膠原蛋白(Coll)作為細胞生長支架基質,在再生醫學和組織工程學領域得到廣泛應用。本研究以L-賴氨酸(Lys)修飾膠原蛋白,并采用京尼平(GN)交聯的方式,制備Lys修飾膠原蛋白(Lys-Coll-GN)支架,考察支架的微結構、孔徑、孔隙率、穩定性和生物相容性。研究發現:Lys-Coll-GN支架的Lys與膠原蛋白分子間通過形成酰胺鍵相連,小鼠胚胎成纖維細胞在制備的Lys-Coll-GN支架上增殖未受抑制;Coll支架、京尼平交聯膠原蛋白(Coll-GN)支架與Lys-Coll-GN支架的組間比較結果顯示Coll支架力學性能最差且生物降解速率最高;與Coll-GN支架相比,Lys-Coll-GN支架纖維結構增多,孔隙率高,斷裂拉伸力減少但斷裂拉伸長度顯著增加(均P＜0.01);使用膠原蛋白酶降解5 d后,Lys-Coll-GN支架各時間點的降解剩余質量率略有降低(均P＜0.05)。實驗提示,Lys-Coll-GN支架在滿足對細胞良好增殖特性的同時,有效改善了Coll支架的力學性能及降解速率。本研究或可為再生醫學提供一種更有優勢的新型組織工程支架材料。
引用本文： 姜東林, 楊駿宇, 姜升陽, 呂國忠, 趙朋. 京尼平交聯L-賴氨酸修飾膠原蛋白支架的性能和生物相容性. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(4): 816-821. doi: 10.7507/1001-5515.20140153 復制
引言
膠原蛋白(collagen，Coll)是動物結締組織的主要結構成分，可形成細胞外支架，維持組織和器官形態的完整性。將其作為生物工程材料，具有低免疫原性，良好的細胞相容性和組織相容性等特性。它還可促進細胞的黏附和增殖，誘導細胞分化，為組織細胞生長提供支架[1-3]。同時，由于Coll降解后可被機體吸收，不會對機體造成傷害[4]，并能加速創傷的愈合，在創面愈合、修復以及創面止血中用途廣泛。但Coll材料力學性能較差、降解速率較快等缺點降低了其修復效果，限制了其臨床應用。本研究對Coll進行L-賴氨酸(L-lysine，Lys)化修飾，以京尼平(genipin，GN)為交聯劑[5]，制備新型的L-賴氨酸化膠原蛋白(Lys-Coll-GN)支架，并探討其特性。
1 材料和方法
1.1 主要材料和試劑
Coll(鼠尾中提取，實驗室自制)；GN(化學純，臨川之信生物科技有限公司)；Lys(Sigma公司)；胎牛血清、DMEM培養基(GIBCO BRL公司)；上皮細胞生長因子(EGF，Pepro Tech公司)；堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，Pepro Tech公司)；胰蛋白酶(5 U/mg，Amresco公司)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，Sigma公司)；N-羥基丁二酰亞胺(NHS，Sigma公司)；細胞增殖試劑盒(CCK-8/WST-8試劑盒，碧云天生物技術研究所)。
1.2 實驗方法
1.2.1 鼠尾膠原蛋白的制備
取新鮮大白鼠尾腱10 g，置于1∶1 000新潔爾滅液內浸泡消毒15 min，取出后以生理鹽水反復沖洗5次以上。用剪刀修剪成1 mm3左右的組織塊，置于錐形瓶中，加入含1 mol/L NaCl的0.05 mol/L Tris/HCl(pH 7.5)溶液100 mL進行提取，除去非膠原雜質。在4 ℃冰箱內放置4 d，每天定時振搖4~6次。4 d后棄去上清液，加入0.5 mol/L乙酸400 mL，4 ℃下提取4 d，定時振搖，然后高速低溫離心3 h(2 000 g)，去除不溶解的碎片，其上清液即為液態粗制膠原。在粗制膠原液中加入等量的20% NaCl液，膠原即以白色絮狀沉淀析出，2 000 g高速離心3 h，以生理鹽水清洗沉淀物數遍后，將膠原沉淀物再次溶入400 mL 0.5 mol/L乙酸內，放入透析袋內用10倍體積的三蒸水透析2 d，排除鈉離子和氯離子，每天換蒸餾水2次，最后將膠原液2 000 g離心過夜，吸取上清液即為精制膠原液貯存于4 ℃冰箱內。
