發現MSCs移植到心臟后，能夠抑制NF-ΚB，減少TNF-α和IL-6的蛋白產生，并且提高抗炎性細胞活類素IL-10的表達，抑制I型及Ⅲ型膠原沉積，減少瘢痕的形成[4, 16]。因此，在眾多的機制中究竟哪個因素起主要作用，還是共同參與的結果，以及在不同實驗條件下是否有明顯差異，還需要進一步研究。
5 尚存的問題
雖然早期的動物實驗及典型的人體試驗結果是令人鼓舞的，但大量的隨機研究實驗的結果仍然不太令人滿意且存在爭議，一些研究者甚至提出干細胞移植在治療心肌梗死方面沒有效果[17]。因此目前MSCs移植治療心肌梗死的研究存在以下三個問題：
5.1 移植時機選擇
心肌梗死后細胞移植的最佳時間仍不清楚(見表 1)，有研究者認為急性心肌梗死后1周是細胞移植的最佳時機[18]。但另有研究認為，1周內梗死心肌局部炎癥反應最明顯，2周和4周移植的大鼠存在心肌細胞再生，而2周移植大鼠心功能改善更為明顯[19]。由于再灌注時間、再灌注方式、梗死面積、基礎心功能、干細胞數量和生物特性等都會對移植時間產生影響，所以現有的臨床試驗和動物實驗尚不能確定具體的移植時間窗，因此我們還需要大規模、隨機臨床試驗研究其影響因素及發生機制。
5.2 移植細胞數量及存活率
移植細胞的數量及移植細胞在心梗邊緣區的存活率是治療心梗效果的關鍵因素之一，文獻[20]報道不同劑量的骨髓間充質干細胞移植治療梗死心肌與改善缺血心臟功能之間存在量效關系。然而在一些移植不同劑量MSCs的實驗中(見表 1)，實驗對象卻獲得了相等的受益。由此推測移植細胞數量可能不是治療心梗效果好壞的關鍵，而移植細胞的存活率才是主要因素，因此進一步的相關研究仍需繼續進行。
表1
2010~2013年有關MSCs移植治療心肌梗死總結表
Table1.
The summary of the MSCs transplantation for myocardial infarction between 2010 and 2013
5.3 移植途徑
細胞移植的途徑有很多(見表 1)，目前主要的移植方法有心肌內直接注射、經皮穿刺導管介入心內膜注射、靜脈注射和經冠狀動脈注射4種。這4種移植方法各有優缺點：① 心肌內直接注射法[21]：在直視心臟的情況下，直接將細胞注射到功能細胞缺失的心外膜下區域，這種方式需開胸手術，技術難度及創傷較大，但定位準確；② 經皮穿刺導管介入心內膜注射[5]：該法可均勻地將干細胞移植到心肌缺血區域和周邊區域心內膜下，屬于微創操作，但是技術難度大，易致心律失常；③ 冠狀動脈內移植法[21]：將細胞治療和介入技術相結合，手術創傷小，操作簡單，有一定的應用前景，但這種植入方法有造成梗死的危險。④ 靜脈注射[21]：是最簡單的方法，具有損傷小，操作簡單，易于為患者接受等特點，但這種方法在很大程度上依賴于干細胞的歸巢，經靜脈移植的骨髓間充質干細胞很可能被其他器官阻留，只有很少的一部分移植細胞能到達心肌梗死區。此外，還有貼膜[27]以及采用多糖制成的多孔支架[22]等方式作為細胞移植途徑。雖然目前這些移植途徑均能不同程度的將干細胞移植到靶區，但在實際操作中仍存在許多問題，哪種途徑移植干細胞效果最佳，仍待進一步研究。
6 展望
目前臨床上使用間充質干細胞治療缺血性心臟病尚處在初級階段，還有許多問題需要解決。缺血性心臟病細胞療法中干細胞來源、細胞數以及注射方式等尚未有標準方案，我們需要更多的循證醫學證據的支持，以及更全面、安全、人性的治療才能達到最終目的。總之，干細胞移植治療心血管疾病的研究已經取得了舉世矚目的進展，隨著生物技術的飛速發展，干細胞移植將被賦予更活躍的生命力，相信隨著基礎理論和更大規模臨床研究的深入，這一新興治療手段必定會成為心臟疾病綜合治療手段中不可或缺的部分。
