本文旨在研究川芎嗪及大鼠結締組織生長因子(CTGF) miRNA質粒對高糖刺激大鼠肝星狀細胞(HSC)的CTGF和轉化生長因子-beta (TGF-beta) mRNA表達量、蛋白表達量及Ⅰ型膠原表達量的作用。首先體外培養大鼠HSC以及穩定表達大鼠CTGF miRNA和穩定表達陰性質粒的大鼠HSC,高糖及川芎嗪作用后提取總RNA、總蛋白及收集細胞上清液,檢測川芎嗪及大鼠CTGF miRNA質粒對高糖刺激HSC的CTGF、TGF-beta及Ⅰ型膠原表達量。實驗結果表明,高糖導致HSC的CTGF mRNA、CTGF蛋白、TGF-beta mRNA、TGF-beta蛋白及Ⅰ型膠原表達量增加(P＜0.05)。川芎嗪組CTGF mRNA、CTGF蛋白、TGF-beta mRNA、TGF-beta蛋白及Ⅰ型膠原的表達量較高糖組低(P＜0.05)。大鼠CTGF miRNA質粒干擾組CTGF mRNA、CTGF蛋白、TGF-beta mRNA、TGF-beta蛋白及Ⅰ型膠原的表達量較高糖組低(P＜0.05)。川芎嗪組與大鼠CTGF miRNA質粒干擾組相比,CTGF mRNA及CTGF蛋白的表達量差異無統計學意義(P＞0.05),川芎嗪組Ⅰ型膠原的表達量明顯低于大鼠CTGF miRNA質粒干擾組(P＜0.05)。因此,高糖可刺激CTGF、TGF-beta、Ⅰ型膠原的表達,而川芎嗪、大鼠CTGF miRNA質粒可導致CTGF、TGF-beta、Ⅰ型膠原的表達量下降。
引用本文： 陽宏, 李軍, 邢旎旎, 向穎, 沈艷, 李孝生. 川芎嗪及大鼠CTGFmiRNA質粒對高糖刺激肝星狀細胞結締組織生長因子、轉化生長因子-beta的影響. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(2): 394-399. doi: 10.7507/1001-5515.20140074 復制
引言
肝纖維化為各種病因如肝炎病毒、乙醇、高糖(葡萄糖濃度大于血糖正常值簡稱高糖)等的持續作用下導致細胞外基質在肝內大量沉積的病理過程，是各種慢性肝病發展為肝硬化的必經階段。肝硬化不可逆，但是肝纖維化為可逆的，故對肝纖維化的發生發展機制、早期診斷、預防及治療方面的研究一直是肝病學研究的熱點之一。多項研究證實了肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活是肝纖維化發生發展的中心環節。在各種慢性病因的作用下，肝實質細胞損傷激活HSC，HSC激活后轉化為肌成纖維樣細胞，產生各種細胞因子如轉化生長因子-beta(transforming growth factor-beta，TGF-beta)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)促進肝纖維化的發生發展[1-2]。近年來一些研究發現，高糖是非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、乙型肝炎、丙型肝炎發展為肝纖維化的重要危險因素[3-4]，能促進肝纖維化發生和加重肝纖維化的進展。隨著糖尿病發病率的逐漸增高，越來越多的學者加入到探索高糖在肝纖維化發生發展中的作用機制的研究，以期找到預防高糖所致肝纖維化的有效藥物。
川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)又稱為四甲基吡嗪，是從中藥川芎中提取的有效成分，為一種生物堿單體，具有鈣拮抗作用、抗氧化作用、抑制細胞凋亡、抗纖維化作用、改善微循環及腦血流的作用，曾應用于腦栓塞、脈管炎、冠心病等疾病的治療。近年來，川芎嗪抗肝纖維化的作用得到了廣泛的認可，本課題組在體外、體內實驗也證實川芎嗪對肝纖維化的預防、治療均有顯著效果[5-6]，但對其具體作用機制，尤其對高糖刺激的肝纖維化的作用及機制不夠清楚。因此，我們在以往研究基礎上，設計本課題以觀察川芎嗪及大鼠CTGF miRNA質粒對高糖刺激HSC的CTGF、TGF-beta及Ⅰ型膠原表達的影響，從細胞分子水平探討防治肝纖維化的作用機制，為探尋防治肝纖維化的新方法提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 細胞
大鼠肝星狀細胞(用HSC表示)由重慶醫科大學附屬第二醫院超聲研究所實驗室惠贈。穩定表達大鼠CTGF miRNA 質粒的大鼠肝星狀細胞(用HSC2表示)及穩定表達陰性質粒(陰性質粒即空載質粒中插入非特異性序列，對質粒的基因及蛋白表達無影響，插入的序列位置及堿基數與大鼠CTGF miRNA 質粒相同)的大鼠肝星狀細胞(用HSC3表示)為前期實驗獲得。
1.2 主要試劑
