本文研究殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料的皮膚刺激性和燒傷治療效果。通過參照GB/T16886.10-2005評價該敷料的皮膚刺激性,同時制備燒傷兔模型,分為三組,空白對照組用凡士林油紗包扎,陽性對照組用納米銀創傷貼包扎,實驗樣品組用殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料包扎,分別于3、6、9、14、21、28 d進行傷口未愈合面積測量、羥脯氨酸含量及組織病理學檢查。實驗結果顯示該敷料原發性刺激指數為0;實驗樣品組和陽性對照組在6、9、14、21 d時,未愈合傷口面積均小于空白對照組(P＜0.05),實驗樣品組在9 d和14 d時其未愈合傷口面積顯著低于陽性對照組(P＜0.05);實驗樣品組在6、9和14 d時羥脯氨酸含量顯著高于陽性對照組和空白對照組(P＜0.05);通過病理學觀察,在21 d時實驗樣品組最早出現附屬器。由此說明殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料的皮膚刺激性極輕微,能夠有效促進燒傷創面愈合。
引用本文： 高萍, 王曉輝, 黃姝杰, 王瑛, 關靜, 李毅敏, 陶遵威. 殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料的燒傷療效研究. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(4): 806-810. doi: 10.7507/1001-5515.20140151 復制
引言
燒傷是由于光、熱、輻射等引起的組織損傷，是一種極其復雜的外傷性疾病，燒傷治療的最終目標是創面愈合，所以保護創面、防止感染、促進上皮生長的新型敷料成為研究熱點。
殼聚糖是天然產物，具有燒傷治療所必需的屬性，例如：生物相容性、可降解性、保濕性、透氣性[1]，并且由于殼聚糖特殊的分子結構，易于制成水凝膠[2]、納米纖維[3]、微/納米粒子[4]等新劑型。本文通過浸漬法在殼聚糖無紡布表面復合了適量左氧氟沙星-殼聚糖微球，制成一種長效緩釋敷料[5]。本文將對殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料進行皮膚刺激評價，并與納米銀敷料促進傷口愈合的能力進行比較。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
33只日本大耳白兔，普通級，雄性，體重2.0~2.5 kg，由北京方元緣養殖場提供，合格證號：scxk(京)2010-0002。
1.2 實驗儀器
紫外分光光度計[UV-260，島津企業管理(中國)有限責任公司]，離心機[J6-MI，貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司]，超凈工作臺 (ACD-201，蘇州市漢達工業自動化有限責任公司)，顯微鏡[BH-2，奧林巴斯(中國)有限公司]，組織切片機(RM2255，Leica company)，高壓蒸汽滅菌器(MLS-3750，日本三洋電器股份有限公司)
1.3 實驗材料
殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料(中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生裝備研究所)，納米銀敷料(湖南安信醫用高分子材料有限公司，批號：20100607)，生理鹽水(中國大冢制藥有限公司，批號：OL71G4)，羥脯氨酸檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20100902)，包音氏(Bouin's)固定液(過飽和苦味酸∶甲醛∶冰醋酸=15∶5∶1)。
1.4 方法
1.4.1 動物皮膚刺激實驗
參照GB/T16886.10-2005，取3只兔，剪剃背部脊柱兩側兔毛備皮，75%乙醇消毒皮膚。在每只兔脊柱兩側各選兩點，將殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料剪成2.5 cm×2.5 cm直接敷貼在脊柱左上和右下兩點，作為實驗樣品組；將生理鹽水滴到2.5 cm×2.5 cm的紗布塊上，每塊紗布滴0.5 mL，敷貼在脊柱左下和右上兩點，作為陰性對照組。用半封閉性包扎帶固定6 h，然后除去敷貼物。在除去敷貼物后分別于24、48和72 h三個時間點按表 1對試驗創面記分。
表1
記分標準
Table1.
Scoring standards
依據標準，皮膚刺激程度用原發性刺激指數表示。計算出每只動物在每一規定時間內實驗樣品引起的紅斑、水腫的原發性刺激記分相加后再除以觀察總數之和；同樣計算出陰性對照的原發性刺激記分，將實驗材料原發性刺激記分減去陰性對照的記分即得出原發性刺激指數。原發性刺激指數與動物的刺激反應類型對應關系如表 2所示。
表2
刺激反應類型
Table2.