1.2.2 Lys-Coll-GN支架的制備
將10 mL Coll和7.5 mL Lys混合(Coll終濃度為2 mg/mL；Lys終濃度為5 mmol/L)，37 ℃下孵育3 h，加入EDC(10 mmol/L)/NHS(10 mmol/L)的去離子水溶液，37 ℃下孵育3 h后形成凝膠狀半固體。將半固體浸泡在100 mL的GN溶液(10 mmol/L)中，室溫放置24 h。以PBS溶液沖洗產物，除去剩余的EDC、NHS和GN等。液氮冷凍后，真空冷凍干燥得Lys-Coll-GN支架。同時制備京尼平交聯無賴氨酸修飾的膠原蛋白(Coll-GN)支架和未經京尼平交聯的膠原蛋白(Coll)支架作為對照。
1.2.3 紅外光譜分析
采用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法(FTIR-470 型，Nicolet公司)測定支架的紅外吸收光譜，波數范圍為4 000~400 cm-1。
1.2.4 掃描電鏡觀察
將支架材料進行噴金處理，在15 kV的加速電壓下，以掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察支架的結構。
1.2.5 孔徑和孔隙率測試
用AutoPore IV9500型壓汞儀測試支架的孔徑和孔隙率，以AutoPore IV9500軟件進行數據處理。
1.2.6 機械強度檢測
將支架制備成長方體狀，尺寸為40 mm×10 mm×2 mm(厚)，以萬能試驗機(Instron 3365)測試支架的拉伸性能，橫梁位移速度為5 mm/min，測定樣品斷裂時的應力和應變，每種支架平行測定5個樣品。
1.2.7 體外降解實驗
取一定質量的支架材料分別置于膠原蛋白酶溶液(200 μg/mL)中，37 ℃孵育。分別于1、2、3、5、7、10、15 d取樣，蒸餾水沖洗后冷凍干燥并稱重。計算剩余質量比。剩余質量率(%)=Mt/M0×100%(Mt為取樣點質量,M0為孵育前質量)。
1.2.8 細胞培養實驗
選擇清潔級BALB/c小鼠胚胎成纖維細胞，用以考察Lys-Coll-GN支架的生物相容性。小鼠胚胎成纖維細胞的原代培養以參考文獻[6]方法進行。原代培養后，用0.25%胰酶-EDTA溶液消化對數生長期的第二代細胞，離心后，用完全DMEM培養基將細胞密度稀釋為5×104個/mL。用6 mm的打孔器將Lys-Coll-GN裁為直徑6 mm的膜，置于96 孔板孔底，并以空孔作為對照。向每孔加入100 μL細胞液，靜置5 min后，補加100 μL培養基，在37 ℃、5% CO2的環境中培養。并于接種1、3和7 d后更換培養基。
培養1、3和7 d后，棄去細胞培養液，加入180 μL DMEM和20 μL CCK-8反應液，繼續孵育2 h，每孔吸取100 μL反應液加入新96孔板于450 nm測定吸光度，作為判斷細胞增殖活性的定量指標。
SEM觀察：小鼠胚胎成纖維細胞在Lys-Coll-GN支架中培養7 d后，用適量PBS潤洗，加入200 μL、體積分數2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液，室溫下放置1 h后，用PBS潤洗后，依次用60%、70%、80%和90%酒精進行脫水處理，每次5 min。然后用純乙醇脫水7 min。除去乙醇后，將細胞和支架放在通風櫥中晾干后，表面噴金后進行SEM觀察。
以倒置顯微鏡觀察96孔板貼壁培養的小鼠胚胎成纖維細胞。
1.3 統計學方法
檢測數據以
2 結果
2.1 Lys-Coll-GN與Coll的紅外吸收光譜比較