根據大鼠CTGF、TGF-beta、beta-actin基因序列(NCBI編號分別為NM_022266.2，NM_021578.2，NM_031144.2)設計并合成目的基因及內參引物。三種基因引物序列：CTGF(370 bp)：(上游)5′GCCAGGGAGTAAGGGACACG 3′(下游)5′CCCTCCCCTGTCACACTCCAAA 3′；TGF-beta(410 bp)：(上游)5′AGACATCACACACAGTA 3′(下游)5′ AGGTGTTGAGCCCTTTCCAG3′；actin(170 bp)：(上游) 5′GCCCTGGACTTCGAGCAAGA3′(下游)5′TGCCAGGGTACATGGTGGTG3′。其中CTGF、actin引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成，而TGF-beta引用文獻序列[9]，上海生工生物工程股份有限公司合成。胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司生產，DMEM低糖培養基購于Hyclone公司，胰酶、EDTA購自美國Amresco公司，葡萄糖購于北京易萊西諾生物科技有限公司，甘露醇為北京北瑞達醫藥科技有限公司生產，川芎嗪購自哈藥集團醫藥有限公司。Trizol試劑、RT試劑盒、PCR試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司。EB、瓊脂糖購于北京昌盛生物技術有限責任公司。哺乳動物蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、0.22 μm孔徑的PVDF膜購于北京康為世紀生物科技有限公司，彩色預染Marker購于Fermentas，兔抗大鼠CTGF多克隆抗體為Abcam公司產品，兔抗大鼠TGF-beta多克隆抗體購自上海生工生物工程股份有限公司，小鼠抗大鼠actin、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG購于碧云天生物技術研究所，DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。
1.3 細胞培養
培養細胞(HSC、HSC2、HSC3)用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養基，培養于37 ℃、5% CO2培養箱內。細胞貼壁約80%時用胰酶-EDTA(0.05%胰蛋白酶、0.02% EDTA)消化1 min后加含10%胎牛血清的培養基終止消化，輕輕吹打細胞成單個懸浮細胞后于1 000 r/min離心3 min，離心后棄上清液加含10%胎牛血清的DMEM低糖培養基輕輕吹打混勻后細胞計數，然后各取10萬個細胞加入到6孔培養板或培養瓶進一步培養。
1.4 實驗分組
參考本課題組前期的研究[5-6]，選用川芎嗪的適宜抑制濃度為200 mg/L進行實驗。本實驗共分為6個組：① 低糖對照組，HSC加入DMEM低糖培養基，葡萄糖終濃度1.5 g/L；② 高滲對照組，HSC加入DMEM低糖培養基及甘露醇，使得葡萄糖終濃度1.5 g/L、甘露醇終濃度3.0 g/L；③ 高糖組，HSC加入DMEM低糖培養基及葡萄糖，使得葡萄糖終濃度為4.5 g/L；④ 陰性質粒對照組，HSC3加入DMEM低糖培養基及葡萄糖，使得葡萄糖終濃度為4.5 g/L；⑤ 川芎嗪組，HSC加入DMEM低糖培養基、葡萄糖、甘露醇，使得葡萄糖終濃度為4.5 g/L，川芎嗪終濃度為200 mg/L；⑥ 大鼠CTGF miRNA質粒干擾組，HSC2加入DMEM低糖培養基及葡萄糖，使得葡萄糖終濃度為4.5 g/L。葡萄糖、甘露醇、川芎嗪為細胞貼壁后同時加入。
1.5 檢測細胞中CTGF、TGF-beta mRNA轉錄水平
運用RT-PCR法檢測細胞中CTGF、TGF-beta基因表達量。按照RNA提取試劑說明書操作步驟，運用Trizol試劑提取高糖及川芎嗪作用24 h后的細胞總RNA，核酸蛋白儀(SmartSpecTM lus)測定RNA濃度后，按照逆轉錄試劑盒說明書操作，各組取1 μg RNA作為模板進行逆轉錄，逆轉錄后的cDNA取相同量進行PCR擴增，擴增條件為94 ℃預變性； 94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s 72 ℃延伸30 s，其中CTGF為25個循環，beta-actin、TGF-beta為30個循環；最后72 ℃延伸2 min補齊末端。 PCR產物經0.5 μg /mL濃度的EB(核酸染色劑)及2%瓊脂糖凝膠電泳分離DNA，用Quantity One圖像分析儀(美國Biorad公司)進行電泳條帶的掃描及條帶吸光度分析，目的基因與對應內參beta-actin吸光度的比值作為目的基因表達量。
1.6 檢測細胞中CTGF、TGF-beta蛋白表達量
