體外誘導人骨髓的間充質干細胞(MSCs)分化成為血管內皮樣細胞(ELCs),探討骨髓來源的MSCs作為組織工程血管種子細胞的可行性。通過密度梯度離心,分離人骨髓的單個核細胞,DMEM貼壁培養MSCs,多次傳代貼壁培養純化MSCs,包含血管內皮生長因子(VEGF)、人成纖維細胞生長因子(hFGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和人表皮生長因子(hEGF)的EBM-2培養基誘導MSCs向ELCs分化,倒置顯微鏡觀察ELCs的形態,流式細胞儀檢測ELCs的血管內皮鈣粘素(VE-cadherin)、CD133和CD31表達,免疫熒光檢測ELCs的CD31和血管性假血友病因子(vWF)表達。結果顯示,貼壁培養的MSCs呈長梭形,旋渦狀生長,經過誘導細胞形態發生改變,細胞形態變圓,與血管內皮細胞(ECs)相似;流式細胞儀結果顯示ELCs表達ECs的特異性標志物CD31和VE-cadherin,不表達CD133;免疫熒光結果也顯示ELCs表達CD31和vWF。結果表明:MSCs具有定向誘導分化為ECs的潛能,MSCs來源的ELCs具有與ECs相似的細胞生物學特征,提示骨髓來源的MSCs可作為血管組織工程的種子細胞。
引用本文： 徐蓉, 徐金勇, 劉瑋. 骨髓間充質干細胞定向分化為血管內皮樣細胞的實驗研究. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(2): 389-393. doi: 10.7507/1001-5515.20140073 復制
引言
種子細胞來源是構建組織工程血管面臨的主要問題，合適的種子細胞應該具有易獲取、無創性、高增殖和易擴增的特點[1]。盡管自體血管壁細胞來源的內皮細胞具有不產生免疫排異和血栓形成等優勢[2]，但成體的內皮細胞屬于分化成熟細胞，增殖能力弱，且取材具有創傷性，限制了其在臨床上的應用。骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有易獲得、旺盛的增殖及向內皮細胞分化的潛能，獨特的免疫特性以及可自體移植等優勢，目前認為是最理想的組織工程血管種子細胞。本研究通過體外培養人MSCs，定向誘導MSCs分化為內皮樣細胞(vascular endothelial-like cells,ELCs)，探討MSCs作為血管組織工程種子細胞的可行性。
1 材料與方法
1.1 細胞及動物來源
細胞來源于安徽醫科大學婦產科流產女性胎兒2例，胎齡為孕16~20周，簽署知情同意書。
1.2 主要試劑
細胞培養試劑DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、0.25%胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)、多聚賴氨酸、GlutaMAX、青鏈霉素等購自Invitrogen公司；單核細胞分離液(Ficoll-PaqueTM Plus)購自StemCell公司；EBM-2(endothelial cell growth medium-2)培養液包含5%FBS、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、人成纖維細胞生長因子(human fibroblast growth factor,hFGF)、胰島素樣生長因子-1(insulin like growth factors 1,IGF-1)、人表皮生長因子(human epidermal growth factor,EGF)、氫化可的松(Hydrocortisone)和抗壞血酸(Ascorbic acid)等，購自Cambrex公司；熒光抗體PE標記的CD133購自Miltenyi Biotec公司、FITC標記的血管內皮鈣粘素(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)購自Santa Cruz公司、PE標記的CD31購自BD Bioscience公司；單克隆兔抗人vWF(Von Willebrand factor,vWF)抗體購自Dako公司；多克隆兔抗人CD31抗體購自Santa Cruz公司；其他為國產分析純。
1.3 MSCs和臍靜脈內皮細胞培養
MSCs培養：無菌取胎兒脛骨、股骨，用預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)液沖洗骨髓腔，收集沖洗的液體，Ficoll分離液梯度離心獲得骨髓單個核細胞，經PBS洗滌兩次，含10% FBS的DMEM重懸細胞，按1.5×105 cell/cm2接種細胞于培養瓶中，置于飽和濕度、37 ℃、5% CO2恒溫培養箱培養，2 d后更換培養液，當細胞達80%融合時，常規消化、傳代，首次按1∶3的比例傳代培養。
臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)培養：無菌取胎兒臍帶，用預冷的PBS沖洗靜脈管腔，將臍靜脈一端用止血鉗夾閉，從另一端注入預熱37 ℃的0.25%胰蛋白酶至血管充盈，37 ℃水浴中消化10 min，收集消化液，加入2倍于消化液的含20% FBS的DMEM終止消化，1 000 r/min離心10 min，EBM-2完全培養液重懸，1×104 cell/cm2接種于預先包被的培養瓶，置37 ℃、5% CO2孵育箱中培養，2 d后更換培養液，待細胞長至80%融合狀態后傳代培養。
1.4 MSCs體外誘導分化
取第3代生長狀態良好的MSCs，按1×104 cell/cm2種植密度接種于預先包被的培養瓶，加入EBM-2誘導培養液誘導分化，每3 d更換培養液一次，待長到80%~90%融合時以1∶3傳代，傳代3次以上，倒置顯微鏡觀察細胞形態，免疫熒光染色鑒定。對照組單純加入含10%胎牛血清的DMEM培養液，傳代培養。
1.5 細胞表型鑒定