經傅里葉變換衰減全反射紅外光譜(FT-IR)測定，如圖 1所示，Coll的紅外吸收光譜特征峰包括：-CH2伸縮振動的2 853 cm-1處吸收峰，-CH2反對稱伸縮振動的2 929 cm-1處吸收峰，酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ的1 659 cm-1、1 565 cm-1和1 263 cm-1處吸收峰。-CH彎曲振動的1 470 cm-1處吸收峰，-CH2彎曲振動的1 455 cm-1處吸收峰，-COO-伸縮振動的1404 cm-1處吸收峰； Lys-Coll-GN的紅外吸收光譜與Coll相近，其除具有Coll的特征峰外，還增加了一些特征峰或在Coll特征峰基礎上的改變：酰胺Ⅰ吸收峰(1 659 cm-1)輕度減弱(賴氨酸與Coll的羧基所發生的反應)；C-N伸縮振動的1 107 cm-1和1 373 cm-1處吸收峰(GN與Coll中賴氨酸和精氨酸等的胺基交聯)；GN在993、1 083 和1 638 cm-1處特征吸收峰被Coll的強吸收峰掩蓋。
圖1
Lys-Coll-GN與Coll的紅外吸收光譜比較
Figure1.
FT-IR spectrums of genipin cross-linked Lys-Coll-GN and Coll molecule
2.2 Lys-Coll-GN與Coll-GN支架的微觀結構比較
掃描電鏡下，Lys-Coll-GN與Coll-GN支架均呈連通的三維多孔結構，但Lys-Coll-GN支架孔壁不規整，纖維結構增加；而Coll-GN支架孔壁規整、平滑，纖維結構不明顯，20 nm以下的小孔很少，如圖 2所示。
圖2
Lys-Coll-GN(左)及Coll-GN支架(右)的微觀結構比較(SEM)
Figure2.
Morphology of Lys-Coll-GN (left) and Coll-GN (right) observed by SEM
2.3 Lys-Coll-GN與Coll-GN支架孔徑和孔隙率比較
盡管Lys-Coll-GN及Coll-GN支架的孔徑差異無統計學意義，但Lys-Coll-GN支架的孔隙率顯著大于Coll-GN支架(P＜0.01)，如表 1所示。
表1
Lys-Coll-GN及Coll-GN支架的孔徑和孔隙率比較
Table1.
Pore size and porosity of Lys-Coll-GN and Coll-GN scaffolds
2.4 Lys-Coll-GN與Coll-GN、Coll支架的抗張強度比較
Lys-Coll-GN支架斷裂拉伸力(261±15) kPa低于Coll-GN支架[(305±16) kPa，P＜0.01]，但顯著高于Coll支架[(198±13) kPa，P＜0.01]；在斷裂拉伸長度的比較上，Lys-Coll-GN支架(24.4%±3.5%)顯著高于Coll-GN (16.3%±3.6%，P＜0.01)及Coll支架(10.3%±1.8%，P＜0.01)。
2.5 Lys-Coll-GN與Coll-GN、Coll支架的生物降解特性比較
在膠原蛋白酶溶液中，Coll支架3 d后完全溶解，而第5 d起Lys-Coll-GN支架降解剩余質量率在相同時間點均低于Coll-GN支架(均P＜0.05)，15 d后該兩種支架的剩余質量率分別為38.2%±4.6%和46.7%±3.2%。整體表現出Lys-Coll-GN支架與Coll-GN支架相對于Coll支架有較低的生物降解速率，其體外降解曲線如圖 3所示。
圖3
Lys-Coll-GN與Coll-GN、Coll支架的體外降解曲線比較
Figure3.
Comparison of in vitro degradation curves of Lys-Coll-GN,Coll-GN and Coll scaffolds
2.6 Lys-Coll-GN支架與細胞培養板的細胞培養增殖性比較
細胞培養增殖性實驗中，小鼠胚胎成纖維細胞在Lys-Coll-GN支架及常規細胞培養板上培養1、3及7 d均呈現良好的增殖趨勢，貼壁生長形態良好，且相同時間點細胞在Lys-Coll-GN支架與常規細胞培養板培養的CCK-8試驗OD值比較差異無統計學意義(均P＞0.05)，顯示Lys-Coll-GN支架對細胞增殖無抑制性作用，如圖 4、5所示。
圖4
小鼠胚胎成纖維細胞在培養板(左)和Lys-Coll-GN支架上(右)培養7 d后的形態
Figure4.