引言
急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是冠心病患者死亡的主要原因之一，據報告2007年占美國死亡率的1/9[1]。心肌梗死后，由于成熟心肌細胞的增殖、分裂能力有限，所以心肌細胞數量減少，殘存心肌細胞代償性肥大，心室重構，心功能下降，最終導致心功能不全及心力衰竭。目前內科藥物、介入及外科冠狀動脈旁路移植術為AMI的主要治療方法，但這些方法僅能改善癥狀，使閉塞血管再通，減慢充血性心力衰竭的進展，而不能修復已死亡或瀕臨死亡的心肌。隨著組織醫學工程的發展，干細胞移植治療心肌梗死已經成為心血管研究的熱點問題。其中，間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)由于取材方便，同時具有較高的增殖、分化潛能，低免疫原性和遺傳性穩定等優點，已成為近幾年治療心肌梗死的主要種子細胞。本文將概述間充質干細胞的生物學及免疫學特性，介紹MSCs治療缺血性心臟病的安全性及有效性，并闡述其改善心功能的可能機制及目前存在的問題。
1 MSCs的分布及生物學特性
MSCs是來源于中胚層的一類具有自我更新、增殖和多向分化潛能的非造血干細胞[2]。在人和動物體內，MSCs主要分布于骨髓(0.001%～0.01%)，也可從脂肪、肌肉、骨膜、胎盤和臍血中獲得。MSCs易于貼壁生長，在體外具有很強的增殖能力，可以大量擴增和長期培養，并且能長時間保持其分化狀態。MSCs還具有多向分化潛能，在特定的微環境和適宜的細胞因子作用下，能夠向不同譜系的細胞分化，如心肌細胞、成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等[3]。因而，MSCs具有來源廣泛、取材方便、易于體外擴增等特點及多向分化的潛能。
2 MSCs免疫學特性及免疫抑制機制
MSCs具有低免疫原性，主要原因在于不表達MHC Ⅱ類分子、FasL及共刺激分子(B721和B722)，低水平表達MHC Ⅰ類分子，因而可以逃避CD4+和CD8+T細胞的識別[4]；此外MSCs可抑制IL-2介導的NK細胞活化，從而達到免疫耐受，避免遲發型移植物宿主反應[5]。研究顯示骨髓MSCs可以抑制淋巴細胞增殖、樹突細胞成熟和同種異體免疫排斥[6]。雖然大量實驗證明MSCs具有低免疫原性及免疫調節功能，但也有實驗報道MSCs的免疫狀態會發生從免疫調制狀態到免疫刺激狀態的改變。Badillo等[7]發現小鼠體內實驗中，骨髓來源MSCs被機體的免疫系統識別后，誘發細胞和體液免疫反應的發生。因此，盡管MSCs具有低免疫原性特點，但在同種異體移植過程中，免疫排斥反應是可能發生的。在動物及臨床試驗中，應考慮采取適當方法降低免疫排斥反應的程度，從而達到預期效果。
3 MSCs治療心肌梗死的研究進展
目前，干細胞治療已經被認為是治療心肌梗死最有前途的方法。在心梗模型動物體內進行MSCs移植后，大多會引起梗死面積縮小，左室射血分數提高，血管密度增加和心肌灌注量增加(見表 1)。而且MSCs已被應用于Ⅰ期和Ⅱ期臨床實驗治療心血管疾病。在Ⅰ期隨機、雙盲、安慰劑對照的劑量增大的臨床試驗中，向心肌梗死患者輸入同種異體MSCs后，短時間內顯示MSCs移植治療能夠降低心律失常，提高肺功能、左室功能和心臟整體功能[8]。雖然也有小樣本實驗通過對心梗患者進行分組對照研究表明，骨髓干細胞并不能提高左室射血分數和減小梗死面積，但這只屬于個案報道[9]。總的來說，MSCs移植在治療心肌梗死方面是有作用的，具有較好的前景，能獲得良好的收益。
