本文探索了介入瓣瓣膜膜片的制備方法和瓣膜化學改性和切割方法對瓣膜膜片拉伸性能和縫合力力學性能的影響。本研究通過采集新鮮豬心包材料并應用碳化亞胺溶液和戊二醛溶液作為固定液的方法合成介入瓣瓣膜膜片材料;通過茚三酮法檢測瓣膜膜片材料的交聯度情況;應用拉伸及縫合力力學實驗測試介入瓣瓣膜膜片材料的生物力學性能;通過場發射掃描電鏡表征瓣膜膜片材料在經過縫合線拉伸作用后的膠原纖維取向分布。結果表明:經過化學改性后,介入瓣瓣膜膜片材料的交聯度達到93.78%±3.2%;瓣膜膜片材料的拉伸強度達到(8.24±0.79) MPa;縫合力強度增加了102%。介入瓣瓣膜膜片材料具有較強的生物力學性能,有望發展成為的一種較好的介入瓣瓣膜膜片材料。
引用本文： 陳大凱, 李雨, 羅七一, 劉寶林, 陳康民. 基于化學改性和切割方法的介入瓣瓣膜力學性能相關研究. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(4): 801-805. doi: 10.7507/1001-5515.20140150 復制
引言
目前，退行性和代謝性心臟瓣膜疾病的患者所占的比例日益增多，這類患者不適合手術瓣膜置換，而是介入式生物瓣置換產品的主要適用群體[1-4]，介入式生物瓣屬于生物瓣中的一個亞種類。可使患者免于開胸手術的介入式生物瓣置換產品主要由組件中的人工生物瓣膜及其輸送系統構成。介入式生物瓣主要由自膨脹的超彈性合金支架和固定在支架上的瓣膜膜片組織組成。自Cribier于2002年完成第一例臨床應用至今，介入式生物瓣從最初的不為醫生接受，到現在已成為心臟瓣膜置換的一個熱點。相應產品不斷完善，目前以Edwards公司的SAPIEN球囊擴張式主動脈瓣膜和Medtronic公司的CoreValve自擴張式主動脈瓣膜為代表，兩者都于2007年取得CE認證，2008~2009年的手術量累計超過1.6萬例。Edwards SAPIEN THV手術成功率達到97%以上，30 d死亡率在10%以下[5-6]。Medtronic CoreValve植入量目前已經超過1萬個，兩年生存率為74%左右[7-8]。除了已經上市的這兩款介入式生物瓣膜，正在研發、臨床試驗的其他生物瓣產品有將近20種[9]。各家公司有其獨特的對于瓣膜膜片的化學改性方法，基于不同化學改性方法的瓣膜膜片的鈣化性能對生物瓣植入后的耐久性具有重要意義，此外在化學改性的基礎上選擇合適的瓣膜膜片切割方法，對生物瓣的耐久性也十分重要。生物瓣植入后所處的是一個血流動力學因素十分復雜的環境[10]，這需要膜片具有優異的生物力學性能。本文主要研究瓣膜化學改性和瓣膜切割技術對于介入瓣瓣膜膜片力學性能的影響及其相關性。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
碳化亞胺(Carbodiimide,EDC)(東京化成工業株式會社)，N-羥基琥珀酰亞氨(N-Hydroxysuccinimide,NHS)(阿拉丁試劑(上海)有限公司)，透明質酸酶和2 U·mol-1、硫酸軟骨素裂解酶(上海億欣生物科技有限公司)，戊二醛(Glutaraldehyde,GA)、乙二胺四乙酸、磷酸二氫鈉(上海國藥集團化學試劑有限公司)，3/0縫合線(強生(中國)醫療器材有限公司)，其他均為國內外分析純。