The morphology and metabolic activity of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) cultured for 7days on the culture plate (left) and Lys-Coll-GN (right) scaffolds
圖5
小鼠胚胎成纖維細胞在培養板和Lys-Coll-GN支架上培養1、3和7 d后的代謝活性
Figure5.
Metabolic activity of MEFs cultured on the culture plate and Lys-Coll-GN scaffold after 1,3 and 7 days,respectively
3 討論
Coll是由三條左旋α-肽鏈相互作用緊密右旋而成，其氨基酸肽鏈可用(Gly-X-Y)n來表示(X，Y為任意其它氨基酸)，三條肽鏈間借助Gly中的N-H基與鄰近鏈X殘基上的羥基形成牢固氫鍵穩定其分子結構。膠原蛋白分子平行成束狀排列，經Lys與His間的氫鍵連接成穩定的膠原微纖維，并繼續聚集成不溶性的膠原纖維，Lys在其間起了特色連接作用[7]。膠原蛋白分子的三條螺旋鏈立體構象與Coll的特定生物功能和力學特性有關，當其被加工、修飾后其生物學特性也隨之發生改變[8-10]。
GN屬于環烯醚萜類化合物，存在羧基、羥基等多個活性基團，能以多分子/單分子形式與Coll進行廣泛交聯，同時具有良好的生物相容性[11-12]。本研究采用Lys對Coll肽鏈的羧基進行修飾，以GN與Coll中賴氨酸和精氨酸等的胺基氫鍵連接，形成新型的Lys-Coll-GN支架。研究發現，Lys-Coll-GN的Lys與膠原蛋白分子之間通過形成酰胺鍵相連，在掃描電鏡上表現為孔壁不規整，纖維結構增加，使得支架板狀結構減弱，該支架對比于Coll-GN支架出現孔隙率、斷裂拉伸長度增大，斷裂拉伸力降低的現象(P＜0.01)。這主要是由于Lys修飾Coll，形成寡肽側鏈，阻礙交聯過程中膠原分子的聚集，同時使得膠原蛋白分子的三條螺旋鏈結構弱化，分子間作用減弱，抑制膠原蛋白分子結晶區的形成(宏觀上即板狀結構的形成)，京尼平分子同時與Lys和原Coll交聯，出現更大的分子空間，從而提高了材料的孔徑和孔隙率[13] ，這利于細胞黏附、遷移以及營養物質/代謝產物的擴散，對于組織再生有重要意義。一般情況下，降低Coll溶液密度可增加膠原蛋白基支架的孔徑和孔隙率，但該情況下又會削弱支架的穩定性[14]，本研究通過Lys修飾后產生更多的交聯位點，使膠原分子間的酰胺鍵密度增加，廣泛交聯后提高了材料的穩定性。這樣使得該支架在空間上更適于細胞的黏附增殖，同時改善了力學性能，增加了柔韌性。
臨床組織修復上，良好的組織修復支架的降解速度應該與創面愈合時間相匹配，學者的研究發現較為嚴重的創面應用膠原蛋白基材料的創面愈合時間一般在2~3周左右[15-17]。本研究中純Coll材料3 d后完全降解，而Lys-Coll-GN與Coll-GN支架15 d后的剩余質量率分別為38.2%±4.6%和46.7%±3.2%，均表現出相對于Coll支架的低生物降解速率，更適合于作為創傷修復材料。這在機制上主要是由于GN交聯以后掩蓋了原膠原蛋白的多數酶切位點，膠原蛋白酶的分解作用開始只能在表面進行，而無法充分與膠原蛋白分子接觸，從而減慢了Coll的降解。本研究同時發現，Lys-Coll-GN支架第5 d后相同時間點的降解剩余質量率均低于Coll-GN支架(均為P＜0.05)，這主要是由于Lys修飾后Lys-Coll-GN支架整體空間結構的改變，物質通透性增強，膠原蛋白酶的擴散較Coll-GN支架內部有所加快。另外，Lys修飾和GN的引入并未使Coll材料產生毒性，細胞在Lys-Coll-GN支架上增殖良好，未見對細胞增殖的抑制作用，也與其他學者對改性Coll的研究相一致[18-19]，表明Lys-Coll-GN支架具有良好的生物相容性。
