研究地塞米松(DEX)對順鉑(CDDP)引起的人肺腺癌細胞SPC-A1凋亡的抑制作用及可能的分子機制。將不同濃度的DEX分別加入人肺腺癌細胞SPC-A1體外誘導培養24 h后,再用不同濃度CDDP處理SPC-A1細胞48 h。MTT法檢測細胞存活率;RT-PCR方法檢測1 μmol/L DEX誘導培養不同時間后SPC-A1細胞內血清/糖皮質激素-誘導激酶(SGK-1)和有絲分裂原蛋白激酶(MKP-1)的表達;用生物素標記的抗糖皮質激素受體(GR)抗體對SPC-A1細胞行免疫組化染色來檢測GR的表達。MTT測定結果顯示,SPC-A1細胞經DEX誘導后,對CDDP所致的凋亡有抵抗作用并與DEX濃度呈劑量依賴關系。RT-PCR檢測到DEX誘導培養能提高SGK-1在SPC-A1細胞中的表達,表達量隨時間延長而增加;但未檢測到MKP-1的表達。免疫組化檢測顯示SPC-A1細胞經DEX誘導后GR上調,細胞內GR表達的陽性細胞數明顯高于對照組。結果表明DEX對CDDP引起SPC-A1細胞的凋亡有抑制作用。可能的分子機制是通過上調細胞內GR表達,進而上調其通路下游抗凋亡蛋白SGK-1的表達,導致SPC-A1細胞產生抗凋亡作用。
引用本文： 曹菲, 張智慧. 地塞米松對順鉑誘導人肺腺癌細胞SPC-A1凋亡的抑制作用及分子機制. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(3): 652-656. doi: 10.7507/1001-5515.20140122 復制
引言
糖皮質激素(glucocorticoid,GC)是一種重要的類內源性類固醇激素，具有調節生長發育、新陳代謝、生物行為、細胞凋亡等作用[1]。地塞米松(dexamethasone,DEX)是臨床最常用的糖皮質激素類藥物之一，不僅有治療過敏性疾病與自身免疫性炎癥性疾病的功能，而且具有殺滅和抑制非實體性腫瘤的能力，很早被引入腫瘤的治療中。在19世紀70年代早期DEX就用于兒童白血病的誘導緩解和治療[2]，隨后的研究發現，DEX具有殺滅和抑制某些淋巴細胞的能力，所以被作為主要化療藥物之一用于惡性淋巴瘤化療方案中[3]。除了被用于非實體性腫瘤如白血病、淋巴瘤的化療以外，DEX還在處理腫瘤放化療相關的水腫、炎癥、疼痛、電解質失衡以及惡心、嘔吐等臨床癥狀中起到較重要的作用[4]。但近年來不斷有研究發現，DEX對卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌等多種實體腫瘤存在潛在的、誘導化療抵抗的現象，其主要表現之一是抑制化療藥物引起的腫瘤細胞凋亡[5-6]。其中，乳腺癌被DEX誘導的化療凋亡抵抗最為顯著，進一步對其抗凋亡分子機制進行研究發現，血清/糖皮質激素-誘導激酶(serum/glucocorticoid-induced kinase,SGK-1)和有絲分裂原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1,MKP-1)這兩種激酶在抗凋亡信號轉導通路中起著重要的作用[7]。也有少數研究發現，DEX對化療藥物具有增敏作用,如Wang 等[8]用裸鼠荷瘤模型發現，DEX預處理可增強阿霉素誘導腫瘤細胞的凋亡，增加腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-alpha beta,TNF-αβ)的表達，降低白介素-1(interleukin-1，IL-1)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達 。以上多種研究提示，DEX對不同腫瘤化療的協同作用可能不同，由于DEX是臨床腫瘤治療的常用藥物，確定其是否誘導腫瘤細胞產生化療藥物抗性并明確其機制，對于指導臨床用藥極為重要。
