載骨形態發生蛋白-2(BMP-2)活性多肽P24的聚三甲基碳酸酯-(聚氧乙烯)-聚三甲基碳酸酯(PTMC11-F127-PTMC11)注射型可降解凝膠誘導大鼠體內異位成骨,測定P24體外釋放曲線。將P24與不同質量濃度的PTMC11-F127-PTMC11水凝膠復合,采用二喹啉甲酸(BCA)法測定,繪制P24釋放曲線。將復合P24凝膠植于大鼠骶棘肌,行組織學切片HE染色檢測其異位成骨能力。PTMC11-F127-PTMC11濃度大于20%的復合凝膠其P24經突釋期后可維持緩釋1個月左右,滿足緩釋材料要求。組織學顯示第6周切片可見骨小梁。載BMP-2活性多肽P24 PTMC11-F127-PTMC11凝膠在體內能有效發揮其誘導成骨活性,有望成為生長因子合適載體。
引用本文： 趙晶晶, 方真華, 黃若昆, 肖凱, 李靜, 謝鳴, 勘武生. 載骨形態發生蛋白-2活性肽可降解水凝膠體內異位成骨研究. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(4): 811-815. doi: 10.7507/1001-5515.20140152 復制
引言
研究表明，天然人骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)由114個氨基酸組成，但真正發揮骨誘導作用的只是由20余個氨基酸組成的核心結構域[1]。本文作者所在課題組前期研究中通過BMP-2氨基酸序列中誘導成骨的核心功能區設計并人工合成了一種BMP-2活性肽P24。P24作為分子誘導信號，通過特定的細胞通訊與信息傳遞系統對細胞的黏附和向成骨方向定向分化等生物學行為調控，具有很好的骨誘導活性[2]。同時P24中包含磷酸化的絲氨酸以及天冬氨酸，能夠極好地模擬天然骨基質的誘導礦化功能，在局部形成偏酸的環境，促進局部的鈣、磷自組裝沉積到體內局部組織中膠原纖維表面自主裝礦化，生長成按同一方向排列的羥基磷灰石微型晶體結構，形成與天然骨極為相似的結構，可發揮與天然BMP-2類似的功能。以人工合成活性多肽代替其蛋白質，具有生物活性強、穩定性好、合成費用低等優點。但其成骨效應呈劑量和時間依賴性，如何使其持續有效地發揮其骨誘導作用一直是骨組織工程研究的一個難點[3]。
在多肽的載體材料方面，目前組織工程研究中應用最為廣泛的是聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚羥基乙酸(polyglycolic acid,PGA)及其共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]及Pluronic嵌段共聚物F127等，它們在力學強度、降解速度、細胞親合性等各方面均不理想，并非理想的骨組織工程良好的基質材料及載藥材料，限制了多肽在骨組織工程領域中進一步應用[4-5]。為了克服這些缺陷，Zhang等[6]在Pluronic嵌段共聚物F127分子鏈中引入疏水鏈段聚三甲基碳酸酯[poly(trimethylene carbonate),PTMC]鏈段，設計制備了聚三甲基碳酸酯-(聚氧乙烯)-聚三甲基碳酸酯[(poly(trimethylene carbonate)-F127-poly(trimethylene carbonate),PTMC11-F127-PTMC11]共聚物，獲得比較好的水溶性。直接將共聚物在低溫時(4 ℃)溶于水相介質，升溫至室溫，兩親性嵌段共聚物在水介質中通過自組裝形成具有親水外殼和疏水內核的膠束，進一步交聯形成透明穩定的水凝膠，可緩慢降解，且理化特性可調節。
1 材料與方法
1.1 實驗材料和儀器