綜上所述，Lys-Coll-GN支架在滿足對細胞良好增殖特性的同時，有效改善了膠原蛋白基支架的力學性能和降解特性，這就為后續的創傷修復提供了一種性能優良的組織工程支架材料。
引言
膠原蛋白(collagen，Coll)是動物結締組織的主要結構成分，可形成細胞外支架，維持組織和器官形態的完整性。將其作為生物工程材料，具有低免疫原性，良好的細胞相容性和組織相容性等特性。它還可促進細胞的黏附和增殖，誘導細胞分化，為組織細胞生長提供支架[1-3]。同時，由于Coll降解后可被機體吸收，不會對機體造成傷害[4]，并能加速創傷的愈合，在創面愈合、修復以及創面止血中用途廣泛。但Coll材料力學性能較差、降解速率較快等缺點降低了其修復效果，限制了其臨床應用。本研究對Coll進行L-賴氨酸(L-lysine，Lys)化修飾，以京尼平(genipin，GN)為交聯劑[5]，制備新型的L-賴氨酸化膠原蛋白(Lys-Coll-GN)支架，并探討其特性。
1 材料和方法
1.1 主要材料和試劑
Coll(鼠尾中提取，實驗室自制)；GN(化學純，臨川之信生物科技有限公司)；Lys(Sigma公司)；胎牛血清、DMEM培養基(GIBCO BRL公司)；上皮細胞生長因子(EGF，Pepro Tech公司)；堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，Pepro Tech公司)；胰蛋白酶(5 U/mg，Amresco公司)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，Sigma公司)；N-羥基丁二酰亞胺(NHS，Sigma公司)；細胞增殖試劑盒(CCK-8/WST-8試劑盒，碧云天生物技術研究所)。
1.2 實驗方法
1.2.1 鼠尾膠原蛋白的制備
取新鮮大白鼠尾腱10 g，置于1∶1 000新潔爾滅液內浸泡消毒15 min，取出后以生理鹽水反復沖洗5次以上。用剪刀修剪成1 mm3左右的組織塊，置于錐形瓶中，加入含1 mol/L NaCl的0.05 mol/L Tris/HCl(pH 7.5)溶液100 mL進行提取，除去非膠原雜質。在4 ℃冰箱內放置4 d，每天定時振搖4~6次。4 d后棄去上清液，加入0.5 mol/L乙酸400 mL，4 ℃下提取4 d，定時振搖，然后高速低溫離心3 h(2 000 g)，去除不溶解的碎片，其上清液即為液態粗制膠原。在粗制膠原液中加入等量的20% NaCl液，膠原即以白色絮狀沉淀析出，2 000 g高速離心3 h，以生理鹽水清洗沉淀物數遍后，將膠原沉淀物再次溶入400 mL 0.5 mol/L乙酸內，放入透析袋內用10倍體積的三蒸水透析2 d，排除鈉離子和氯離子，每天換蒸餾水2次，最后將膠原液2 000 g離心過夜，吸取上清液即為精制膠原液貯存于4 ℃冰箱內。
1.2.2 Lys-Coll-GN支架的制備
將10 mL Coll和7.5 mL Lys混合(Coll終濃度為2 mg/mL；Lys終濃度為5 mmol/L)，37 ℃下孵育3 h，加入EDC(10 mmol/L)/NHS(10 mmol/L)的去離子水溶液，37 ℃下孵育3 h后形成凝膠狀半固體。將半固體浸泡在100 mL的GN溶液(10 mmol/L)中，室溫放置24 h。以PBS溶液沖洗產物，除去剩余的EDC、NHS和GN等。液氮冷凍后，真空冷凍干燥得Lys-Coll-GN支架。同時制備京尼平交聯無賴氨酸修飾的膠原蛋白(Coll-GN)支架和未經京尼平交聯的膠原蛋白(Coll)支架作為對照。
1.2.3 紅外光譜分析
采用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法(FTIR-470 型，Nicolet公司)測定支架的紅外吸收光譜，波數范圍為4 000~400 cm-1。