Holten型超凈工作臺(美國賽默飛世爾科技公司)，LQZ型恒溫振蕩器(上海精宏實驗設備有限公司)，電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多控股公司)，R-100型激光切割機(美國Raydiance公司)，Instron5543型生物力學測試機(美國Instron試驗設備有限公司)，Quanta 200 FEG型掃描電子顯微鏡(美國FEI公司)。
1.2 試驗方法
1.2.1 瓣膜膜片材料的制備
進入豬屠宰場后，取出洗凈的保鮮桶，里面加入半桶生理鹽水，用0~4 ℃生理鹽水來清洗裁剪下的心包。沿著心臟和肺葉的交界處進行剪切工作，沿著房室溝將心包切下。心包在剪切過程中，把心臟組織，肺葉膜等組織清理后，進行脂肪層的剝離。待脂肪層剝離后，采用鑷子和剪刀去除心包表面殘留的脂肪顆粒、纖維、大血管和結締組織。心包離體后用0~4 ℃的生理鹽水低溫保存一段時間，保存時間不應超過4 h，樣品標為Fresh-P。
在交聯固定前，采用Hank's緩沖溶液清洗，以每10片心包500 mL的用量漂洗2~3 min。待心包內外沒有殘余血水后，采用1.25% EDC和0.6% NHS的緩沖溶液進行交聯固定，固定溫度4 ℃，固定時間60 h。之后再采用0.625%GA溶液進行交聯固定，固定溫度4 ℃，固定時間48 h，樣品標為EDC-P。用0.625%GA溶液常規處理的心包組織作為對照，樣品標為GA-P。
1.2.2 厚度測量
瓣膜膜片在37 ℃的酶溶液(10 U/mL透明質酸酶和2 U/mol硫酸軟骨素裂解酶的醋酸銨緩沖溶液，pH=7)中放置24 h后，用精確性達到0.01 mm的手持式測厚儀測定中央區域固定三點的厚度，取平均值作為該瓣膜膜片的厚度。
1.2.3 交聯度檢測
采用茚三酮溶液來測定瓣膜膜片的交聯度，樣本數為10。使用5 μmol/L的甘氨酸溶液做標準曲線，將10 μL膜片浸提液和300 μL去離子水混合，靜置60 min后滴加3 mL茚三酮溶液，在100 ℃下加熱20 min，待冷卻至室溫后滴加15 mL異丙醇，用紫外可見分光光度計測量570 nm下的吸光值，通過標準曲線計算瓣膜膜片中α-氨基酸的摩爾數。交聯度計算公式為：交聯度(%)=(未交聯的瓣膜膜片自由氨基酸含量－交聯的瓣膜膜片自由氨基酸含量)/未交聯的瓣膜膜片自由氨基酸含量×100%。
1.2.4 瓣膜材料的切割
瓣膜切割面積大約10 mm2，切割區域在中央纖維取向一致且厚度均勻處，切割方向沿著纖維方向。機械切割采用手術刀片切割Fresh-P、GA-P和EDC-P，樣品分別標為FB-P、GB-P和CB-P。激光切割Fresh-P、GA-P和EDC-P需要在較低的脈沖能量下進行，激光切割速度是7.5 mm/s，切割成50 mm×5 mm的瓣膜膜片，必須在瓣膜中膠原纖維組織含水量歸零之前完成激光切割過程，樣品分別標為FL-P、GL-P和CL-P。
1.2.5 拉伸力學測試
取瓣膜膜片6種，每種的樣本數為10，測試前保存在PBS緩沖溶液中。將瓣膜膜片在Instron5543型生物力學測試機做應力-應變實驗，沿著纖維排列方向加載應力。曲線選擇：負荷變形；變形傳感器：位移；試樣速度：25 mm/min；試樣標距：25 mm；測定材料的最大張力，斷裂伸長率和彈性模量等指標。整個測試過程中用PBS緩沖溶液保持瓣膜膜片的濕潤。