PTMC11-F127-PTMC11多聚物材料由中山大學化學化工學院高分子研究所全大萍教授等制備：以Sn(Oct)2為催化劑，F127為大分子共引發劑進行trimethylene carbonate (TMC)的開環聚合，合成符合設計結構的PTMC11-F127-PTMC11嵌段共聚物；BMP-2活性多肽P24(委托吉爾生化公司合成,上海)；低溫凍干機(VFD-2000，比朗，上海)、環境掃描電鏡(Quanta 200,FEI,荷蘭)、超聲分散器、膠原海綿(孔率為88%，孔徑200~300 μm，博士德，武漢)、真空干燥箱(大連第四儀表廠)；雄性SD大鼠,體重為(150±20) g (華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供)。
1.2 凝膠制備與檢測
取2 mg PTMC11-F127-PTMC11共聚物溶于1 mL預冷的4 ℃去離子水中，使PTMC11-F127-PTMC11共聚物的質量百分終濃度為20%，超聲分散均勻，置于4 ℃冰箱冷存8 h，使PTMC11-F127-PTMC11水溶液達到平衡狀態。溫度緩慢上升至37 ℃，凝膠成形。冷凍干燥濃度為20% PTMC11-F127-PTMC11共聚物凝膠材料，真空噴金鍍膜，掃描電鏡拍照。
1.3 BCA法測定P24釋放
將相應質量的PTMC11-F127-PTMC11共聚物溶于800 μL預冷的4 ℃去離子水中，再將2 mg P24溶解于200 μL磷酸鹽緩沖液(PBS) (10 mg/mL PBS)后加入PTMC11-F127-PTMC11溶液中，使PTMC11-F127-PTMC11共聚物的終濃度為16%、20%、25%，超聲分散均勻，置于4 ℃冰箱冷存8 h，溫度緩慢上升至37 ℃，凝膠成形后置于10 mL PBS中，恒溫搖床輕微振蕩，1、3、5、7、10、14、21、28、35、42 d收集各組上清液，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測定P24。
1.4 大鼠體內成骨實驗
按1.3節描述的方法制備載P24/PTMC11-F127-PTMC11凝膠，其中P24 2 mg，PTMC11-F127-PTMC11共聚物濃度20%。對照組采用膠原海綿，制備5 mm×5 mm×5 mm大小的膠原海綿為支架材料，P24以磷酸鹽緩沖液溶解，按照2 mg P24的劑量滴加于膠原海綿上，待其充分吸收后凍干備用。不復合P24的濃度為20%等體積PTMC11-F127-PTMC11凝膠作為空白組。將24只SD大鼠隨機平均分為兩個實驗組，即2 mg P24/PTMC11-F127-PTMC11凝膠組、2 mg P24/膠原海綿組，每組八只大鼠。實驗大鼠采用氯胺酮腹腔注射麻醉。在背部骶棘肌制成1 cm長肌袋，分別植入2 mg P24/PTMC11-F127-PTMC11凝膠、2 mg P24/膠原海綿于一側骶棘肌肌袋內，留縫線標記植入位置中心。兩組大鼠分別在植入后第4周和第6周處死4只，對植入材料的局部組織進行取材，甲醛固定后行EDTA脫鈣，經石蠟包埋切片，HE染色，進行組織學觀察。
2 結果
2.1 凝膠材料掃描電鏡觀察
PTMC11-F127-PTMC11凝膠材料冷凍干燥后掃描電鏡拍照(見圖 1)。電鏡觀察可見在材料表面及內部疏松多孔結構，孔壁呈連續交聯，高倍下呈薄片狀分頁結構，微孔直徑范圍為20~40 μm(見圖 1)。
圖1
凍干電鏡掃描PTMC11-F127-PTMC11材料
Figure1.
Scanning electron microscope of freeze-dried PTMC11-F127-PTMC11 hydrogels
2.2 多肽釋放曲線
根據圖 2所示BCA法檢測結果繪制釋放曲線分析，濃度16%的P24/PTMC11-F127-PTMC11凝膠第1 d釋放的P24總量，多于濃度20%和25%的P24/PTMC11-F127-PTMC11凝膠。后兩者在突釋效應后緩慢釋放，可持續釋放1月左右，累積釋放97.4%。
圖2
不同濃度PTMC11-F127-PTMC11凝膠釋放P24曲線
Figure2.