1.2.4 掃描電鏡觀察
將支架材料進行噴金處理，在15 kV的加速電壓下，以掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察支架的結構。
1.2.5 孔徑和孔隙率測試
用AutoPore IV9500型壓汞儀測試支架的孔徑和孔隙率，以AutoPore IV9500軟件進行數據處理。
1.2.6 機械強度檢測
將支架制備成長方體狀，尺寸為40 mm×10 mm×2 mm(厚)，以萬能試驗機(Instron 3365)測試支架的拉伸性能，橫梁位移速度為5 mm/min，測定樣品斷裂時的應力和應變，每種支架平行測定5個樣品。
1.2.7 體外降解實驗
取一定質量的支架材料分別置于膠原蛋白酶溶液(200 μg/mL)中，37 ℃孵育。分別于1、2、3、5、7、10、15 d取樣，蒸餾水沖洗后冷凍干燥并稱重。計算剩余質量比。剩余質量率(%)=Mt/M0×100%(Mt為取樣點質量,M0為孵育前質量)。
1.2.8 細胞培養實驗
選擇清潔級BALB/c小鼠胚胎成纖維細胞，用以考察Lys-Coll-GN支架的生物相容性。小鼠胚胎成纖維細胞的原代培養以參考文獻[6]方法進行。原代培養后，用0.25%胰酶-EDTA溶液消化對數生長期的第二代細胞，離心后，用完全DMEM培養基將細胞密度稀釋為5×104個/mL。用6 mm的打孔器將Lys-Coll-GN裁為直徑6 mm的膜，置于96 孔板孔底，并以空孔作為對照。向每孔加入100 μL細胞液，靜置5 min后，補加100 μL培養基，在37 ℃、5% CO2的環境中培養。并于接種1、3和7 d后更換培養基。
培養1、3和7 d后，棄去細胞培養液，加入180 μL DMEM和20 μL CCK-8反應液，繼續孵育2 h，每孔吸取100 μL反應液加入新96孔板于450 nm測定吸光度，作為判斷細胞增殖活性的定量指標。
SEM觀察：小鼠胚胎成纖維細胞在Lys-Coll-GN支架中培養7 d后，用適量PBS潤洗，加入200 μL、體積分數2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液，室溫下放置1 h后，用PBS潤洗后，依次用60%、70%、80%和90%酒精進行脫水處理，每次5 min。然后用純乙醇脫水7 min。除去乙醇后，將細胞和支架放在通風櫥中晾干后，表面噴金后進行SEM觀察。
以倒置顯微鏡觀察96孔板貼壁培養的小鼠胚胎成纖維細胞。
1.3 統計學方法
檢測數據以
2 結果
2.1 Lys-Coll-GN與Coll的紅外吸收光譜比較
經傅里葉變換衰減全反射紅外光譜(FT-IR)測定，如圖 1所示，Coll的紅外吸收光譜特征峰包括：-CH2伸縮振動的2 853 cm-1處吸收峰，-CH2反對稱伸縮振動的2 929 cm-1處吸收峰，酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ的1 659 cm-1、1 565 cm-1和1 263 cm-1處吸收峰。-CH彎曲振動的1 470 cm-1處吸收峰，-CH2彎曲振動的1 455 cm-1處吸收峰，-COO-伸縮振動的1404 cm-1處吸收峰； Lys-Coll-GN的紅外吸收光譜與Coll相近，其除具有Coll的特征峰外，還增加了一些特征峰或在Coll特征峰基礎上的改變：酰胺Ⅰ吸收峰(1 659 cm-1)輕度減弱(賴氨酸與Coll的羧基所發生的反應)；C-N伸縮振動的1 107 cm-1和1 373 cm-1處吸收峰(GN與Coll中賴氨酸和精氨酸等的胺基交聯)；GN在993、1 083 和1 638 cm-1處特征吸收峰被Coll的強吸收峰掩蓋。
圖1
Lys-Coll-GN與Coll的紅外吸收光譜比較
Figure1.