Response types
1.4.2 燒傷動物模型制備與分組
將兔用2%戊巴比妥鈉麻醉，剪剃背部兔毛備皮，以75%酒精棉球消毒，用觸頭直徑2.0 cm的電烙鐵，以溫度100 ℃，1 kg壓力熨燙兔皮膚10 s，制備燒傷模型。每只兔子沿脊柱上中下三個位置，燙三個創面。接近頭部的創面(上位)為實驗樣品組，用殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料包扎；中間部位的創面(中位)為空白對照組，用凡士林油紗包扎；接近尾部的創面(下位)為陽性對照組，用納米銀敷料包扎。按照時間3、6、9、14、21、28 d分為6組，每組5只兔，共計30只兔。
1.4.3 燒傷面積實驗
分別在3、6、9、14、21、28 d觀察動物創面，用透明薄膜描繪未愈合傷口大小，掃描薄膜后用計算機軟件photoshop計算其面積，繪制未愈合傷口面積隨時間的變化曲線。
1.4.4 羥脯氨酸含量實驗
分別在3、6、9、14、21、28 d處死動物，與傷口處取組織標本0.5 g，采用堿水解法處理標本，使用羥脯氨酸試劑盒，根據羥脯氨酸的氧化產物與二甲氨基苯甲醛呈色深淺推算出其含量。
1.4.5 組織病理學實驗
分別在3、6、9、14、21、28 d處死動物，在傷口處取組織標本，浸泡于包音氏固定液中30 d，然后石蠟包埋、切片、HE染色，進行組織病理學觀察。
1.4.6 使用統計學軟件
使用SPSS 16.0對各組實驗數據做單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 動物皮膚刺激實驗結果
在24、48和72 h三個時間點對3只兔進行創面觀察并按照表 1標準記分。實驗結果顯示，殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料與皮膚接觸的6處均無紅斑產生，與生理鹽水對照組一致，故均記分為0。根據定義計算殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料原發性刺激指數，該指數=(0-0)÷18=0.0。所以我們認為，本文使用的殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料對日本大耳白兔無皮膚刺激性。
2.2 燒傷面積實驗結果
實驗樣品組和陽性對照組在6、9、14、21 d時，未愈合傷口面積均小于空白對照組(P＜0.05)，3 d和28 d時，三組間比較，差異無統計學意義(P＞0.05)；實驗樣品組在3、6、21、28 d時和陽性對照組之間比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，在9 d和14 d時實驗樣品組未愈合傷口面積顯著低于陽性對照組(P＜0.05)(見表 3)。
表3
未愈合傷口面積測量結果(n＝5，cm2，2.3 羥脯氨酸含量實驗結果
實驗樣品組在6、9和14 d時羥脯氨酸含量顯著高于陽性對照組和空白對照組(P＜0.05)，3、21和28 d時，三組間比較，差異無統計學意義(P＞0.05)；陽性對照組在各個時間點與空白對照組之間，差異無統計學意義(P＞0.05)(見表 4)。
表4
羥脯氨酸含量測量結果(n＝5，μg/mg，2.4 組織病理學實驗結果
在3 d時，三組的組織形態大致相似，均在血痂下見皮下組織水腫及新生肉芽組織形成。在6 d時，實驗對照組和陽性對照組的創面為晚期肉芽組織，其中實驗對照組有2只動物創面邊緣見新生上皮(見圖 1)，空白對照組的創面為早期或中、晚期肉芽組織。在9 d時，三組的創面均為晚期肉芽組織及邊緣見新生上皮，開始修復創面，并且實驗樣品組的新生上皮覆蓋全部創面的50%，而陽性對照組僅有1只動物的新生上皮覆蓋全部創面的50%。在14 d時，實驗樣品組的創面覆蓋的新生上皮生長更多，其中2個動物已全部愈合，陽性對照組和空白對照組的創面均見新生上皮生長，但未全部覆蓋愈合。在21 d時，實驗樣品組的創面已全部為新生上皮覆蓋，并有3只已見附屬器生長(見圖 1)，陽性對照組和空白對照組的創面纖維化明顯，但不見附屬器結構。在28 d時，實驗樣品組的動物傷口已經全部完全恢復，而陽性對照組還有2只動物未見附屬器生長，空白對照組中還有4只動物未見附屬器生長。
圖1
組織病理學切片(HE染色，100×)
Figure1.