1.2.6 縫合力力學測試
將瓣膜膜片沿基頂線鋪開，在基頂線的垂直方向將6種瓣膜膜片裁成20 mm×10 mm的膜片，每種的樣本數為10。將膜片條一端夾在測縫合力儀器的夾子上，懸空留出10 mm長條，在距離自由端面4 mm處用3/0縫合線，圓頭針與儀器下端的固定框中打三個結。打結時，在儀器的另一端手臂上施加5 g的力。夾膜片一端的上方用PBS緩沖溶液沿著夾子浸潤膜片。膜片后面設置立體顯微鏡燈光，以便觀察。儀器的另一端手臂上施加500 g的力，并保持1 min。之后，再增加500 g的力保持1 min。期間，采用立體顯微鏡進行全程觀察。所有膜片都需承受這個力，保持樣品完整。之后緩緩地每隔10 s施加20 g力直至心包撕裂。根據施加力、心包的厚度和寬度，可得每平方毫米上有多少公斤力(按照1 kgf·mm-2=10 MPa)，即瓣膜膜片的縫合力。
1.2.7 瓣膜材料的電鏡觀察
將瓣膜膜片經過體積分數2.5%戊二醛和1%鋨酸固定，梯度酒精逐級脫水，醋酸異戊酯置換，臨界點真空干燥，噴金后掃描電鏡下觀察瓣膜膜片材料上膠原纖維的取向分布情況。
1.2.8 統計學分析
采用SPSS 13.0統計軟件，數據以均值±標準差(
2 結果與討論
2.1 瓣膜的交聯度
兩種瓣膜膜片GA-P和EDC-P交聯度測定結果分別為92.05%±3.1%、93.78%±3.2%。兩種化學改性方法組間比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。
2.2 拉伸力學檢測結果
從圖 1看出，經過化學改性后，GB-P、GL-P、CB-P和CL-P的拉伸強度均明顯大于未改性的FB-P和FL-P(P＜0.05)，說明化學交聯使組織拉伸強度明顯提高。GA使得瓣膜膜片膠原纖維中的賴氨酸和羥賴氨酸之間以化學鍵的方式連接起來，使瓣膜膜片的膠原纖維、彈性纖維和糖蛋白等形成分子內和分子間交聯，從而使處理后的膠原纖維組織力學強度有所增加。EDC交聯瓣膜膜片膠原纖維中的谷氨酸和天冬氨酸殘基中的羧基，再同其它膠原纖維中的自由氨基反應。由于EDC的小分子特性，這種交聯方式屬于零長度交聯[11]。由于EDC與膠原纖維中的羧基反應后形成O-酰基脲中間體，此中間體受賴氨酸或羥賴氨酸殘基之自由氨基的親核作用后即形成酰胺鍵交聯，釋放出1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)脲。由于O-酰基脲中間體很不穩定，容易重排形成N-酰基脲或水解形成1-乙基-3-(-甲基氨丙基)脲和羧基而影響交聯效果。NHS可與不穩定的O-基脲生成穩定的中間體NHS酯，NHS酯再與氨基功能團反應形成交聯，從而提高了交聯速率和交聯程度。EDC處理的瓣膜膜片具有較好的柔韌性、更大的延展性和更低的應力松弛。這一點可以從圖 1中CB-P和CL-P的彈性模量優于GB-P和GL-P得以體現。經過0.625%GA溶液的后續浸泡，可以改善膠原纖維組織的變硬。另外切割方法對瓣膜膜片拉伸力學性能的影響較大，主要由于在機械切割過程中，機械作用很容易對瓣膜中的膠原纖維組織產生拉扯現象，同時在切割過程中由于切割方向難控制性，切割區域周圍的膠原組織很容易被損傷，導致瓣膜膜片的拉伸力學強度受損。
圖1
瓣膜膜片的拉伸力學性能測試結果
Figure1.