肺癌位居惡性腫瘤發病率和死亡率首位，順鉑(cisplatin,CDDP)為肺癌化療方案中最常用的藥物。我們的前期研究初步發現DEX可以誘導人非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)離體細胞及SPC-A1細胞株對CDDP的化療抵抗[9]，但未對其分子機制進行深入研究。因此，本研究體外用DEX誘導培養人肺腺癌細胞SPC-A1一定時間后，再用CDDP進行處理，進一步確定DEX對誘導CDDP化療抵抗的作用并探討其作用機制。
1 材料和方法
1.1 細胞株來源
人肺腺癌細胞株SPC-A1購自上海細胞所，培養于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素、2 mmol/L 谷氨酰胺的RPMI-1640 培養基中,培養條件為37 ℃、5% CO2。
1.2 藥品及主要試劑
CDDP，云南個舊生物藥業有限公司生產，國藥準字H53021740；DEX,天津藥業焦作有限公司，國藥準字H41020036；MTT(Sigma)；胰蛋白酶(Sigma)；TRIZOL購自Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒，購自北京天為時代科技有限公司； Rabbit Anti-GR單克隆抗體、DAB顯色試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司。
1.3 MTT法測定細胞存活率
收集呈指數生長的SPC-A1細胞，用0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化液處理，制成5×104/mL的單細胞懸液。將細胞接種于96孔培養板內，每孔100 μL，24 h貼壁后，分別加入不同濃度的DEX，24 h后再加入不同濃度的CDDP，各組分別設4個復孔。于37 ℃、5% CO2繼續培養48 h，再加入20 μL MTT(2.5 mg/mL)，于37 ℃反應4 h，棄上清，加入150 μL DMSO充分溶解，酶標儀測定λ570nm的吸光值(A)，并按下式計算細胞存活率。
| $存活率\text{( }\!\!%\!\!\text{ )=}\frac{(實驗孔A值-空白孔A值)}{(對照孔A值-空白孔A值)}\times 100%$ |
1.4 RT-PCR 檢測目的基因SGK-1、MKP-1 的表達
根據相應基因的編碼區序列，用Net Primer軟件設計SGK-1 和MKP-1引物，各目的基因引物購自Invitrogen公司。SGK-1基因引物5′-GGAGGATGGGTCTGAACGACTTTA-3′，其反義鏈為5′-AGCGTTCCCTCTGGAGATGGTAGA-3′,產物大小為486 bp。MKP-1基因引物5′-CCGAGAACAGACAAAGAGCACCG-3′，其反義鏈為5′-ATACGCACTGCCCAGGTACAGAAA-3′，產物大小為620 bp。內參照物β-actin引物5′-AAGAGATGGCCACGGCTGCT-3′,其反義鏈為5′-GACTCGTCATACTCCTGCTTGCT-3′，產物大小為421 bp。
在SPC-A1細胞培養液中加入1 μmol/L DEX,設不含DEX者為陰性對照組。分別于1、2、4、6、12 h提取總RNA。反轉錄成cDNA，對目的基因用以上特異性引物進行擴增，PRC擴增條件：95 ℃ 預變性5 min，進入30個下述循環(95 ℃ 45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s)，最后再72℃延伸 4 min。擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳上鑒定。