Pathological organization chart (HE stain，100×)
3 討論
殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋材料含有第三代喹諾酮類抗菌藥物左氧氟沙星，隨著它在臨床上的廣泛應用，不良反應的報道不斷增加，例如皮膚紅腫[6]。但通過藥物制劑控制藥物釋放量和釋放時間，可有效降低毒性，Kimura等[7]研制的控釋左氧氟沙星植入劑(PT-01)的刺激性顯著降低。本研究所用的殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料中的殼聚糖納米微粒的包封率高、穩定性好，能夠有效控制左氧氟沙星的釋放，實驗結果證明，該敷料對日本大耳白兔無皮膚刺激性。
創面愈合過程主要包括血小板聚集、血液凝固、纖維蛋白形成、炎性反應發生、基質變化、細胞增殖和再生，受損組織修復和重塑等過程。殼聚糖可促進上皮細胞的再生，通過介導細胞增殖而促進傷口愈合，通過溫和的急性炎性反應吸引大量的多形核細胞和巨噬細胞以清除組織碎片和血凝塊。殼聚糖可促進纖維細胞的遷移，對基質細胞有趨化、遷移、激活作用，并加速細胞增殖和組織重塑過程，促進皮膚組織修復[8]。所以本文燒傷面積實驗中，實驗樣品組的傷口愈合快于空白對照組(P＜0.05)。殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料具有很強的透氣、透濕性，所以能有效吸收創面滲出液，維持一個仿效創面生理性愈合的局部濕潤環境，有利于創面肉芽組織生長和上皮細胞再生，促進了自體皮片的擴展及創面愈合。
羥脯氨酸對形成三股螺旋繩狀結構的膠原蛋白及其穩定性都具有重要意義，并且它在膠原蛋白中所占比例相對恒定(12%~15%)，而膠原蛋白是燒傷創面修復過程中形成組織的主要成分，其代謝狀況可以反映創面愈合的情況，因此檢測羥脯氨酸含量可以反映膠原蛋白含量，是創面愈合的重要指標[9]。實驗樣品組分別在6、9和14 d時羥脯氨酸含量顯著高于空白對照組(P＜0.05)，與組織病理學實驗結果相似，在21 d時實驗樣品組最早出現附屬器，說明實驗樣品組的燒傷恢復最快，進一步證明殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料能夠促進燒傷創面愈合。
引言
燒傷是由于光、熱、輻射等引起的組織損傷，是一種極其復雜的外傷性疾病，燒傷治療的最終目標是創面愈合，所以保護創面、防止感染、促進上皮生長的新型敷料成為研究熱點。
殼聚糖是天然產物，具有燒傷治療所必需的屬性，例如：生物相容性、可降解性、保濕性、透氣性[1]，并且由于殼聚糖特殊的分子結構，易于制成水凝膠[2]、納米纖維[3]、微/納米粒子[4]等新劑型。本文通過浸漬法在殼聚糖無紡布表面復合了適量左氧氟沙星-殼聚糖微球，制成一種長效緩釋敷料[5]。本文將對殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料進行皮膚刺激評價，并與納米銀敷料促進傷口愈合的能力進行比較。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
33只日本大耳白兔，普通級，雄性，體重2.0~2.5 kg，由北京方元緣養殖場提供，合格證號：scxk(京)2010-0002。
1.2 實驗儀器
紫外分光光度計[UV-260，島津企業管理(中國)有限責任公司]，離心機[J6-MI，貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司]，超凈工作臺 (ACD-201，蘇州市漢達工業自動化有限責任公司)，顯微鏡[BH-2，奧林巴斯(中國)有限公司]，組織切片機(RM2255，Leica company)，高壓蒸汽滅菌器(MLS-3750，日本三洋電器股份有限公司)
1.3 實驗材料
殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料(中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生裝備研究所)，納米銀敷料(湖南安信醫用高分子材料有限公司，批號：20100607)，生理鹽水(中國大冢制藥有限公司，批號：OL71G4)，羥脯氨酸檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20100902)，包音氏(Bouin's)固定液(過飽和苦味酸∶甲醛∶冰醋酸=15∶5∶1)。
1.4 方法
1.4.1 動物皮膚刺激實驗
參照GB/T16886.10-2005，取3只兔，剪剃背部脊柱兩側兔毛備皮，75%乙醇消毒皮膚。在每只兔脊柱兩側各選兩點，將殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料剪成2.5 cm×2.5 cm直接敷貼在脊柱左上和右下兩點，作為實驗樣品組；將生理鹽水滴到2.5 cm×2.5 cm的紗布塊上，每塊紗布滴0.5 mL，敷貼在脊柱左下和右上兩點，作為陰性對照組。用半封閉性包扎帶固定6 h，然后除去敷貼物。在除去敷貼物后分別于24、48和72 h三個時間點按表 1對試驗創面記分。
表1
記分標準
Table1.