采用Western blot法檢測細胞中CTGF、TGF-beta蛋白表達量。按照蛋白提取試劑盒說明書提取收集的各實驗組細胞高糖及川芎嗪作用48 h后的總蛋白，然后用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度；于提取的蛋白中加入上樣緩沖液混勻后100 ℃加熱5 min使蛋白變性。加熱變性后蛋白可用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，剩余的于-20 ℃保存。各組分別取50 μg蛋白以4% SDS-PAGE濃縮膠、12%SDS-PAGE分離膠電泳分離不同分子量的蛋白；電泳后250 mA恒流140 min的濕轉法使蛋白轉至PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉2 h后；一抗孵育過夜，TBST洗膜3次,每次15 min；二抗孵育1 h后再次TBST洗膜三次，每次15 min；DAB辣根過氧化物酶顯色試劑進行顯色，用Image Lab圖像分析儀(美國Biorad公司)對蛋白條帶掃描、分析。目的蛋白與內參條帶灰度比值為蛋白表達的相對含量。
1.7 檢測細胞Ⅰ型膠原表達水平
運用ELISA法檢測各組細胞的Ⅰ型膠原表達量。按照ELISA試劑盒說明書提取各實驗組細胞高糖及川芎嗪作用48 h后的上清液，將待檢測的上清液及標準品各100 μL分別加入到酶標板內，每組設6個復孔，然后每個孔內加入50 μL酶標記溶液，于25 ℃孵育90 min后棄上清液，清洗3次，再于各孔內分別加入底物A、B各50 μL，于25 ℃孵育15 min，然后與各孔內加入50 μL的終止液終止反應，運用酶標儀檢測492 nm波長的吸光值，對照繪制的標準曲線得出各實驗組Ⅰ型膠原表達量。
1.8 統計學分析
采用SPSS17.0軟件(美國SPSS公司)進行統計數據處理，實驗數據以(
2 結果
2.1 各組CTGF表達量
各組于不同的刺激因素作用24 h后提取RNA行RT-PCR檢測 CTGF mRNA表達水平，于不同刺激因素作用48 h后提取總蛋白行Western blot檢測 CTGF 蛋白表達水平。各組CTGF mRNA及蛋白表達的電泳結果如圖 1、2所示，各組CTGF mRNA及蛋白表達水平如表 1所示。結果顯示：高滲對照組與低糖對照組相比差別無統計學意義(P＞0.05)；高糖組表達量比低糖對照組高，且差別有統計學意義(P＜0.05)；高糖組與陰性質粒對照組相比差別無統計學意義(P＞0.05)；川芎嗪組表達量較高糖組低，且差別有統計學意義(P＜0.05)；大鼠CTGF miRNA干擾組表達量較高糖組低，且差別有統計學意義(P＜0.05)；川芎嗪組與大鼠CTGF miRNA干擾組相比差別無統計學意義(P＞0.05)。
圖1
RT-PCR檢測各組CTGF mRNA表達水平
M：marker;1：低糖對照組；2：高滲對照組；3：高糖組；4：陰性質粒對照組；5：川芎嗪組；6：大鼠CTGF miRNA質粒干擾組
Figure1. CTGF mRNA expression levels of each group were detected by RT-PCRM: Marker; 1： low glucose control group； 2： control group of hyperosmosis； 3： high glucose group； 4： control group of negative plasmid； 5： TMP group； 6： rat CTGF miRNA plasmid interference group
圖2
Western blot檢測各組CTGF蛋白表達水平
1：低糖對照組；2：高滲對照組；3：高糖組；4：陰性質粒對照組；5：川芎嗪組；6：大鼠CTGF miRNA質粒干擾組
Figure2. CTGF protein expression levels of each group were detected by Western blot1： low glucose control group； 2： control group of hyperosmosis； 3：high glucose group； 4： control group of negative plasmid； 5： TMP group； 6： rat CTGF miRNA plasmid interference group
表1
各組CTGF mRNA及蛋白的表達水平(n=6,2.2 各組TGF-beta 表達量
各組于不同的刺激因素作用24 h后提取RNA行RT-PCR檢測 TGF-beta mRNA表達水平，于不同刺激因素作用48 h后提取總蛋白行Western blot檢測 TGF-beta 蛋白表達水平。各組TGF-beta mRNA及蛋白表達的電泳結果如圖 3、4所示，各組TGF-beta mRNA及蛋白表達水平如表 2所示。結果顯示：高滲對照組與低糖對照組相比差別無統計學意義(P＞0.05)；高糖組表達量比低糖對照組高，且差別有統計學意義(P＜0.05)；川芎嗪組表達量較高糖組低，且差別有統計學意義(P＜0.05)；高糖組表達量與陰性質粒組相比差別無統計學意義(P＞0.05)；大鼠CTGF miRNA干擾組表達量較高糖組低，且差別有統計學意義(P＜0.05)；川芎嗪組大表達量較大鼠CTGF miRNA干擾組低，且差別有統計學意義(P＜0.05)。