1.5 GR的測定
接種細胞前先將96孔板預處理，200 μL血清包被孔底部及四周(包被溫度20~37 ℃，5 min)。將8×104/mL的 SPC-A1細胞懸液接種于96孔板中,每孔100 μL，24 h后除去培養液。細胞分為三組：治療組(DEX濃度1 μmol/L，作用24 h)；對照組(無GR抗體)；陰性對照組(無DEX)。培養結束后，按照公司試劑盒說明進行染色。先用95%酒精固定細胞15~20 min，除去酒精。再加5% BSA封閉液,室溫20 min,甩去多余液體,不洗。將一抗用磷酸鹽緩沖液PBS(KCl 0.2 g、KH2PO4 0.2 g、NaCl2 8.0 g、Na2HPO4·7H2O 1.56 g，加H2O 1 000 mL溶解)1∶200稀釋后，依次加入兔抗人GR一抗、生物素標記的二抗、ABC試劑DAB顯色及HE染色。顯微鏡觀察、拍片，以SPC-A1細胞胞質及胞核內出現棕黃色顆粒為陽性，每個孔內分別觀察10個高倍視野(400×)，每個高倍視野計數20~50個細胞的免疫組化或HE染色陽性細胞數，計算出每孔的陽性細胞百分數并按4個等級進行分級：陽性率＜5%為陰性；5%~25%為+；26%~50%為++；＞50%為+++。以上每孔均由兩名病理醫師雙盲觀察。
1.6 統計學處理
數據采用SPSS 13.0 統計軟件包分析處理,計量資料數據以
2 結果
2.1 DEX誘導肺腺癌細胞株SPC-A1對CDDP的化療抵抗
將SPC-A1細胞接種于96孔板中，用不同劑量(0~10 μmol/L)DEX培養24 h，再用不同濃度(0~34 μmol/L) GDDP處理48 h后，用MTT法測定細胞存活率。結果如圖 1所示，單純DEX誘導培養后，與對照組相比，細胞存活率隨著DEX濃度升高而增高，表明DEX對SPC-A1沒有細胞毒性，單獨使用DEX對腫瘤細胞有抗凋亡而促進細胞生長的作用，且表現為DEX劑量依賴性。未經DEX誘導培養的細胞，用CDDP處理后細胞存活率明顯下降，且表現出CDDP劑量依賴性，說明SPC-A1細胞對CDDP化療敏感。但是，當用不同濃度DEX誘導培養后再用CDDP處理，細胞存活率隨著DEX濃度升高而增高，表明DEX誘導了SPC-A1細胞對CDDP的抵抗。未用DEX誘導培養的對照組分別與加入0.1、1和10 μmol/L DEX的實驗組兩兩比較，細胞存活率差異均有統計學意義(P＜0.01)。
圖1
DEX誘導SPC-A1中對順鉑的抵抗作用
Figure1.
Resistance to CDDP of SPC-A1 induced by DEX
2.2 DEX誘導培養后SPC-A1中SGK-1和MKP-1基因的表達
SPC-A1經1 μmol/L DEX誘導培養不同時間后，提取RNA,用RT-PCR檢測目的基因表達。結果如圖 2所示，在誘導培養0、1、2、4、6和12 h的細胞中，均檢測到SGK-1的表達，RT-PCR均擴增出特異性條帶。進一步以β-actin表達量為內對照，將其條帶灰度設為1，計算目的基因表達量。結果發現，隨著誘導時間延長,SGK-1的表達隨之增高(如表 1和圖 2所示)。
表1
SPC-A1細胞SGK-1和β-actin灰度值及其比值
Table1.
Gray value of SGK-1 and its ratio to β-actin in SPC-A1 cell
圖2
RT-PCR檢測DEX誘導培養后SPC-A1細胞SGK-1表達
Figure2.
RT-PCR of SGK-1 in SPC-A1 cells induced by DEX
但是，在這些細胞中并未檢測到MKP-1的高表達，RT-PCR未擴增出特異性條帶，表明DEX誘導培養并未提高MKP-1基因的表達水平(見圖 3)。
圖3
RT-PCR檢測DEX誘導培養后SPC-A1細胞MKP-1的表達
Figure3.