Tensile testing results of valve membrane
2.3 縫合力力學檢測結果
如圖 2所示，機械切割對膠原組織的損傷作用在瓣膜膜片的縫合力力學檢測結果中尤為明顯。以GB-P和GL-P為例，其縫合力力學強度損失20%左右。化學改性方法也會使得GL-P和CL-P的縫合力力學性能有所差異，這種差異性的結果和兩者的交聯度相比呈現出相反的狀態。這也說明了不能以交聯度來判斷瓣膜膜片的力學性能。結果顯示，GL-P和CL-P組的縫合力強度明顯比未改性的FB-P和FL-P大(P＜0.05)，說明化學交聯和激光切割使組織縫合力強度明顯提高。由于在GA溶液中，GA單體的聚合作用可以使得GA聚合成不同長度的聚合體，這就會產生兩種交聯作用：一種是分子內交聯，它是在同一個膠原纖維螺旋內兩條肽鏈之間形成的交聯作用，這類交聯鍵主要影響交聯產物的變性溫度和拉伸強度等性能；另一種是分子間交聯，它是在兩條相鄰的螺旋間的肽鏈中形成的交聯鍵[12-13]，這類交聯作用主要影響交聯產物的溶脹性和表面延伸性。當兩條微纖維之間的距離小于交聯劑分子的長度時，交聯也可以在兩條相鄰的微纖維之間發生。正是由于膠原纖維的分子間交聯作用的存在導致了不能單純依靠交聯度來判斷瓣膜膜片的力學性能。在激光切割過程中切割部分的膠原纖維組織會出現瞬間的缺水現象，所產生的熱效應會使得膠原纖維組織發生交聯作用，使得瓣膜切割邊界硬度增加。這在一定程度上提高了瓣膜膜片的縫合力力學強度，減小了瓣膜膜片的彈性模量。
圖2
瓣膜膜片的縫合力力學性能測試結果
Figure2.
Suture force testing results of valve membrane
2.4 瓣膜材料的掃描電鏡觀察結果
豬心包組織主要由漿膜層、纖維層和外心包結締組織層構成，纖維層由多層膠原纖維組成。由圖 3(a)和圖 3(b)可見，瓣膜膜片的表面主要由致密而纖細的膠原纖維組成。膠原纖維束以不同的方向排列，總體呈現出波浪狀形狀[14-15]。圖 3(a)機械切割的切割面十分不規則，由于切割過程中的膠原纖維拉扯作用，其切口表面膠原纖維排列不整齊，存在膠原纖維突出現象。這就使得瓣膜膜片在縫合力力學檢測過程中膠原纖維很容易發生斷裂作用，縫合線自由度大大增加;如圖 3(c)所示，瓣膜膜片在經過縫合線剪切作用后，其表面膠原纖維排列紊亂，規整形態遭到嚴重破壞。圖 3(b)激光切割的切割面膠原纖維排列十分整齊，無膠原纖維突出現象，其表面膠原纖維排列均無明顯紊亂和斷裂現象;如圖 3(d)所示，瓣膜膜片在經過縫合線剪切作用后，大部分膠原纖維任能保持較好的組織結構，大大約束了縫合線的自由度。
圖3
瓣膜膜片的掃描電鏡分析
(a)EDC-P的機械切割切口；(b)EDC-P的激光切割切口；(c)CB-P的縫合力檢測后表面；(d)CL-P的縫合力檢測后表面
Figure3. Field emission scanning electron microscopy of valve membrane(a) fault surface of EDC-P after mechanical cutting; (b) fault surface of EDC-P after laser cutting; (c) marginal surface of CB-P after suture force testing; (d) marginal surface of CL-P after suture force testing