除單獨應用MSCs治療外，心肌再生領域中還涌現了不少新技術，如基因轉染修飾、細胞因子或藥物預處理等，這些方法與MSCs移植聯合應用也取得了一定效果(見表 1)。細胞因子或藥物預處理是將MSCs與其共同培養后，再將MSCs注射到動物體內，或是在細胞移植前和移植后，對實驗動物注射相應的藥物，這種方法可以提高MSCs的分化效率、旁分泌功能、歸巢能力或移植細胞存活率等；基因轉染修飾是以病毒為載體，將特定基因轉染到MSCs中，使轉染的細胞表達特定細胞因子。基因轉染修飾干細胞是近年來干細胞移植治療心肌梗死研究的新方向，現以肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)為例，簡述基因轉染修飾MSCs治療心肌梗死的進展及相關機制。
HGF是一種多功能細胞因子，具有多種生物學活性，它能誘導有絲分裂、血管生成、組織再生，并有抗凋亡、抗纖維化等作用[10]。Jin等[11]在心肌梗死大鼠模型中研究HGF基因治療的長期療效時發現，單純HGF基因治療可以誘導生成不成熟和不規則的微血管。Lu等[12]分別將MSCs、轉染了血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的MSCs和轉染了HGF的MSCs經冠脈植入心肌梗死豬模型中，發現MSCs組、MSCs/VEGF組和MSCs/HGF組的左室心功能及血流灌注較生理鹽水組有顯著提高，而MSCs/HGF組比MSCs/VEGF組的效果更好，這與HGF具有較好的抗纖維化能力有關。因此HGF感染MSCs聯合移植抑制缺血心肌纖維化，理論上可能基于如下機制：① HGF抑制心肌纖維化，促進血管生成，減少心肌細胞凋亡[13]；② 局部高分泌的HGF可能對MSCs有趨化作用，使MSCs聚集在損傷組織局部，利于MSCs向損傷組織細胞(即心肌細胞)分化[14]；③ HGF借助MSCs為載體感染后移植到心肌缺血區，既可降低因脂質體與機體直接接觸所致的潛在毒性，又可使HGF在較長時間內維持一定水平的表達，從而提高移植效率[15]。因此這種經基因轉染修飾后的MSCs移植治療心肌梗死是將現有干細胞治療方法與基因工程、組織工程結合，具有增強原有治療效果的優勢，甚至開辟了新的治療途徑。
4 MSCs移植治療心肌梗死的機制
大量動物實驗及臨床研究證明MSCs移植可以改善心肌梗死后的心臟功能，但其機制仍不十分清楚，結合傳統的理論及近期大量的研究歸納，可能與以下4個因素有關：① MSCs可以分化為具有收縮功能的心肌細胞和血管內皮細胞，表達心肌特異性收縮蛋白，并形成間隙連接蛋白-43，與鄰近宿主心肌細胞相連，參與宿主心肌的同步收縮[5]；② MSCs可通過自分泌或旁分泌作用釋放生長因子，如VEGF，進一步促進心肌血管循環的重建，提高心肌的再灌注能力[4, 16]；③ 通過細胞與細胞間的相互作用誘導內源性c-kit+心肌細胞的增殖，也可通過激活或促進其他細胞向心臟歸巢、再生為心肌細胞而發揮作用[5]；④ 抗炎作用：研究發現MSCs移植到心臟后，能夠抑制NF-ΚB，減少TNF-α和IL-6的蛋白產生，并且提高抗炎性細胞活類素IL-10的表達，抑制I型及Ⅲ型膠原沉積，減少瘢痕的形成[4, 16]。因此，在眾多的機制中究竟哪個因素起主要作用，還是共同參與的結果，以及在不同實驗條件下是否有明顯差異，還需要進一步研究。