圖3
RT-PCR檢測各組TGF-beta mRNA表達水平
M：marker; 1：低糖對照組；2：高滲對照組；3：高糖組；4：陰性質粒對照組；5：川芎嗪組；6：大鼠CTGF miRNA質粒干擾組
Figure3. TGF-beta mRNA expression levels of each group were detected by RT-PCRM: Marker; 1： low glucose control group； 2： control group of hyperosmosis； 3： high glucose group； 4： control group of negative plasmid； 5： TMP group； 6： rat CTGF miRNA plasmid interference group
圖4
Western blot檢測各組TGF-beta蛋白表達水平
1：低糖對照組；2：高滲對照組；3：高糖組；4：陰性質粒對照組；5：川芎嗪組；6：大鼠CTGF miRNA質粒干擾組
Figure4. TGF-beta protein expression levels of each group were detected by Western blot1： low glucose control group； 2： control group of hyperosmosis； 3： high glucose group； 4：control group of negative plasmid； 5： TMP group； 6： rat CTGFmiRNA plasmid interference group
表2
各組TGF-beta mRNA及蛋白的表達水平(n=6,±s)
Table2.
TGF-beta mRNA and protein expression levels of each group(n=6,±s)
2.3 各組Ⅰ型膠原表達量
不同的刺激因素作用48 h后，收集各組上清液，通過ELISA法檢測上清液Ⅰ型膠原表達量，結果如表 3所示。Ⅰ型膠原檢測結果顯示：高滲對照組與低糖對照組相比差別無統計學意義(P＞0.05)，高糖組表達量比低糖對照組高，且差別有統計學意義(P＜0.05)；高糖組表達量與陰性質粒對照組相比差別無統計學意義(P＞0.05)，川芎嗪組表達量比高糖組低，且差別有統計學意義(P＜0.05)；大鼠CTGF miRNA質粒干擾組表達量比高糖組低，且差別有統計學意義(P＜0.05)；川芎嗪組表達量較大鼠CTGF miRNA干擾組低，且差別有統計學意義(P＜0.05)。
表3
各組I型膠原的表達水平(n=6,3 討論
CTGF為近期新發現的致纖維化的重要細胞因子，在肝纖維化、肺纖維化及腎纖維化等各種器官的纖維化中均起著非常重要的作用[7-8]。在正常的生理狀況下，CTGF的表達量較低，且主要在間質細胞中表達，主要作用也限于結締組織。但在肝纖維化過程中，CTGF可在各種細胞因子及有害因素的刺激下表達增加，主要刺激因素有TGF-beta、血管內皮生長因子、脂質過氧化產物如丙二醛、乙醛、高糖及血小板衍生因子，其中以TGF-beta刺激作用最強，經刺激后CTGF主要表現為促進血管平滑肌細胞增生、刺激細胞外基質合成及抑制細胞外基質的降解，使細胞外基質在肝內過度沉積，從而導致纖維化[9-10]。
TGF-beta在肝纖維化的發生發展中也起著重要的作用，在各種慢性肝損傷時，TGF-beta持續過度表達，可促進HSC活化、增殖并分泌大量細胞外基質成分，從而促進肝纖維化的形成。此外，TGF-beta還可以上調CTGF表達。CTGF作為TGF-beta的下游效應介質，可促進Ⅰ、Ⅲ型膠原特別是Ⅰ型膠原顯著增加，特異性地介導TGF-beta的促纖維化效應[8]。但是，TGF-beta的生物學作用除了促進肝纖維化外，還有其他重要的抗炎、調節免疫等作用，完全阻斷TGF-beta雖可以抗纖維化，但還可能出現其他的全身炎癥反應、免疫抑制異常等不良后果，而且除了TGF-beta外還有其他的刺激因素如脂質過氧化物、高糖等均可導致CTGF表達增多，故下調CTGF的表達成為抗肝纖維化的研究重點。微小RNA干擾(miRNA)是近年發展起來的一項新興分子生物學技術，可高效、特異地下調細胞中基因的表達，可用于抗肝纖維化藥物的作用機制研究[11-12]。
本實驗顯示高糖組CTGF、TGF-beta的表達量較低糖對照組高，川芎嗪組及大鼠CTGF miRNA質粒干擾組CTGF、TGF-beta和Ⅰ型膠原的表達量較高糖組低，由此推論川芎嗪可能通過抑制CTGF、TGF-beta的表達，從而阻斷Ⅰ型膠原的合成，發揮抗高糖刺激的肝纖維化效應，這可能是其抗肝纖維化的一個重要分子機制。本實驗還發現，大鼠CTGF miRNA干擾組CTGF的表達量與川芎嗪組相比，差別無統計學意義，而川芎嗪組Ⅰ型膠原表達量比大鼠CTGF miRNA干擾組低，且差別有統計學意義，由此推論川芎嗪下調Ⅰ型膠原表達量的作用機制可能不只通過下調TGF、CTGF途徑，還有其他的機制，但具體什么作用機制有待進一步研究。