RT-PCR of MKP-1 in SPC-A1 cells induced by DEX
2.3 GR的測定
在人肺腺癌細胞SPC-A1中，與未加GR一抗的對照組及未加DEX的陰性對照組比較，加入1 μmol/L DEX的實驗組經免疫組化和HE染色后表現為細胞質內呈現棕黃色、細胞核內呈現深棕色顆粒，且數目超過該孔的50%(見圖 4)，SPC-A1細胞內GR表達較對照組明顯增高，且呈強陽性。
圖4
免疫組化檢測SPC-A1 GR表達
(a)對照組；(b)陰性對照組；(c)治療組
Figure4. Expression of GR on SPC-A1 by immunohistochemistry(a) control group; (b) negative control group; (c) treatment group
3 討論
GC是一種至關重要的皮質類固醇激素[1]，除了直接用于非實體性腫瘤如淋巴瘤的化療以外，還用于處理腫瘤化療相關的水腫、炎癥、疼痛、電解質失衡以及惡心、嘔吐等臨床癥狀[4, 10]。有研究發現DEX可能誘導腫瘤細胞對化療藥物引起的細胞凋亡產生抵抗。雖然DEX對淋巴細胞是一種促凋亡劑，但對多種實體腫瘤細胞卻具有抗凋亡的作用。GC通過與細胞內的GR結合后，激活的GR通過一系列細胞內信號傳遞，活化或抑制基因的轉錄，從而發揮其促凋亡或抗凋亡的作用[11]。
DEX對化療藥物引起的實體性腫瘤細胞凋亡的抑制作用已經引起了國內外醫學研究人員的關注。Zhang 等[5-6]采用細胞株和腫瘤手術標本，對多種實體腫瘤進行了篩查，發現DEX可以誘導卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌等多種實體腫瘤對化療藥物的抵抗。我們研究發現DEX對人NSCLC標本及SPC-A1細胞存在顯著的化療抵抗誘導作用，并且這種化療抵抗還存在性別差異[9]。對存在化療抵抗的多種實體性腫瘤研究發現，乳腺癌對DEX誘導的化療凋亡抵抗最為顯著，Wu等[7]對乳腺癌抗凋亡分子機制進行深入研究，對DEX/紫杉醇聯合處理前后乳腺腫瘤細胞株，采用mRNA微陣列技術來分析其細胞內12 696個基因表達變化，結果顯示，乳腺腫瘤細胞經DEX誘導后，出現SGK-1和MKP-1兩個關鍵蛋白異常高度表達，對抑制化療藥物引起的細胞凋亡起決定性作用。
本研究證實，DEX可誘導人肺腺癌細胞SPC-A1對CDDP產生抵抗，其分子機制是通過抑制細胞凋亡。SPC-A1細胞經DEX誘導后，細胞內GR表達上調，因而GC-GR信號增強，使其下游通路中的SGK-1基因高度表達抗凋亡蛋白，從而誘導SPC-A1細胞對CDDP產生藥物抵抗。在時序上DEX作用以后12 h SGK-1基因表達達到高峰。然而與經DEX誘導后的乳腺癌細胞相比，抗凋亡基因MKP-1在人肺腺癌細胞SPC-A1中并未表達。GC受體的表達水平可以影響不同的信號傳導和靶基因的激活[12]。有研究顯示，乳腺上皮細胞生存其中一個重要的機制就是GR介導復制叉轉錄因子成員之一叉頭基因O3a(forkhead boxO3a，FOXO3a)滅活，GR活化經GR-SGK-1-FOXO3a信號傳導通路而致FOXO3a 擇優磷酸化和滅活[13]。FOXO3蛋白被認為是激活胞外配體的啟動子，包括啟動CD95-L、轉錄編碼腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體、Ⅰ-型腫瘤壞死因子受體結合蛋白、促B細胞淋巴瘤凋亡/白血病基因蛋白家族成員的Bim以及Bcl-6[14] 。GC誘導的SGK-1 活化后FOXO蛋白質的滅活可能下調上述促凋亡蛋白轉錄，有助于GR介導細胞凋亡的抵抗[15]。我們此次研究顯示，SPC-A1細胞株中只表達SGK-1蛋白，未出現MKP-1蛋白表達。此外，還有研究發現，在人肺癌細胞獲得對CDDP的凋亡抵抗中，AKT1 基因擴增和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的靶標分子/p70S6K1 信號通路發揮了重要作用[16]。