5 尚存的問題
雖然早期的動物實驗及典型的人體試驗結果是令人鼓舞的，但大量的隨機研究實驗的結果仍然不太令人滿意且存在爭議，一些研究者甚至提出干細胞移植在治療心肌梗死方面沒有效果[17]。因此目前MSCs移植治療心肌梗死的研究存在以下三個問題：
5.1 移植時機選擇
心肌梗死后細胞移植的最佳時間仍不清楚(見表 1)，有研究者認為急性心肌梗死后1周是細胞移植的最佳時機[18]。但另有研究認為，1周內梗死心肌局部炎癥反應最明顯，2周和4周移植的大鼠存在心肌細胞再生，而2周移植大鼠心功能改善更為明顯[19]。由于再灌注時間、再灌注方式、梗死面積、基礎心功能、干細胞數量和生物特性等都會對移植時間產生影響，所以現有的臨床試驗和動物實驗尚不能確定具體的移植時間窗，因此我們還需要大規模、隨機臨床試驗研究其影響因素及發生機制。
5.2 移植細胞數量及存活率
移植細胞的數量及移植細胞在心梗邊緣區的存活率是治療心梗效果的關鍵因素之一，文獻[20]報道不同劑量的骨髓間充質干細胞移植治療梗死心肌與改善缺血心臟功能之間存在量效關系。然而在一些移植不同劑量MSCs的實驗中(見表 1)，實驗對象卻獲得了相等的受益。由此推測移植細胞數量可能不是治療心梗效果好壞的關鍵，而移植細胞的存活率才是主要因素，因此進一步的相關研究仍需繼續進行。
表1
2010~2013年有關MSCs移植治療心肌梗死總結表
Table1.
The summary of the MSCs transplantation for myocardial infarction between 2010 and 2013
5.3 移植途徑
細胞移植的途徑有很多(見表 1)，目前主要的移植方法有心肌內直接注射、經皮穿刺導管介入心內膜注射、靜脈注射和經冠狀動脈注射4種。這4種移植方法各有優缺點：① 心肌內直接注射法[21]：在直視心臟的情況下，直接將細胞注射到功能細胞缺失的心外膜下區域，這種方式需開胸手術，技術難度及創傷較大，但定位準確；② 經皮穿刺導管介入心內膜注射[5]：該法可均勻地將干細胞移植到心肌缺血區域和周邊區域心內膜下，屬于微創操作，但是技術難度大，易致心律失常；③ 冠狀動脈內移植法[21]：將細胞治療和介入技術相結合，手術創傷小，操作簡單，有一定的應用前景，但這種植入方法有造成梗死的危險。④ 靜脈注射[21]：是最簡單的方法，具有損傷小，操作簡單，易于為患者接受等特點，但這種方法在很大程度上依賴于干細胞的歸巢，經靜脈移植的骨髓間充質干細胞很可能被其他器官阻留，只有很少的一部分移植細胞能到達心肌梗死區。此外，還有貼膜[27]以及采用多糖制成的多孔支架[22]等方式作為細胞移植途徑。雖然目前這些移植途徑均能不同程度的將干細胞移植到靶區，但在實際操作中仍存在許多問題，哪種途徑移植干細胞效果最佳，仍待進一步研究。
6 展望
目前臨床上使用間充質干細胞治療缺血性心臟病尚處在初級階段，還有許多問題需要解決。缺血性心臟病細胞療法中干細胞來源、細胞數以及注射方式等尚未有標準方案，我們需要更多的循證醫學證據的支持，以及更全面、安全、人性的治療才能達到最終目的。總之，干細胞移植治療心血管疾病的研究已經取得了舉世矚目的進展，隨著生物技術的飛速發展，干細胞移植將被賦予更活躍的生命力，相信隨著基礎理論和更大規模臨床研究的深入，這一新興治療手段必定會成為心臟疾病綜合治療手段中不可或缺的部分。