引言
肝纖維化為各種病因如肝炎病毒、乙醇、高糖(葡萄糖濃度大于血糖正常值簡稱高糖)等的持續作用下導致細胞外基質在肝內大量沉積的病理過程，是各種慢性肝病發展為肝硬化的必經階段。肝硬化不可逆，但是肝纖維化為可逆的，故對肝纖維化的發生發展機制、早期診斷、預防及治療方面的研究一直是肝病學研究的熱點之一。多項研究證實了肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活是肝纖維化發生發展的中心環節。在各種慢性病因的作用下，肝實質細胞損傷激活HSC，HSC激活后轉化為肌成纖維樣細胞，產生各種細胞因子如轉化生長因子-beta(transforming growth factor-beta，TGF-beta)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)促進肝纖維化的發生發展[1-2]。近年來一些研究發現，高糖是非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、乙型肝炎、丙型肝炎發展為肝纖維化的重要危險因素[3-4]，能促進肝纖維化發生和加重肝纖維化的進展。隨著糖尿病發病率的逐漸增高，越來越多的學者加入到探索高糖在肝纖維化發生發展中的作用機制的研究，以期找到預防高糖所致肝纖維化的有效藥物。
川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)又稱為四甲基吡嗪，是從中藥川芎中提取的有效成分，為一種生物堿單體，具有鈣拮抗作用、抗氧化作用、抑制細胞凋亡、抗纖維化作用、改善微循環及腦血流的作用，曾應用于腦栓塞、脈管炎、冠心病等疾病的治療。近年來，川芎嗪抗肝纖維化的作用得到了廣泛的認可，本課題組在體外、體內實驗也證實川芎嗪對肝纖維化的預防、治療均有顯著效果[5-6]，但對其具體作用機制，尤其對高糖刺激的肝纖維化的作用及機制不夠清楚。因此，我們在以往研究基礎上，設計本課題以觀察川芎嗪及大鼠CTGF miRNA質粒對高糖刺激HSC的CTGF、TGF-beta及Ⅰ型膠原表達的影響，從細胞分子水平探討防治肝纖維化的作用機制，為探尋防治肝纖維化的新方法提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 細胞
大鼠肝星狀細胞(用HSC表示)由重慶醫科大學附屬第二醫院超聲研究所實驗室惠贈。穩定表達大鼠CTGF miRNA 質粒的大鼠肝星狀細胞(用HSC2表示)及穩定表達陰性質粒(陰性質粒即空載質粒中插入非特異性序列，對質粒的基因及蛋白表達無影響，插入的序列位置及堿基數與大鼠CTGF miRNA 質粒相同)的大鼠肝星狀細胞(用HSC3表示)為前期實驗獲得。
1.2 主要試劑
根據大鼠CTGF、TGF-beta、beta-actin基因序列(NCBI編號分別為NM_022266.2，NM_021578.2，NM_031144.2)設計并合成目的基因及內參引物。三種基因引物序列：CTGF(370 bp)：(上游)5′GCCAGGGAGTAAGGGACACG 3′(下游)5′CCCTCCCCTGTCACACTCCAAA 3′；TGF-beta(410 bp)：(上游)5′AGACATCACACACAGTA 3′(下游)5′ AGGTGTTGAGCCCTTTCCAG3′；actin(170 bp)：(上游) 5′GCCCTGGACTTCGAGCAAGA3′(下游)5′TGCCAGGGTACATGGTGGTG3′。其中CTGF、actin引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成，而TGF-beta引用文獻序列[9]，上海生工生物工程股份有限公司合成。胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司生產，DMEM低糖培養基購于Hyclone公司，胰酶、EDTA購自美國Amresco公司，葡萄糖購于北京易萊西諾生物科技有限公司，甘露醇為北京北瑞達醫藥科技有限公司生產，川芎嗪購自哈藥集團醫藥有限公司。Trizol試劑、RT試劑盒、PCR試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司。EB、瓊脂糖購于北京昌盛生物技術有限責任公司。哺乳動物蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、0.22 μm孔徑的PVDF膜購于北京康為世紀生物科技有限公司，彩色預染Marker購于Fermentas，兔抗大鼠CTGF多克隆抗體為Abcam公司產品，兔抗大鼠TGF-beta多克隆抗體購自上海生工生物工程股份有限公司，小鼠抗大鼠actin、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG購于碧云天生物技術研究所，DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。