綜上所述，經不同濃度DEX體外誘導培養后，SPC-A1細胞對CDDP顯示出化療藥物抵抗，與DEX濃度呈劑量依賴關系。SPC-A1細胞經DEX誘導后，GR表達上調，DEX可能通過與上調的GR結合，產生更強的信號，增強信號傳導通路下游抗凋亡基因SGK-1的表達，導致SPC-A1細胞對CDDP產生凋亡抵抗。預示SGK-1基因在DEX誘導GR陽性的人肺腺癌化療抵抗中可能起著重要的作用。當然，DEX誘導實體腫瘤對化療藥物凋亡抵抗的機制可能還存在著其他的分子信號轉導通路，而且DEX對某些腫瘤也有誘導化療凋亡作用，DEX的這些雙向調節機制尚需要進一步的研究和闡明。
引言
糖皮質激素(glucocorticoid,GC)是一種重要的類內源性類固醇激素，具有調節生長發育、新陳代謝、生物行為、細胞凋亡等作用[1]。地塞米松(dexamethasone,DEX)是臨床最常用的糖皮質激素類藥物之一，不僅有治療過敏性疾病與自身免疫性炎癥性疾病的功能，而且具有殺滅和抑制非實體性腫瘤的能力，很早被引入腫瘤的治療中。在19世紀70年代早期DEX就用于兒童白血病的誘導緩解和治療[2]，隨后的研究發現，DEX具有殺滅和抑制某些淋巴細胞的能力，所以被作為主要化療藥物之一用于惡性淋巴瘤化療方案中[3]。除了被用于非實體性腫瘤如白血病、淋巴瘤的化療以外，DEX還在處理腫瘤放化療相關的水腫、炎癥、疼痛、電解質失衡以及惡心、嘔吐等臨床癥狀中起到較重要的作用[4]。但近年來不斷有研究發現，DEX對卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌等多種實體腫瘤存在潛在的、誘導化療抵抗的現象，其主要表現之一是抑制化療藥物引起的腫瘤細胞凋亡[5-6]。其中，乳腺癌被DEX誘導的化療凋亡抵抗最為顯著，進一步對其抗凋亡分子機制進行研究發現，血清/糖皮質激素-誘導激酶(serum/glucocorticoid-induced kinase,SGK-1)和有絲分裂原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1,MKP-1)這兩種激酶在抗凋亡信號轉導通路中起著重要的作用[7]。也有少數研究發現，DEX對化療藥物具有增敏作用,如Wang 等[8]用裸鼠荷瘤模型發現，DEX預處理可增強阿霉素誘導腫瘤細胞的凋亡，增加腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-alpha beta,TNF-αβ)的表達，降低白介素-1(interleukin-1，IL-1)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達 。以上多種研究提示，DEX對不同腫瘤化療的協同作用可能不同，由于DEX是臨床腫瘤治療的常用藥物，確定其是否誘導腫瘤細胞產生化療藥物抗性并明確其機制，對于指導臨床用藥極為重要。
肺癌位居惡性腫瘤發病率和死亡率首位，順鉑(cisplatin,CDDP)為肺癌化療方案中最常用的藥物。我們的前期研究初步發現DEX可以誘導人非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)離體細胞及SPC-A1細胞株對CDDP的化療抵抗[9]，但未對其分子機制進行深入研究。因此，本研究體外用DEX誘導培養人肺腺癌細胞SPC-A1一定時間后，再用CDDP進行處理，進一步確定DEX對誘導CDDP化療抵抗的作用并探討其作用機制。
1 材料和方法
1.1 細胞株來源