3 結論
本文根據介入瓣瓣膜膜片的在制備過程中特點，基于化學改性和切割方法對其力學性能進行了相關研究，首先分析了瓣膜膜片在化學改性過程中的交聯度變化；并在交聯作用分析的基礎上，對其拉伸力學性能進行了分析，探討了GA和EDC在瓣膜膜片膠原纖維中的交聯作用機制。結果表明：GA交聯作用中的分子間交聯作用對于判斷GA的分子內交聯作用和EDC的零長度交聯作用的程度是十分不利的，不能通過交聯度值的大小來進行瓣膜膜片力學性能的相關性比較。同時分別考慮了瓣膜膜片在切割過程中，由于切割方法的差異性對于瓣膜膜片膠原纖維的損傷性作用。這種損傷作用使得瓣膜膜片在縫合后，膠原纖維排列的各向異性遭到破壞，從而使得瓣膜膜片可承受各個方向的力學負荷減少，使得縫合線的自由度增加，嚴重影響了生物瓣的耐久性。本實驗的研究結果表明合理地選擇化學改性和瓣膜切割的方法對于生物瓣耐久性的提高具有十分重要的作用。
引言
目前，退行性和代謝性心臟瓣膜疾病的患者所占的比例日益增多，這類患者不適合手術瓣膜置換，而是介入式生物瓣置換產品的主要適用群體[1-4]，介入式生物瓣屬于生物瓣中的一個亞種類。可使患者免于開胸手術的介入式生物瓣置換產品主要由組件中的人工生物瓣膜及其輸送系統構成。介入式生物瓣主要由自膨脹的超彈性合金支架和固定在支架上的瓣膜膜片組織組成。自Cribier于2002年完成第一例臨床應用至今，介入式生物瓣從最初的不為醫生接受，到現在已成為心臟瓣膜置換的一個熱點。相應產品不斷完善，目前以Edwards公司的SAPIEN球囊擴張式主動脈瓣膜和Medtronic公司的CoreValve自擴張式主動脈瓣膜為代表，兩者都于2007年取得CE認證，2008~2009年的手術量累計超過1.6萬例。Edwards SAPIEN THV手術成功率達到97%以上，30 d死亡率在10%以下[5-6]。Medtronic CoreValve植入量目前已經超過1萬個，兩年生存率為74%左右[7-8]。除了已經上市的這兩款介入式生物瓣膜，正在研發、臨床試驗的其他生物瓣產品有將近20種[9]。各家公司有其獨特的對于瓣膜膜片的化學改性方法，基于不同化學改性方法的瓣膜膜片的鈣化性能對生物瓣植入后的耐久性具有重要意義，此外在化學改性的基礎上選擇合適的瓣膜膜片切割方法，對生物瓣的耐久性也十分重要。生物瓣植入后所處的是一個血流動力學因素十分復雜的環境[10]，這需要膜片具有優異的生物力學性能。本文主要研究瓣膜化學改性和瓣膜切割技術對于介入瓣瓣膜膜片力學性能的影響及其相關性。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
碳化亞胺(Carbodiimide,EDC)(東京化成工業株式會社)，N-羥基琥珀酰亞氨(N-Hydroxysuccinimide,NHS)(阿拉丁試劑(上海)有限公司)，透明質酸酶和2 U·mol-1、硫酸軟骨素裂解酶(上海億欣生物科技有限公司)，戊二醛(Glutaraldehyde,GA)、乙二胺四乙酸、磷酸二氫鈉(上海國藥集團化學試劑有限公司)，3/0縫合線(強生(中國)醫療器材有限公司)，其他均為國內外分析純。