Scoring standards
依據標準，皮膚刺激程度用原發性刺激指數表示。計算出每只動物在每一規定時間內實驗樣品引起的紅斑、水腫的原發性刺激記分相加后再除以觀察總數之和；同樣計算出陰性對照的原發性刺激記分，將實驗材料原發性刺激記分減去陰性對照的記分即得出原發性刺激指數。原發性刺激指數與動物的刺激反應類型對應關系如表 2所示。
表2
刺激反應類型
Table2.
Response types
1.4.2 燒傷動物模型制備與分組
將兔用2%戊巴比妥鈉麻醉，剪剃背部兔毛備皮，以75%酒精棉球消毒，用觸頭直徑2.0 cm的電烙鐵，以溫度100 ℃，1 kg壓力熨燙兔皮膚10 s，制備燒傷模型。每只兔子沿脊柱上中下三個位置，燙三個創面。接近頭部的創面(上位)為實驗樣品組，用殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料包扎；中間部位的創面(中位)為空白對照組，用凡士林油紗包扎；接近尾部的創面(下位)為陽性對照組，用納米銀敷料包扎。按照時間3、6、9、14、21、28 d分為6組，每組5只兔，共計30只兔。
1.4.3 燒傷面積實驗
分別在3、6、9、14、21、28 d觀察動物創面，用透明薄膜描繪未愈合傷口大小，掃描薄膜后用計算機軟件photoshop計算其面積，繪制未愈合傷口面積隨時間的變化曲線。
1.4.4 羥脯氨酸含量實驗
分別在3、6、9、14、21、28 d處死動物，與傷口處取組織標本0.5 g，采用堿水解法處理標本，使用羥脯氨酸試劑盒，根據羥脯氨酸的氧化產物與二甲氨基苯甲醛呈色深淺推算出其含量。
1.4.5 組織病理學實驗
分別在3、6、9、14、21、28 d處死動物，在傷口處取組織標本，浸泡于包音氏固定液中30 d，然后石蠟包埋、切片、HE染色，進行組織病理學觀察。
1.4.6 使用統計學軟件
使用SPSS 16.0對各組實驗數據做單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 動物皮膚刺激實驗結果
在24、48和72 h三個時間點對3只兔進行創面觀察并按照表 1標準記分。實驗結果顯示，殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料與皮膚接觸的6處均無紅斑產生，與生理鹽水對照組一致，故均記分為0。根據定義計算殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料原發性刺激指數，該指數=(0-0)÷18=0.0。所以我們認為，本文使用的殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料對日本大耳白兔無皮膚刺激性。
2.2 燒傷面積實驗結果
實驗樣品組和陽性對照組在6、9、14、21 d時，未愈合傷口面積均小于空白對照組(P＜0.05)，3 d和28 d時，三組間比較，差異無統計學意義(P＞0.05)；實驗樣品組在3、6、21、28 d時和陽性對照組之間比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，在9 d和14 d時實驗樣品組未愈合傷口面積顯著低于陽性對照組(P＜0.05)(見表 3)。
表3
未愈合傷口面積測量結果(n＝5，cm2，2.3 羥脯氨酸含量實驗結果
實驗樣品組在6、9和14 d時羥脯氨酸含量顯著高于陽性對照組和空白對照組(P＜0.05)，3、21和28 d時，三組間比較，差異無統計學意義(P＞0.05)；陽性對照組在各個時間點與空白對照組之間，差異無統計學意義(P＞0.05)(見表 4)。