人肺腺癌細胞株SPC-A1購自上海細胞所，培養于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素、2 mmol/L 谷氨酰胺的RPMI-1640 培養基中,培養條件為37 ℃、5% CO2。
1.2 藥品及主要試劑
CDDP，云南個舊生物藥業有限公司生產，國藥準字H53021740；DEX,天津藥業焦作有限公司，國藥準字H41020036；MTT(Sigma)；胰蛋白酶(Sigma)；TRIZOL購自Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒，購自北京天為時代科技有限公司； Rabbit Anti-GR單克隆抗體、DAB顯色試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司。
1.3 MTT法測定細胞存活率
收集呈指數生長的SPC-A1細胞，用0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化液處理，制成5×104/mL的單細胞懸液。將細胞接種于96孔培養板內，每孔100 μL，24 h貼壁后，分別加入不同濃度的DEX，24 h后再加入不同濃度的CDDP，各組分別設4個復孔。于37 ℃、5% CO2繼續培養48 h，再加入20 μL MTT(2.5 mg/mL)，于37 ℃反應4 h，棄上清，加入150 μL DMSO充分溶解，酶標儀測定λ570nm的吸光值(A)，并按下式計算細胞存活率。
| $存活率\text{( }\!\!%\!\!\text{ )=}\frac{(實驗孔A值-空白孔A值)}{(對照孔A值-空白孔A值)}\times 100%$ |
1.4 RT-PCR 檢測目的基因SGK-1、MKP-1 的表達
根據相應基因的編碼區序列，用Net Primer軟件設計SGK-1 和MKP-1引物，各目的基因引物購自Invitrogen公司。SGK-1基因引物5′-GGAGGATGGGTCTGAACGACTTTA-3′，其反義鏈為5′-AGCGTTCCCTCTGGAGATGGTAGA-3′,產物大小為486 bp。MKP-1基因引物5′-CCGAGAACAGACAAAGAGCACCG-3′，其反義鏈為5′-ATACGCACTGCCCAGGTACAGAAA-3′，產物大小為620 bp。內參照物β-actin引物5′-AAGAGATGGCCACGGCTGCT-3′,其反義鏈為5′-GACTCGTCATACTCCTGCTTGCT-3′，產物大小為421 bp。
在SPC-A1細胞培養液中加入1 μmol/L DEX,設不含DEX者為陰性對照組。分別于1、2、4、6、12 h提取總RNA。反轉錄成cDNA，對目的基因用以上特異性引物進行擴增，PRC擴增條件：95 ℃ 預變性5 min，進入30個下述循環(95 ℃ 45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s)，最后再72℃延伸 4 min。擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳上鑒定。
1.5 GR的測定
接種細胞前先將96孔板預處理，200 μL血清包被孔底部及四周(包被溫度20~37 ℃，5 min)。將8×104/mL的 SPC-A1細胞懸液接種于96孔板中,每孔100 μL，24 h后除去培養液。細胞分為三組：治療組(DEX濃度1 μmol/L，作用24 h)；對照組(無GR抗體)；陰性對照組(無DEX)。培養結束后，按照公司試劑盒說明進行染色。先用95%酒精固定細胞15~20 min，除去酒精。再加5% BSA封閉液,室溫20 min,甩去多余液體,不洗。將一抗用磷酸鹽緩沖液PBS(KCl 0.2 g、KH2PO4 0.2 g、NaCl2 8.0 g、Na2HPO4·7H2O 1.56 g，加H2O 1 000 mL溶解)1∶200稀釋后，依次加入兔抗人GR一抗、生物素標記的二抗、ABC試劑DAB顯色及HE染色。顯微鏡觀察、拍片，以SPC-A1細胞胞質及胞核內出現棕黃色顆粒為陽性，每個孔內分別觀察10個高倍視野(400×)，每個高倍視野計數20~50個細胞的免疫組化或HE染色陽性細胞數，計算出每孔的陽性細胞百分數并按4個等級進行分級：陽性率＜5%為陰性；5%~25%為+；26%~50%為++；＞50%為+++。以上每孔均由兩名病理醫師雙盲觀察。