1.3 細胞培養
培養細胞(HSC、HSC2、HSC3)用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養基，培養于37 ℃、5% CO2培養箱內。細胞貼壁約80%時用胰酶-EDTA(0.05%胰蛋白酶、0.02% EDTA)消化1 min后加含10%胎牛血清的培養基終止消化，輕輕吹打細胞成單個懸浮細胞后于1 000 r/min離心3 min，離心后棄上清液加含10%胎牛血清的DMEM低糖培養基輕輕吹打混勻后細胞計數，然后各取10萬個細胞加入到6孔培養板或培養瓶進一步培養。
1.4 實驗分組
參考本課題組前期的研究[5-6]，選用川芎嗪的適宜抑制濃度為200 mg/L進行實驗。本實驗共分為6個組：① 低糖對照組，HSC加入DMEM低糖培養基，葡萄糖終濃度1.5 g/L；② 高滲對照組，HSC加入DMEM低糖培養基及甘露醇，使得葡萄糖終濃度1.5 g/L、甘露醇終濃度3.0 g/L；③ 高糖組，HSC加入DMEM低糖培養基及葡萄糖，使得葡萄糖終濃度為4.5 g/L；④ 陰性質粒對照組，HSC3加入DMEM低糖培養基及葡萄糖，使得葡萄糖終濃度為4.5 g/L；⑤ 川芎嗪組，HSC加入DMEM低糖培養基、葡萄糖、甘露醇，使得葡萄糖終濃度為4.5 g/L，川芎嗪終濃度為200 mg/L；⑥ 大鼠CTGF miRNA質粒干擾組，HSC2加入DMEM低糖培養基及葡萄糖，使得葡萄糖終濃度為4.5 g/L。葡萄糖、甘露醇、川芎嗪為細胞貼壁后同時加入。
1.5 檢測細胞中CTGF、TGF-beta mRNA轉錄水平
運用RT-PCR法檢測細胞中CTGF、TGF-beta基因表達量。按照RNA提取試劑說明書操作步驟，運用Trizol試劑提取高糖及川芎嗪作用24 h后的細胞總RNA，核酸蛋白儀(SmartSpecTM lus)測定RNA濃度后，按照逆轉錄試劑盒說明書操作，各組取1 μg RNA作為模板進行逆轉錄，逆轉錄后的cDNA取相同量進行PCR擴增，擴增條件為94 ℃預變性； 94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s 72 ℃延伸30 s，其中CTGF為25個循環，beta-actin、TGF-beta為30個循環；最后72 ℃延伸2 min補齊末端。 PCR產物經0.5 μg /mL濃度的EB(核酸染色劑)及2%瓊脂糖凝膠電泳分離DNA，用Quantity One圖像分析儀(美國Biorad公司)進行電泳條帶的掃描及條帶吸光度分析，目的基因與對應內參beta-actin吸光度的比值作為目的基因表達量。
1.6 檢測細胞中CTGF、TGF-beta蛋白表達量
采用Western blot法檢測細胞中CTGF、TGF-beta蛋白表達量。按照蛋白提取試劑盒說明書提取收集的各實驗組細胞高糖及川芎嗪作用48 h后的總蛋白，然后用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度；于提取的蛋白中加入上樣緩沖液混勻后100 ℃加熱5 min使蛋白變性。加熱變性后蛋白可用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，剩余的于-20 ℃保存。各組分別取50 μg蛋白以4% SDS-PAGE濃縮膠、12%SDS-PAGE分離膠電泳分離不同分子量的蛋白；電泳后250 mA恒流140 min的濕轉法使蛋白轉至PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉2 h后；一抗孵育過夜，TBST洗膜3次,每次15 min；二抗孵育1 h后再次TBST洗膜三次，每次15 min；DAB辣根過氧化物酶顯色試劑進行顯色，用Image Lab圖像分析儀(美國Biorad公司)對蛋白條帶掃描、分析。目的蛋白與內參條帶灰度比值為蛋白表達的相對含量。
1.7 檢測細胞Ⅰ型膠原表達水平
運用ELISA法檢測各組細胞的Ⅰ型膠原表達量。按照ELISA試劑盒說明書提取各實驗組細胞高糖及川芎嗪作用48 h后的上清液，將待檢測的上清液及標準品各100 μL分別加入到酶標板內，每組設6個復孔，然后每個孔內加入50 μL酶標記溶液，于25 ℃孵育90 min后棄上清液，清洗3次，再于各孔內分別加入底物A、B各50 μL，于25 ℃孵育15 min，然后與各孔內加入50 μL的終止液終止反應，運用酶標儀檢測492 nm波長的吸光值，對照繪制的標準曲線得出各實驗組Ⅰ型膠原表達量。
1.8 統計學分析
采用SPSS17.0軟件(美國SPSS公司)進行統計數據處理，實驗數據以(
2 結果
2.1 各組CTGF表達量