Release kinetics of P24 from PTMC11-F127-PTMC11 hydrogels of various copolymer concentrations in vitro
2.3 組織學切片HE染色觀察
2 mg P24/PTMC11-F127-PTMC11凝膠組4周時可見一些間充質干細胞及一定量不成熟、散在的針狀骨小梁組織，出現成熟骨陷窩和骨細胞；6周時骨小梁、骨陷窩顯著增多，散在巢狀分布，其表面可見成排的活躍的骨細胞。材料周圍未見大量的炎性細胞。2 mg P24/膠原海綿復合材料4周時可見少量纖細網狀編織骨，體積較小，呈稀疏散在分布；6周時成骨量較4周時有一定量的增加(見圖 3)。
圖3
組織學觀察大鼠肌內異位成骨情況(HE染色,100×)
(a)P24/PTMC11-F127-PTMC11凝膠置入4 周；(b)P24/PTMC11-F127-PTMC11凝膠置入6周;(c)P24/膠原海綿置入4周；(d)P24/膠原海綿置入6周
Figure3. Samples taken for morphological study with light microscopy (HE stain,100×)(a) sample of P24/PTMC11-F127-PTMC11 obtained at 4th week; (b) sample of P24/PTMC11-F127-PTMC11 obtained at 6th week; (c) sample of collagen loaded with P24 obtained at 4th week; (d) sample of collagen loaded with P24 obtained at 6th week
3 討論
PTMC11-F127-PTMC11嵌段共聚物膠束化首先形成納米粒子，進一步交聯形成內部疏松多孔結構，孔壁呈連續交聯，多孔結構具有很好的細胞黏附性和一定的力學強度。用于給藥載體時，其特點是內核載藥量可調節，主要由粒子大小和粒子表面性質決定，與內核包裹的藥物無關。與小分子表面活性劑相比，聚合物的臨界膠束濃度很低，在水溶液中離解速度慢，因此藥物可在載體內停留較長時間，保證有足夠量的藥物釋放于靶向部位。在載體內短鏈多肽活性位點能充分暴露并與細胞表面受體結合，不影響其生物活性，復合后隨著凝膠材料本體的逐漸降解而釋放，突釋效應小于PLA、PGA、PLGA、Pluronic嵌段共聚物F127的微球及微囊制劑或蛋白膠原載體等[7]，體外降解釋放持續時間長達6周，基本滿足多肽在體內發揮骨誘導作用時間。Altunbas等[8]研究制備的20多肽形成水凝膠，親水性好，但載藥緩釋時間24 h，僅能用于短時間依賴性藥物，不能滿足P24作用時間。
PTMC11-F127-PTMC11凝膠作為P24的載體，通過以下三個方面來發揮其生物學活性，誘導異位成骨：① PTMC11-F127-PTMC11凝膠為多肽提供了三維空間支架，對多肽起到了緩釋的作用；② 肌肉中含有成纖維細胞和間充質干細胞，PTMC11-F127-PTMC11凝膠的多孔性狀能提供細胞遷移或增殖的支架，良好的細胞親合性，有利于這些細胞的增殖，遷移，它們在多肽的調控下可能轉化為成骨細胞；③ PTMC11-F127-PTMC11凝膠隨時間的推移逐漸降解吸收，避免了基質材料在體內過久的殘留，大大降低了機體對材料的免疫排斥反應[9]。
體內實驗中2 mg P24/PTMC11-F127-PTMC11凝膠組組織學檢查可見載體凝膠材料周圍明顯新骨小梁形成，具有活躍的骨細胞和發育很充分的骨小梁組織，與傳統載體膠原海綿比較其骨誘導活性更強，證實了P24與BMP-2類似的異位成骨能力和骨誘導活性。
4 結論