1.6 統計學處理
數據采用SPSS 13.0 統計軟件包分析處理,計量資料數據以
2 結果
2.1 DEX誘導肺腺癌細胞株SPC-A1對CDDP的化療抵抗
將SPC-A1細胞接種于96孔板中，用不同劑量(0~10 μmol/L)DEX培養24 h，再用不同濃度(0~34 μmol/L) GDDP處理48 h后，用MTT法測定細胞存活率。結果如圖 1所示，單純DEX誘導培養后，與對照組相比，細胞存活率隨著DEX濃度升高而增高，表明DEX對SPC-A1沒有細胞毒性，單獨使用DEX對腫瘤細胞有抗凋亡而促進細胞生長的作用，且表現為DEX劑量依賴性。未經DEX誘導培養的細胞，用CDDP處理后細胞存活率明顯下降，且表現出CDDP劑量依賴性，說明SPC-A1細胞對CDDP化療敏感。但是，當用不同濃度DEX誘導培養后再用CDDP處理，細胞存活率隨著DEX濃度升高而增高，表明DEX誘導了SPC-A1細胞對CDDP的抵抗。未用DEX誘導培養的對照組分別與加入0.1、1和10 μmol/L DEX的實驗組兩兩比較，細胞存活率差異均有統計學意義(P＜0.01)。
圖1
DEX誘導SPC-A1中對順鉑的抵抗作用
Figure1.
Resistance to CDDP of SPC-A1 induced by DEX
2.2 DEX誘導培養后SPC-A1中SGK-1和MKP-1基因的表達
SPC-A1經1 μmol/L DEX誘導培養不同時間后，提取RNA,用RT-PCR檢測目的基因表達。結果如圖 2所示，在誘導培養0、1、2、4、6和12 h的細胞中，均檢測到SGK-1的表達，RT-PCR均擴增出特異性條帶。進一步以β-actin表達量為內對照，將其條帶灰度設為1，計算目的基因表達量。結果發現，隨著誘導時間延長,SGK-1的表達隨之增高(如表 1和圖 2所示)。
表1
SPC-A1細胞SGK-1和β-actin灰度值及其比值
Table1.
Gray value of SGK-1 and its ratio to β-actin in SPC-A1 cell
圖2
RT-PCR檢測DEX誘導培養后SPC-A1細胞SGK-1表達
Figure2.
RT-PCR of SGK-1 in SPC-A1 cells induced by DEX
但是，在這些細胞中并未檢測到MKP-1的高表達，RT-PCR未擴增出特異性條帶，表明DEX誘導培養并未提高MKP-1基因的表達水平(見圖 3)。
圖3
RT-PCR檢測DEX誘導培養后SPC-A1細胞MKP-1的表達
Figure3.
RT-PCR of MKP-1 in SPC-A1 cells induced by DEX
2.3 GR的測定
在人肺腺癌細胞SPC-A1中，與未加GR一抗的對照組及未加DEX的陰性對照組比較，加入1 μmol/L DEX的實驗組經免疫組化和HE染色后表現為細胞質內呈現棕黃色、細胞核內呈現深棕色顆粒，且數目超過該孔的50%(見圖 4)，SPC-A1細胞內GR表達較對照組明顯增高，且呈強陽性。
圖4
免疫組化檢測SPC-A1 GR表達
(a)對照組；(b)陰性對照組；(c)治療組
Figure4. Expression of GR on SPC-A1 by immunohistochemistry(a) control group; (b) negative control group; (c) treatment group