FT-IR spectrums of genipin cross-linked Lys-Coll-GN and Coll molecule
2.2 Lys-Coll-GN與Coll-GN支架的微觀結構比較
掃描電鏡下，Lys-Coll-GN與Coll-GN支架均呈連通的三維多孔結構，但Lys-Coll-GN支架孔壁不規整，纖維結構增加；而Coll-GN支架孔壁規整、平滑，纖維結構不明顯，20 nm以下的小孔很少，如圖 2所示。
圖2
Lys-Coll-GN(左)及Coll-GN支架(右)的微觀結構比較(SEM)
Figure2.
Morphology of Lys-Coll-GN (left) and Coll-GN (right) observed by SEM
2.3 Lys-Coll-GN與Coll-GN支架孔徑和孔隙率比較
盡管Lys-Coll-GN及Coll-GN支架的孔徑差異無統計學意義，但Lys-Coll-GN支架的孔隙率顯著大于Coll-GN支架(P＜0.01)，如表 1所示。
表1
Lys-Coll-GN及Coll-GN支架的孔徑和孔隙率比較
Table1.
Pore size and porosity of Lys-Coll-GN and Coll-GN scaffolds
2.4 Lys-Coll-GN與Coll-GN、Coll支架的抗張強度比較
Lys-Coll-GN支架斷裂拉伸力(261±15) kPa低于Coll-GN支架[(305±16) kPa，P＜0.01]，但顯著高于Coll支架[(198±13) kPa，P＜0.01]；在斷裂拉伸長度的比較上，Lys-Coll-GN支架(24.4%±3.5%)顯著高于Coll-GN (16.3%±3.6%，P＜0.01)及Coll支架(10.3%±1.8%，P＜0.01)。
2.5 Lys-Coll-GN與Coll-GN、Coll支架的生物降解特性比較
在膠原蛋白酶溶液中，Coll支架3 d后完全溶解，而第5 d起Lys-Coll-GN支架降解剩余質量率在相同時間點均低于Coll-GN支架(均P＜0.05)，15 d后該兩種支架的剩余質量率分別為38.2%±4.6%和46.7%±3.2%。整體表現出Lys-Coll-GN支架與Coll-GN支架相對于Coll支架有較低的生物降解速率，其體外降解曲線如圖 3所示。
圖3
Lys-Coll-GN與Coll-GN、Coll支架的體外降解曲線比較
Figure3.
Comparison of in vitro degradation curves of Lys-Coll-GN,Coll-GN and Coll scaffolds
2.6 Lys-Coll-GN支架與細胞培養板的細胞培養增殖性比較
細胞培養增殖性實驗中，小鼠胚胎成纖維細胞在Lys-Coll-GN支架及常規細胞培養板上培養1、3及7 d均呈現良好的增殖趨勢，貼壁生長形態良好，且相同時間點細胞在Lys-Coll-GN支架與常規細胞培養板培養的CCK-8試驗OD值比較差異無統計學意義(均P＞0.05)，顯示Lys-Coll-GN支架對細胞增殖無抑制性作用，如圖 4、5所示。
圖4
小鼠胚胎成纖維細胞在培養板(左)和Lys-Coll-GN支架上(右)培養7 d后的形態
Figure4.
The morphology and metabolic activity of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) cultured for 7days on the culture plate (left) and Lys-Coll-GN (right) scaffolds
圖5
小鼠胚胎成纖維細胞在培養板和Lys-Coll-GN支架上培養1、3和7 d后的代謝活性
Figure5.