PTMC11-F127-PTMC11凝膠基質材料作為骨組織工程材料，具有良好的生物相容性、可降解性以及降解時間的可調控性等特點。同時具有良好的溫度敏感性能，可以很方便地制備成注射制劑或三維多孔支架材料。可經皮注射攜載多肽的PTMC11-F127-PTMC11凝膠發揮骨誘導作用修復骨缺損，有望為臨床醫生治療各種部位的骨缺損，特別是很棘手的骨延遲愈合、不愈合等提供了一種方便有效的方法。
展望：如何調節PTMC11-F127-PTMC11凝膠基質材料在力學強度、降解速度等方面特性使其成為骨組織工程理想的基質材料及載藥材料仍然是研究的難點與重點[10-11]。因此，我們下一步研究是把BMP-2活性多肽與力學強度、降解速度等不同性能的凝膠材料相結合，研究其成骨的時效和量效關系，以發揮其最佳成骨能力。
引言
研究表明，天然人骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)由114個氨基酸組成，但真正發揮骨誘導作用的只是由20余個氨基酸組成的核心結構域[1]。本文作者所在課題組前期研究中通過BMP-2氨基酸序列中誘導成骨的核心功能區設計并人工合成了一種BMP-2活性肽P24。P24作為分子誘導信號，通過特定的細胞通訊與信息傳遞系統對細胞的黏附和向成骨方向定向分化等生物學行為調控，具有很好的骨誘導活性[2]。同時P24中包含磷酸化的絲氨酸以及天冬氨酸，能夠極好地模擬天然骨基質的誘導礦化功能，在局部形成偏酸的環境，促進局部的鈣、磷自組裝沉積到體內局部組織中膠原纖維表面自主裝礦化，生長成按同一方向排列的羥基磷灰石微型晶體結構，形成與天然骨極為相似的結構，可發揮與天然BMP-2類似的功能。以人工合成活性多肽代替其蛋白質，具有生物活性強、穩定性好、合成費用低等優點。但其成骨效應呈劑量和時間依賴性，如何使其持續有效地發揮其骨誘導作用一直是骨組織工程研究的一個難點[3]。
在多肽的載體材料方面，目前組織工程研究中應用最為廣泛的是聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚羥基乙酸(polyglycolic acid,PGA)及其共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]及Pluronic嵌段共聚物F127等，它們在力學強度、降解速度、細胞親合性等各方面均不理想，并非理想的骨組織工程良好的基質材料及載藥材料，限制了多肽在骨組織工程領域中進一步應用[4-5]。為了克服這些缺陷，Zhang等[6]在Pluronic嵌段共聚物F127分子鏈中引入疏水鏈段聚三甲基碳酸酯[poly(trimethylene carbonate),PTMC]鏈段，設計制備了聚三甲基碳酸酯-(聚氧乙烯)-聚三甲基碳酸酯[(poly(trimethylene carbonate)-F127-poly(trimethylene carbonate),PTMC11-F127-PTMC11]共聚物，獲得比較好的水溶性。直接將共聚物在低溫時(4 ℃)溶于水相介質，升溫至室溫，兩親性嵌段共聚物在水介質中通過自組裝形成具有親水外殼和疏水內核的膠束，進一步交聯形成透明穩定的水凝膠，可緩慢降解，且理化特性可調節。
1 材料與方法
1.1 實驗材料和儀器
PTMC11-F127-PTMC11多聚物材料由中山大學化學化工學院高分子研究所全大萍教授等制備：以Sn(Oct)2為催化劑，F127為大分子共引發劑進行trimethylene carbonate (TMC)的開環聚合，合成符合設計結構的PTMC11-F127-PTMC11嵌段共聚物；BMP-2活性多肽P24(委托吉爾生化公司合成,上海)；低溫凍干機(VFD-2000，比朗，上海)、環境掃描電鏡(Quanta 200,FEI,荷蘭)、超聲分散器、膠原海綿(孔率為88%，孔徑200~300 μm，博士德，武漢)、真空干燥箱(大連第四儀表廠)；雄性SD大鼠,體重為(150±20) g (華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供)。