3 討論
GC是一種至關重要的皮質類固醇激素[1]，除了直接用于非實體性腫瘤如淋巴瘤的化療以外，還用于處理腫瘤化療相關的水腫、炎癥、疼痛、電解質失衡以及惡心、嘔吐等臨床癥狀[4, 10]。有研究發現DEX可能誘導腫瘤細胞對化療藥物引起的細胞凋亡產生抵抗。雖然DEX對淋巴細胞是一種促凋亡劑，但對多種實體腫瘤細胞卻具有抗凋亡的作用。GC通過與細胞內的GR結合后，激活的GR通過一系列細胞內信號傳遞，活化或抑制基因的轉錄，從而發揮其促凋亡或抗凋亡的作用[11]。
DEX對化療藥物引起的實體性腫瘤細胞凋亡的抑制作用已經引起了國內外醫學研究人員的關注。Zhang 等[5-6]采用細胞株和腫瘤手術標本，對多種實體腫瘤進行了篩查，發現DEX可以誘導卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌等多種實體腫瘤對化療藥物的抵抗。我們研究發現DEX對人NSCLC標本及SPC-A1細胞存在顯著的化療抵抗誘導作用，并且這種化療抵抗還存在性別差異[9]。對存在化療抵抗的多種實體性腫瘤研究發現，乳腺癌對DEX誘導的化療凋亡抵抗最為顯著，Wu等[7]對乳腺癌抗凋亡分子機制進行深入研究，對DEX/紫杉醇聯合處理前后乳腺腫瘤細胞株，采用mRNA微陣列技術來分析其細胞內12 696個基因表達變化，結果顯示，乳腺腫瘤細胞經DEX誘導后，出現SGK-1和MKP-1兩個關鍵蛋白異常高度表達，對抑制化療藥物引起的細胞凋亡起決定性作用。
本研究證實，DEX可誘導人肺腺癌細胞SPC-A1對CDDP產生抵抗，其分子機制是通過抑制細胞凋亡。SPC-A1細胞經DEX誘導后，細胞內GR表達上調，因而GC-GR信號增強，使其下游通路中的SGK-1基因高度表達抗凋亡蛋白，從而誘導SPC-A1細胞對CDDP產生藥物抵抗。在時序上DEX作用以后12 h SGK-1基因表達達到高峰。然而與經DEX誘導后的乳腺癌細胞相比，抗凋亡基因MKP-1在人肺腺癌細胞SPC-A1中并未表達。GC受體的表達水平可以影響不同的信號傳導和靶基因的激活[12]。有研究顯示，乳腺上皮細胞生存其中一個重要的機制就是GR介導復制叉轉錄因子成員之一叉頭基因O3a(forkhead boxO3a，FOXO3a)滅活，GR活化經GR-SGK-1-FOXO3a信號傳導通路而致FOXO3a 擇優磷酸化和滅活[13]。FOXO3蛋白被認為是激活胞外配體的啟動子，包括啟動CD95-L、轉錄編碼腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體、Ⅰ-型腫瘤壞死因子受體結合蛋白、促B細胞淋巴瘤凋亡/白血病基因蛋白家族成員的Bim以及Bcl-6[14] 。GC誘導的SGK-1 活化后FOXO蛋白質的滅活可能下調上述促凋亡蛋白轉錄，有助于GR介導細胞凋亡的抵抗[15]。我們此次研究顯示，SPC-A1細胞株中只表達SGK-1蛋白，未出現MKP-1蛋白表達。此外，還有研究發現，在人肺癌細胞獲得對CDDP的凋亡抵抗中，AKT1 基因擴增和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的靶標分子/p70S6K1 信號通路發揮了重要作用[16]。
綜上所述，經不同濃度DEX體外誘導培養后，SPC-A1細胞對CDDP顯示出化療藥物抵抗，與DEX濃度呈劑量依賴關系。SPC-A1細胞經DEX誘導后，GR表達上調，DEX可能通過與上調的GR結合，產生更強的信號，增強信號傳導通路下游抗凋亡基因SGK-1的表達，導致SPC-A1細胞對CDDP產生凋亡抵抗。預示SGK-1基因在DEX誘導GR陽性的人肺腺癌化療抵抗中可能起著重要的作用。當然，DEX誘導實體腫瘤對化療藥物凋亡抵抗的機制可能還存在著其他的分子信號轉導通路，而且DEX對某些腫瘤也有誘導化療凋亡作用，DEX的這些雙向調節機制尚需要進一步的研究和闡明。