各組于不同的刺激因素作用24 h后提取RNA行RT-PCR檢測 CTGF mRNA表達水平，于不同刺激因素作用48 h后提取總蛋白行Western blot檢測 CTGF 蛋白表達水平。各組CTGF mRNA及蛋白表達的電泳結果如圖 1、2所示，各組CTGF mRNA及蛋白表達水平如表 1所示。結果顯示：高滲對照組與低糖對照組相比差別無統計學意義(P＞0.05)；高糖組表達量比低糖對照組高，且差別有統計學意義(P＜0.05)；高糖組與陰性質粒對照組相比差別無統計學意義(P＞0.05)；川芎嗪組表達量較高糖組低，且差別有統計學意義(P＜0.05)；大鼠CTGF miRNA干擾組表達量較高糖組低，且差別有統計學意義(P＜0.05)；川芎嗪組與大鼠CTGF miRNA干擾組相比差別無統計學意義(P＞0.05)。
圖1
RT-PCR檢測各組CTGF mRNA表達水平
M：marker;1：低糖對照組；2：高滲對照組；3：高糖組；4：陰性質粒對照組；5：川芎嗪組；6：大鼠CTGF miRNA質粒干擾組
Figure1. CTGF mRNA expression levels of each group were detected by RT-PCRM: Marker; 1： low glucose control group； 2： control group of hyperosmosis； 3： high glucose group； 4： control group of negative plasmid； 5： TMP group； 6： rat CTGF miRNA plasmid interference group
圖2
Western blot檢測各組CTGF蛋白表達水平
1：低糖對照組；2：高滲對照組；3：高糖組；4：陰性質粒對照組；5：川芎嗪組；6：大鼠CTGF miRNA質粒干擾組
Figure2. CTGF protein expression levels of each group were detected by Western blot1： low glucose control group； 2： control group of hyperosmosis； 3：high glucose group； 4： control group of negative plasmid； 5： TMP group； 6： rat CTGF miRNA plasmid interference group
表1
各組CTGF mRNA及蛋白的表達水平(n=6,2.2 各組TGF-beta 表達量
各組于不同的刺激因素作用24 h后提取RNA行RT-PCR檢測 TGF-beta mRNA表達水平，于不同刺激因素作用48 h后提取總蛋白行Western blot檢測 TGF-beta 蛋白表達水平。各組TGF-beta mRNA及蛋白表達的電泳結果如圖 3、4所示，各組TGF-beta mRNA及蛋白表達水平如表 2所示。結果顯示：高滲對照組與低糖對照組相比差別無統計學意義(P＞0.05)；高糖組表達量比低糖對照組高，且差別有統計學意義(P＜0.05)；川芎嗪組表達量較高糖組低，且差別有統計學意義(P＜0.05)；高糖組表達量與陰性質粒組相比差別無統計學意義(P＞0.05)；大鼠CTGF miRNA干擾組表達量較高糖組低，且差別有統計學意義(P＜0.05)；川芎嗪組大表達量較大鼠CTGF miRNA干擾組低，且差別有統計學意義(P＜0.05)。
圖3
RT-PCR檢測各組TGF-beta mRNA表達水平
M：marker; 1：低糖對照組；2：高滲對照組；3：高糖組；4：陰性質粒對照組；5：川芎嗪組；6：大鼠CTGF miRNA質粒干擾組
Figure3. TGF-beta mRNA expression levels of each group were detected by RT-PCRM: Marker; 1： low glucose control group； 2： control group of hyperosmosis； 3： high glucose group； 4： control group of negative plasmid； 5： TMP group； 6： rat CTGF miRNA plasmid interference group
圖4
Western blot檢測各組TGF-beta蛋白表達水平
1：低糖對照組；2：高滲對照組；3：高糖組；4：陰性質粒對照組；5：川芎嗪組；6：大鼠CTGF miRNA質粒干擾組
Figure4. TGF-beta protein expression levels of each group were detected by Western blot1： low glucose control group； 2： control group of hyperosmosis； 3： high glucose group； 4：control group of negative plasmid； 5： TMP group； 6： rat CTGFmiRNA plasmid interference group
表2
各組TGF-beta mRNA及蛋白的表達水平(n=6,±s)
Table2.