1.2 凝膠制備與檢測
取2 mg PTMC11-F127-PTMC11共聚物溶于1 mL預冷的4 ℃去離子水中，使PTMC11-F127-PTMC11共聚物的質量百分終濃度為20%，超聲分散均勻，置于4 ℃冰箱冷存8 h，使PTMC11-F127-PTMC11水溶液達到平衡狀態。溫度緩慢上升至37 ℃，凝膠成形。冷凍干燥濃度為20% PTMC11-F127-PTMC11共聚物凝膠材料，真空噴金鍍膜，掃描電鏡拍照。
1.3 BCA法測定P24釋放
將相應質量的PTMC11-F127-PTMC11共聚物溶于800 μL預冷的4 ℃去離子水中，再將2 mg P24溶解于200 μL磷酸鹽緩沖液(PBS) (10 mg/mL PBS)后加入PTMC11-F127-PTMC11溶液中，使PTMC11-F127-PTMC11共聚物的終濃度為16%、20%、25%，超聲分散均勻，置于4 ℃冰箱冷存8 h，溫度緩慢上升至37 ℃，凝膠成形后置于10 mL PBS中，恒溫搖床輕微振蕩，1、3、5、7、10、14、21、28、35、42 d收集各組上清液，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測定P24。
1.4 大鼠體內成骨實驗
按1.3節描述的方法制備載P24/PTMC11-F127-PTMC11凝膠，其中P24 2 mg，PTMC11-F127-PTMC11共聚物濃度20%。對照組采用膠原海綿，制備5 mm×5 mm×5 mm大小的膠原海綿為支架材料，P24以磷酸鹽緩沖液溶解，按照2 mg P24的劑量滴加于膠原海綿上，待其充分吸收后凍干備用。不復合P24的濃度為20%等體積PTMC11-F127-PTMC11凝膠作為空白組。將24只SD大鼠隨機平均分為兩個實驗組，即2 mg P24/PTMC11-F127-PTMC11凝膠組、2 mg P24/膠原海綿組，每組八只大鼠。實驗大鼠采用氯胺酮腹腔注射麻醉。在背部骶棘肌制成1 cm長肌袋，分別植入2 mg P24/PTMC11-F127-PTMC11凝膠、2 mg P24/膠原海綿于一側骶棘肌肌袋內，留縫線標記植入位置中心。兩組大鼠分別在植入后第4周和第6周處死4只，對植入材料的局部組織進行取材，甲醛固定后行EDTA脫鈣，經石蠟包埋切片，HE染色，進行組織學觀察。
2 結果
2.1 凝膠材料掃描電鏡觀察
PTMC11-F127-PTMC11凝膠材料冷凍干燥后掃描電鏡拍照(見圖 1)。電鏡觀察可見在材料表面及內部疏松多孔結構，孔壁呈連續交聯，高倍下呈薄片狀分頁結構，微孔直徑范圍為20~40 μm(見圖 1)。
圖1
凍干電鏡掃描PTMC11-F127-PTMC11材料
Figure1.
Scanning electron microscope of freeze-dried PTMC11-F127-PTMC11 hydrogels
2.2 多肽釋放曲線
根據圖 2所示BCA法檢測結果繪制釋放曲線分析，濃度16%的P24/PTMC11-F127-PTMC11凝膠第1 d釋放的P24總量，多于濃度20%和25%的P24/PTMC11-F127-PTMC11凝膠。后兩者在突釋效應后緩慢釋放，可持續釋放1月左右，累積釋放97.4%。
圖2
不同濃度PTMC11-F127-PTMC11凝膠釋放P24曲線
Figure2.