Holten型超凈工作臺(美國賽默飛世爾科技公司)，LQZ型恒溫振蕩器(上海精宏實驗設備有限公司)，電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多控股公司)，R-100型激光切割機(美國Raydiance公司)，Instron5543型生物力學測試機(美國Instron試驗設備有限公司)，Quanta 200 FEG型掃描電子顯微鏡(美國FEI公司)。
1.2 試驗方法
1.2.1 瓣膜膜片材料的制備
進入豬屠宰場后，取出洗凈的保鮮桶，里面加入半桶生理鹽水，用0~4 ℃生理鹽水來清洗裁剪下的心包。沿著心臟和肺葉的交界處進行剪切工作，沿著房室溝將心包切下。心包在剪切過程中，把心臟組織，肺葉膜等組織清理后，進行脂肪層的剝離。待脂肪層剝離后，采用鑷子和剪刀去除心包表面殘留的脂肪顆粒、纖維、大血管和結締組織。心包離體后用0~4 ℃的生理鹽水低溫保存一段時間，保存時間不應超過4 h，樣品標為Fresh-P。
在交聯固定前，采用Hank's緩沖溶液清洗，以每10片心包500 mL的用量漂洗2~3 min。待心包內外沒有殘余血水后，采用1.25% EDC和0.6% NHS的緩沖溶液進行交聯固定，固定溫度4 ℃，固定時間60 h。之后再采用0.625%GA溶液進行交聯固定，固定溫度4 ℃，固定時間48 h，樣品標為EDC-P。用0.625%GA溶液常規處理的心包組織作為對照，樣品標為GA-P。
1.2.2 厚度測量
瓣膜膜片在37 ℃的酶溶液(10 U/mL透明質酸酶和2 U/mol硫酸軟骨素裂解酶的醋酸銨緩沖溶液，pH=7)中放置24 h后，用精確性達到0.01 mm的手持式測厚儀測定中央區域固定三點的厚度，取平均值作為該瓣膜膜片的厚度。
1.2.3 交聯度檢測
采用茚三酮溶液來測定瓣膜膜片的交聯度，樣本數為10。使用5 μmol/L的甘氨酸溶液做標準曲線，將10 μL膜片浸提液和300 μL去離子水混合，靜置60 min后滴加3 mL茚三酮溶液，在100 ℃下加熱20 min，待冷卻至室溫后滴加15 mL異丙醇，用紫外可見分光光度計測量570 nm下的吸光值，通過標準曲線計算瓣膜膜片中α-氨基酸的摩爾數。交聯度計算公式為：交聯度(%)=(未交聯的瓣膜膜片自由氨基酸含量－交聯的瓣膜膜片自由氨基酸含量)/未交聯的瓣膜膜片自由氨基酸含量×100%。
1.2.4 瓣膜材料的切割
瓣膜切割面積大約10 mm2，切割區域在中央纖維取向一致且厚度均勻處，切割方向沿著纖維方向。機械切割采用手術刀片切割Fresh-P、GA-P和EDC-P，樣品分別標為FB-P、GB-P和CB-P。激光切割Fresh-P、GA-P和EDC-P需要在較低的脈沖能量下進行，激光切割速度是7.5 mm/s，切割成50 mm×5 mm的瓣膜膜片，必須在瓣膜中膠原纖維組織含水量歸零之前完成激光切割過程，樣品分別標為FL-P、GL-P和CL-P。
1.2.5 拉伸力學測試
取瓣膜膜片6種，每種的樣本數為10，測試前保存在PBS緩沖溶液中。將瓣膜膜片在Instron5543型生物力學測試機做應力-應變實驗，沿著纖維排列方向加載應力。曲線選擇：負荷變形；變形傳感器：位移；試樣速度：25 mm/min；試樣標距：25 mm；測定材料的最大張力，斷裂伸長率和彈性模量等指標。整個測試過程中用PBS緩沖溶液保持瓣膜膜片的濕潤。