表4
羥脯氨酸含量測量結果(n＝5，μg/mg，2.4 組織病理學實驗結果
在3 d時，三組的組織形態大致相似，均在血痂下見皮下組織水腫及新生肉芽組織形成。在6 d時，實驗對照組和陽性對照組的創面為晚期肉芽組織，其中實驗對照組有2只動物創面邊緣見新生上皮(見圖 1)，空白對照組的創面為早期或中、晚期肉芽組織。在9 d時，三組的創面均為晚期肉芽組織及邊緣見新生上皮，開始修復創面，并且實驗樣品組的新生上皮覆蓋全部創面的50%，而陽性對照組僅有1只動物的新生上皮覆蓋全部創面的50%。在14 d時，實驗樣品組的創面覆蓋的新生上皮生長更多，其中2個動物已全部愈合，陽性對照組和空白對照組的創面均見新生上皮生長，但未全部覆蓋愈合。在21 d時，實驗樣品組的創面已全部為新生上皮覆蓋，并有3只已見附屬器生長(見圖 1)，陽性對照組和空白對照組的創面纖維化明顯，但不見附屬器結構。在28 d時，實驗樣品組的動物傷口已經全部完全恢復，而陽性對照組還有2只動物未見附屬器生長，空白對照組中還有4只動物未見附屬器生長。
圖1
組織病理學切片(HE染色，100×)
Figure1.
Pathological organization chart (HE stain，100×)
3 討論
殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋材料含有第三代喹諾酮類抗菌藥物左氧氟沙星，隨著它在臨床上的廣泛應用，不良反應的報道不斷增加，例如皮膚紅腫[6]。但通過藥物制劑控制藥物釋放量和釋放時間，可有效降低毒性，Kimura等[7]研制的控釋左氧氟沙星植入劑(PT-01)的刺激性顯著降低。本研究所用的殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料中的殼聚糖納米微粒的包封率高、穩定性好，能夠有效控制左氧氟沙星的釋放，實驗結果證明，該敷料對日本大耳白兔無皮膚刺激性。
創面愈合過程主要包括血小板聚集、血液凝固、纖維蛋白形成、炎性反應發生、基質變化、細胞增殖和再生，受損組織修復和重塑等過程。殼聚糖可促進上皮細胞的再生，通過介導細胞增殖而促進傷口愈合，通過溫和的急性炎性反應吸引大量的多形核細胞和巨噬細胞以清除組織碎片和血凝塊。殼聚糖可促進纖維細胞的遷移，對基質細胞有趨化、遷移、激活作用，并加速細胞增殖和組織重塑過程，促進皮膚組織修復[8]。所以本文燒傷面積實驗中，實驗樣品組的傷口愈合快于空白對照組(P＜0.05)。殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料具有很強的透氣、透濕性，所以能有效吸收創面滲出液，維持一個仿效創面生理性愈合的局部濕潤環境，有利于創面肉芽組織生長和上皮細胞再生，促進了自體皮片的擴展及創面愈合。
羥脯氨酸對形成三股螺旋繩狀結構的膠原蛋白及其穩定性都具有重要意義，并且它在膠原蛋白中所占比例相對恒定(12%~15%)，而膠原蛋白是燒傷創面修復過程中形成組織的主要成分，其代謝狀況可以反映創面愈合的情況，因此檢測羥脯氨酸含量可以反映膠原蛋白含量，是創面愈合的重要指標[9]。實驗樣品組分別在6、9和14 d時羥脯氨酸含量顯著高于空白對照組(P＜0.05)，與組織病理學實驗結果相似，在21 d時實驗樣品組最早出現附屬器，說明實驗樣品組的燒傷恢復最快，進一步證明殼聚糖-左氧氟沙星長效緩釋敷料能夠促進燒傷創面愈合。