Release kinetics of P24 from PTMC11-F127-PTMC11 hydrogels of various copolymer concentrations in vitro
2.3 組織學切片HE染色觀察
2 mg P24/PTMC11-F127-PTMC11凝膠組4周時可見一些間充質干細胞及一定量不成熟、散在的針狀骨小梁組織，出現成熟骨陷窩和骨細胞；6周時骨小梁、骨陷窩顯著增多，散在巢狀分布，其表面可見成排的活躍的骨細胞。材料周圍未見大量的炎性細胞。2 mg P24/膠原海綿復合材料4周時可見少量纖細網狀編織骨，體積較小，呈稀疏散在分布；6周時成骨量較4周時有一定量的增加(見圖 3)。
圖3
組織學觀察大鼠肌內異位成骨情況(HE染色,100×)
(a)P24/PTMC11-F127-PTMC11凝膠置入4 周；(b)P24/PTMC11-F127-PTMC11凝膠置入6周;(c)P24/膠原海綿置入4周；(d)P24/膠原海綿置入6周
Figure3. Samples taken for morphological study with light microscopy (HE stain,100×)(a) sample of P24/PTMC11-F127-PTMC11 obtained at 4th week; (b) sample of P24/PTMC11-F127-PTMC11 obtained at 6th week; (c) sample of collagen loaded with P24 obtained at 4th week; (d) sample of collagen loaded with P24 obtained at 6th week
3 討論
PTMC11-F127-PTMC11嵌段共聚物膠束化首先形成納米粒子，進一步交聯形成內部疏松多孔結構，孔壁呈連續交聯，多孔結構具有很好的細胞黏附性和一定的力學強度。用于給藥載體時，其特點是內核載藥量可調節，主要由粒子大小和粒子表面性質決定，與內核包裹的藥物無關。與小分子表面活性劑相比，聚合物的臨界膠束濃度很低，在水溶液中離解速度慢，因此藥物可在載體內停留較長時間，保證有足夠量的藥物釋放于靶向部位。在載體內短鏈多肽活性位點能充分暴露并與細胞表面受體結合，不影響其生物活性，復合后隨著凝膠材料本體的逐漸降解而釋放，突釋效應小于PLA、PGA、PLGA、Pluronic嵌段共聚物F127的微球及微囊制劑或蛋白膠原載體等[7]，體外降解釋放持續時間長達6周，基本滿足多肽在體內發揮骨誘導作用時間。Altunbas等[8]研究制備的20多肽形成水凝膠，親水性好，但載藥緩釋時間24 h，僅能用于短時間依賴性藥物，不能滿足P24作用時間。
PTMC11-F127-PTMC11凝膠作為P24的載體，通過以下三個方面來發揮其生物學活性，誘導異位成骨：① PTMC11-F127-PTMC11凝膠為多肽提供了三維空間支架，對多肽起到了緩釋的作用；② 肌肉中含有成纖維細胞和間充質干細胞，PTMC11-F127-PTMC11凝膠的多孔性狀能提供細胞遷移或增殖的支架，良好的細胞親合性，有利于這些細胞的增殖，遷移，它們在多肽的調控下可能轉化為成骨細胞；③ PTMC11-F127-PTMC11凝膠隨時間的推移逐漸降解吸收，避免了基質材料在體內過久的殘留，大大降低了機體對材料的免疫排斥反應[9]。
體內實驗中2 mg P24/PTMC11-F127-PTMC11凝膠組組織學檢查可見載體凝膠材料周圍明顯新骨小梁形成，具有活躍的骨細胞和發育很充分的骨小梁組織，與傳統載體膠原海綿比較其骨誘導活性更強，證實了P24與BMP-2類似的異位成骨能力和骨誘導活性。
4 結論
PTMC11-F127-PTMC11凝膠基質材料作為骨組織工程材料，具有良好的生物相容性、可降解性以及降解時間的可調控性等特點。同時具有良好的溫度敏感性能，可以很方便地制備成注射制劑或三維多孔支架材料。可經皮注射攜載多肽的PTMC11-F127-PTMC11凝膠發揮骨誘導作用修復骨缺損，有望為臨床醫生治療各種部位的骨缺損，特別是很棘手的骨延遲愈合、不愈合等提供了一種方便有效的方法。
展望：如何調節PTMC11-F127-PTMC11凝膠基質材料在力學強度、降解速度等方面特性使其成為骨組織工程理想的基質材料及載藥材料仍然是研究的難點與重點[10-11]。因此，我們下一步研究是把BMP-2活性多肽與力學強度、降解速度等不同性能的凝膠材料相結合，研究其成骨的時效和量效關系，以發揮其最佳成骨能力。