1.2.6 縫合力力學測試
將瓣膜膜片沿基頂線鋪開，在基頂線的垂直方向將6種瓣膜膜片裁成20 mm×10 mm的膜片，每種的樣本數為10。將膜片條一端夾在測縫合力儀器的夾子上，懸空留出10 mm長條，在距離自由端面4 mm處用3/0縫合線，圓頭針與儀器下端的固定框中打三個結。打結時，在儀器的另一端手臂上施加5 g的力。夾膜片一端的上方用PBS緩沖溶液沿著夾子浸潤膜片。膜片后面設置立體顯微鏡燈光，以便觀察。儀器的另一端手臂上施加500 g的力，并保持1 min。之后，再增加500 g的力保持1 min。期間，采用立體顯微鏡進行全程觀察。所有膜片都需承受這個力，保持樣品完整。之后緩緩地每隔10 s施加20 g力直至心包撕裂。根據施加力、心包的厚度和寬度，可得每平方毫米上有多少公斤力(按照1 kgf·mm-2=10 MPa)，即瓣膜膜片的縫合力。
1.2.7 瓣膜材料的電鏡觀察
將瓣膜膜片經過體積分數2.5%戊二醛和1%鋨酸固定，梯度酒精逐級脫水，醋酸異戊酯置換，臨界點真空干燥，噴金后掃描電鏡下觀察瓣膜膜片材料上膠原纖維的取向分布情況。
1.2.8 統計學分析
采用SPSS 13.0統計軟件，數據以均值±標準差(
2 結果與討論
2.1 瓣膜的交聯度
兩種瓣膜膜片GA-P和EDC-P交聯度測定結果分別為92.05%±3.1%、93.78%±3.2%。兩種化學改性方法組間比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。
2.2 拉伸力學檢測結果
從圖 1看出，經過化學改性后，GB-P、GL-P、CB-P和CL-P的拉伸強度均明顯大于未改性的FB-P和FL-P(P＜0.05)，說明化學交聯使組織拉伸強度明顯提高。GA使得瓣膜膜片膠原纖維中的賴氨酸和羥賴氨酸之間以化學鍵的方式連接起來，使瓣膜膜片的膠原纖維、彈性纖維和糖蛋白等形成分子內和分子間交聯，從而使處理后的膠原纖維組織力學強度有所增加。EDC交聯瓣膜膜片膠原纖維中的谷氨酸和天冬氨酸殘基中的羧基，再同其它膠原纖維中的自由氨基反應。由于EDC的小分子特性，這種交聯方式屬于零長度交聯[11]。由于EDC與膠原纖維中的羧基反應后形成O-酰基脲中間體，此中間體受賴氨酸或羥賴氨酸殘基之自由氨基的親核作用后即形成酰胺鍵交聯，釋放出1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)脲。由于O-酰基脲中間體很不穩定，容易重排形成N-酰基脲或水解形成1-乙基-3-(-甲基氨丙基)脲和羧基而影響交聯效果。NHS可與不穩定的O-基脲生成穩定的中間體NHS酯，NHS酯再與氨基功能團反應形成交聯，從而提高了交聯速率和交聯程度。EDC處理的瓣膜膜片具有較好的柔韌性、更大的延展性和更低的應力松弛。這一點可以從圖 1中CB-P和CL-P的彈性模量優于GB-P和GL-P得以體現。經過0.625%GA溶液的后續浸泡，可以改善膠原纖維組織的變硬。另外切割方法對瓣膜膜片拉伸力學性能的影響較大，主要由于在機械切割過程中，機械作用很容易對瓣膜中的膠原纖維組織產生拉扯現象，同時在切割過程中由于切割方向難控制性，切割區域周圍的膠原組織很容易被損傷，導致瓣膜膜片的拉伸力學強度受損。
圖1
瓣膜膜片的拉伸力學性能測試結果
Figure1.