Metabolic activity of MEFs cultured on the culture plate and Lys-Coll-GN scaffold after 1,3 and 7 days,respectively
3 討論
Coll是由三條左旋α-肽鏈相互作用緊密右旋而成，其氨基酸肽鏈可用(Gly-X-Y)n來表示(X，Y為任意其它氨基酸)，三條肽鏈間借助Gly中的N-H基與鄰近鏈X殘基上的羥基形成牢固氫鍵穩定其分子結構。膠原蛋白分子平行成束狀排列，經Lys與His間的氫鍵連接成穩定的膠原微纖維，并繼續聚集成不溶性的膠原纖維，Lys在其間起了特色連接作用[7]。膠原蛋白分子的三條螺旋鏈立體構象與Coll的特定生物功能和力學特性有關，當其被加工、修飾后其生物學特性也隨之發生改變[8-10]。
GN屬于環烯醚萜類化合物，存在羧基、羥基等多個活性基團，能以多分子/單分子形式與Coll進行廣泛交聯，同時具有良好的生物相容性[11-12]。本研究采用Lys對Coll肽鏈的羧基進行修飾，以GN與Coll中賴氨酸和精氨酸等的胺基氫鍵連接，形成新型的Lys-Coll-GN支架。研究發現，Lys-Coll-GN的Lys與膠原蛋白分子之間通過形成酰胺鍵相連，在掃描電鏡上表現為孔壁不規整，纖維結構增加，使得支架板狀結構減弱，該支架對比于Coll-GN支架出現孔隙率、斷裂拉伸長度增大，斷裂拉伸力降低的現象(P＜0.01)。這主要是由于Lys修飾Coll，形成寡肽側鏈，阻礙交聯過程中膠原分子的聚集，同時使得膠原蛋白分子的三條螺旋鏈結構弱化，分子間作用減弱，抑制膠原蛋白分子結晶區的形成(宏觀上即板狀結構的形成)，京尼平分子同時與Lys和原Coll交聯，出現更大的分子空間，從而提高了材料的孔徑和孔隙率[13] ，這利于細胞黏附、遷移以及營養物質/代謝產物的擴散，對于組織再生有重要意義。一般情況下，降低Coll溶液密度可增加膠原蛋白基支架的孔徑和孔隙率，但該情況下又會削弱支架的穩定性[14]，本研究通過Lys修飾后產生更多的交聯位點，使膠原分子間的酰胺鍵密度增加，廣泛交聯后提高了材料的穩定性。這樣使得該支架在空間上更適于細胞的黏附增殖，同時改善了力學性能，增加了柔韌性。
臨床組織修復上，良好的組織修復支架的降解速度應該與創面愈合時間相匹配，學者的研究發現較為嚴重的創面應用膠原蛋白基材料的創面愈合時間一般在2~3周左右[15-17]。本研究中純Coll材料3 d后完全降解，而Lys-Coll-GN與Coll-GN支架15 d后的剩余質量率分別為38.2%±4.6%和46.7%±3.2%，均表現出相對于Coll支架的低生物降解速率，更適合于作為創傷修復材料。這在機制上主要是由于GN交聯以后掩蓋了原膠原蛋白的多數酶切位點，膠原蛋白酶的分解作用開始只能在表面進行，而無法充分與膠原蛋白分子接觸，從而減慢了Coll的降解。本研究同時發現，Lys-Coll-GN支架第5 d后相同時間點的降解剩余質量率均低于Coll-GN支架(均為P＜0.05)，這主要是由于Lys修飾后Lys-Coll-GN支架整體空間結構的改變，物質通透性增強，膠原蛋白酶的擴散較Coll-GN支架內部有所加快。另外，Lys修飾和GN的引入并未使Coll材料產生毒性，細胞在Lys-Coll-GN支架上增殖良好，未見對細胞增殖的抑制作用，也與其他學者對改性Coll的研究相一致[18-19]，表明Lys-Coll-GN支架具有良好的生物相容性。
綜上所述，Lys-Coll-GN支架在滿足對細胞良好增殖特性的同時，有效改善了膠原蛋白基支架的力學性能和降解特性，這就為后續的創傷修復提供了一種性能優良的組織工程支架材料。