TGF-beta mRNA and protein expression levels of each group(n=6,±s)
2.3 各組Ⅰ型膠原表達量
不同的刺激因素作用48 h后，收集各組上清液，通過ELISA法檢測上清液Ⅰ型膠原表達量，結果如表 3所示。Ⅰ型膠原檢測結果顯示：高滲對照組與低糖對照組相比差別無統計學意義(P＞0.05)，高糖組表達量比低糖對照組高，且差別有統計學意義(P＜0.05)；高糖組表達量與陰性質粒對照組相比差別無統計學意義(P＞0.05)，川芎嗪組表達量比高糖組低，且差別有統計學意義(P＜0.05)；大鼠CTGF miRNA質粒干擾組表達量比高糖組低，且差別有統計學意義(P＜0.05)；川芎嗪組表達量較大鼠CTGF miRNA干擾組低，且差別有統計學意義(P＜0.05)。
表3
各組I型膠原的表達水平(n=6,3 討論
CTGF為近期新發現的致纖維化的重要細胞因子，在肝纖維化、肺纖維化及腎纖維化等各種器官的纖維化中均起著非常重要的作用[7-8]。在正常的生理狀況下，CTGF的表達量較低，且主要在間質細胞中表達，主要作用也限于結締組織。但在肝纖維化過程中，CTGF可在各種細胞因子及有害因素的刺激下表達增加，主要刺激因素有TGF-beta、血管內皮生長因子、脂質過氧化產物如丙二醛、乙醛、高糖及血小板衍生因子，其中以TGF-beta刺激作用最強，經刺激后CTGF主要表現為促進血管平滑肌細胞增生、刺激細胞外基質合成及抑制細胞外基質的降解，使細胞外基質在肝內過度沉積，從而導致纖維化[9-10]。
TGF-beta在肝纖維化的發生發展中也起著重要的作用，在各種慢性肝損傷時，TGF-beta持續過度表達，可促進HSC活化、增殖并分泌大量細胞外基質成分，從而促進肝纖維化的形成。此外，TGF-beta還可以上調CTGF表達。CTGF作為TGF-beta的下游效應介質，可促進Ⅰ、Ⅲ型膠原特別是Ⅰ型膠原顯著增加，特異性地介導TGF-beta的促纖維化效應[8]。但是，TGF-beta的生物學作用除了促進肝纖維化外，還有其他重要的抗炎、調節免疫等作用，完全阻斷TGF-beta雖可以抗纖維化，但還可能出現其他的全身炎癥反應、免疫抑制異常等不良后果，而且除了TGF-beta外還有其他的刺激因素如脂質過氧化物、高糖等均可導致CTGF表達增多，故下調CTGF的表達成為抗肝纖維化的研究重點。微小RNA干擾(miRNA)是近年發展起來的一項新興分子生物學技術，可高效、特異地下調細胞中基因的表達，可用于抗肝纖維化藥物的作用機制研究[11-12]。
本實驗顯示高糖組CTGF、TGF-beta的表達量較低糖對照組高，川芎嗪組及大鼠CTGF miRNA質粒干擾組CTGF、TGF-beta和Ⅰ型膠原的表達量較高糖組低，由此推論川芎嗪可能通過抑制CTGF、TGF-beta的表達，從而阻斷Ⅰ型膠原的合成，發揮抗高糖刺激的肝纖維化效應，這可能是其抗肝纖維化的一個重要分子機制。本實驗還發現，大鼠CTGF miRNA干擾組CTGF的表達量與川芎嗪組相比，差別無統計學意義，而川芎嗪組Ⅰ型膠原表達量比大鼠CTGF miRNA干擾組低，且差別有統計學意義，由此推論川芎嗪下調Ⅰ型膠原表達量的作用機制可能不只通過下調TGF、CTGF途徑，還有其他的機制，但具體什么作用機制有待進一步研究。