Tensile testing results of valve membrane
2.3 縫合力力學檢測結果
如圖 2所示，機械切割對膠原組織的損傷作用在瓣膜膜片的縫合力力學檢測結果中尤為明顯。以GB-P和GL-P為例，其縫合力力學強度損失20%左右。化學改性方法也會使得GL-P和CL-P的縫合力力學性能有所差異，這種差異性的結果和兩者的交聯度相比呈現出相反的狀態。這也說明了不能以交聯度來判斷瓣膜膜片的力學性能。結果顯示，GL-P和CL-P組的縫合力強度明顯比未改性的FB-P和FL-P大(P＜0.05)，說明化學交聯和激光切割使組織縫合力強度明顯提高。由于在GA溶液中，GA單體的聚合作用可以使得GA聚合成不同長度的聚合體，這就會產生兩種交聯作用：一種是分子內交聯，它是在同一個膠原纖維螺旋內兩條肽鏈之間形成的交聯作用，這類交聯鍵主要影響交聯產物的變性溫度和拉伸強度等性能；另一種是分子間交聯，它是在兩條相鄰的螺旋間的肽鏈中形成的交聯鍵[12-13]，這類交聯作用主要影響交聯產物的溶脹性和表面延伸性。當兩條微纖維之間的距離小于交聯劑分子的長度時，交聯也可以在兩條相鄰的微纖維之間發生。正是由于膠原纖維的分子間交聯作用的存在導致了不能單純依靠交聯度來判斷瓣膜膜片的力學性能。在激光切割過程中切割部分的膠原纖維組織會出現瞬間的缺水現象，所產生的熱效應會使得膠原纖維組織發生交聯作用，使得瓣膜切割邊界硬度增加。這在一定程度上提高了瓣膜膜片的縫合力力學強度，減小了瓣膜膜片的彈性模量。
圖2
瓣膜膜片的縫合力力學性能測試結果
Figure2.
Suture force testing results of valve membrane
2.4 瓣膜材料的掃描電鏡觀察結果
豬心包組織主要由漿膜層、纖維層和外心包結締組織層構成，纖維層由多層膠原纖維組成。由圖 3(a)和圖 3(b)可見，瓣膜膜片的表面主要由致密而纖細的膠原纖維組成。膠原纖維束以不同的方向排列，總體呈現出波浪狀形狀[14-15]。圖 3(a)機械切割的切割面十分不規則，由于切割過程中的膠原纖維拉扯作用，其切口表面膠原纖維排列不整齊，存在膠原纖維突出現象。這就使得瓣膜膜片在縫合力力學檢測過程中膠原纖維很容易發生斷裂作用，縫合線自由度大大增加;如圖 3(c)所示，瓣膜膜片在經過縫合線剪切作用后，其表面膠原纖維排列紊亂，規整形態遭到嚴重破壞。圖 3(b)激光切割的切割面膠原纖維排列十分整齊，無膠原纖維突出現象，其表面膠原纖維排列均無明顯紊亂和斷裂現象;如圖 3(d)所示，瓣膜膜片在經過縫合線剪切作用后，大部分膠原纖維任能保持較好的組織結構，大大約束了縫合線的自由度。
圖3
瓣膜膜片的掃描電鏡分析
(a)EDC-P的機械切割切口；(b)EDC-P的激光切割切口；(c)CB-P的縫合力檢測后表面；(d)CL-P的縫合力檢測后表面
Figure3. Field emission scanning electron microscopy of valve membrane(a) fault surface of EDC-P after mechanical cutting; (b) fault surface of EDC-P after laser cutting; (c) marginal surface of CB-P after suture force testing; (d) marginal surface of CL-P after suture force testing
3 結論
本文根據介入瓣瓣膜膜片的在制備過程中特點，基于化學改性和切割方法對其力學性能進行了相關研究，首先分析了瓣膜膜片在化學改性過程中的交聯度變化；并在交聯作用分析的基礎上，對其拉伸力學性能進行了分析，探討了GA和EDC在瓣膜膜片膠原纖維中的交聯作用機制。結果表明：GA交聯作用中的分子間交聯作用對于判斷GA的分子內交聯作用和EDC的零長度交聯作用的程度是十分不利的，不能通過交聯度值的大小來進行瓣膜膜片力學性能的相關性比較。同時分別考慮了瓣膜膜片在切割過程中，由于切割方法的差異性對于瓣膜膜片膠原纖維的損傷性作用。這種損傷作用使得瓣膜膜片在縫合后，膠原纖維排列的各向異性遭到破壞，從而使得瓣膜膜片可承受各個方向的力學負荷減少，使得縫合線的自由度增加，嚴重影響了生物瓣的耐久性。本實驗的研究結果表明合理地選擇化學改性和瓣膜切割的方法對于生物瓣耐久性的提高具有十分重要的作用。