收集MSCs及其誘導分化的ELCs，以及胎兒臍帶靜脈來源的HUVECs，PBS洗滌2次，重懸在100 μL包含1% BSA的PBS，轉入FCM試管，每管細胞總數約1×106，分別加入PE或FITC標記的VE-cadherin、CD133和CD31熒光抗體，4 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀(Becton Dickinson)檢測。Win MDI 2.9軟件分析結果。
1.6 免疫熒光鑒定
4%多聚甲醛固定培養的MSCs及其誘導分化的ELCs，以及臍帶靜脈來源的HUVECs，PBS沖洗3次，0.01% Triton-X100孵育，PBS沖洗3次，加CD31、vWF抗體，37 ℃孵育60 min(對照組用PBS代替一抗)，PBS沖洗3次，加入熒光標記的二抗，37 ℃孵育60 min，PBS沖洗3次，DAPI染核10 min，PBS沖洗3次，甘油封片，顯微鏡觀察、照相。
2 結果
2.1 MSCs及HUVECs原代培養
胎兒來源的骨髓單核細胞培養48 h后，可見貼壁的細胞體積小、圓形、多角形，散在生長(見圖 1a)。培養72 h后可見貼壁細胞呈集落樣生長，細胞呈長梭形、三角形、紡錘形或不規則形狀細胞(見圖 1b)。5~6 d后成片生長的細胞集落相互連接，細胞呈螺旋狀、放射狀排列(見圖 1c)。傳代培養后長梭形細胞生長快，傳代2~3次后，基本為均一的成纖維樣細胞。
圖1
MSCs及HUVECs原代培養
(a)胎兒骨髓來源的單核細胞貼壁培養，48 h后可見多種形狀的貼壁細胞；(b)長梭形細胞生長快速，3 d后以長梭形細胞為主；(c)培養5 d后可見細胞達到80%融合，長梭形細胞呈渦旋狀生長; (d)胎兒臍靜脈來源的內皮細胞貼壁培養，24 h后細胞貼壁，伸出偽足，48 h后可見多種形狀的貼壁細胞；(e)5 d后細胞達到80%融合，以橢圓型細胞為主；(f)細胞完全融合后，呈鋪路石樣排列
Figure1. Primary culture of MSCs and HUVECs(a) monocytes adherent cultured for 48 hours; (b) primary culture for 72 hours; (c) spindle-shaped cells arranged in the vortex growth after 5 days; (d) HUVECs adherent cultured for 48 hours; (e) cells are 80% confluent after 3-5 days; (f) cobblestone-shaped cells arranged as a monolayer
原代培養的HUVECs貼壁培養48 h，伸出偽足，細胞呈圓形或不規則形狀(見圖 1d)。3~5 d生長至80%融合狀態(見圖 1e)。生長到融合狀態的細胞呈單層“鋪路石”樣排列(見圖 1f)。
2.2 細胞表型鑒定
流式細胞儀結果顯示，MSCs誘導分化的ELCs具有HUVECs特征，高表達內皮細胞特異性標志CD31和VE-cadherin，不表達造血干/祖細胞特異性表面標志CD133(見圖 2)。
圖2
MSCs來源的的ELCs和HUVECs細胞表面標志
(a)HUVECs表達CD31；(b)HUVECs表達VE-cadherin；(c)HUVECs不表達CD133;(d)MSCs來源的ELCs表達CD31；(e)MSCs來源的ELCs表達VE-cadherin；(f)MSCs來源的ELCs不表達CD133
Figure2. Cell surface markers of ELCs and HUVECs derived from MSCs(a) HUVECs expressed CD31； (b) HUVECs expressed VE-cadherin； (c) HUVECs did not express CD133; (d) MSCs dervied ELCs expressed CD31； (e) MSCs dervied ELCs expressed VE-cadherin；(f) MSCs dervied ELCs did not express CD133
2.3 MSCs向內皮細胞分化
傳代培養的MSCs加入EBM-2誘導培養液誘導分化，倒置顯微鏡下觀察誘導4 d后MSCs細胞形態發生改變，細胞趨于圓形(見圖 3b)，誘導7 d后細胞形態進一步趨于圓形(見圖 3c)。免疫熒光檢測顯示，誘導后的細胞表達CD31(見圖 3d)，部分表達vWF(見圖 3e)。對照組MSCs細胞形態為長梭形(見圖 3a)，不表達CD31和vWF(結果未顯示)。
圖3
MSCs誘導分化成為ELCs
(a)傳代培養的MSCs；(b)誘導分化4 d后細胞形態趨向于圓形；(c)進一步誘導分化，7 d后細胞以圓形為主；(d)誘導后的ELCs表達CD31；(e)部分表達vWF
Figure3. MSCs differentiation into ELCs(a) the passged culture of MSCs; (b) the morphology of cells induced by EBM-2 medium changed from spindle to round; (c) the number of round cells reached about 80% after 7 days of induction; (d) the cells expressed CD31 after induction; (e) the cells expressed vWF factor partly after induction
3 討論
種子細胞的獲取、培養是組織工程血管研究的關鍵環節。理想的血管組織工程種子細胞具有易于獲得和體外擴增、低免疫源性、內皮細胞分化能力等特點[3-4]。MSCs具有易分離、取材方便、對機體無害、取自自體、不存在組織配型及免疫排斥問題，以及能自我復制和向內皮細胞分化等特性，有望成為組織工程血管種子細胞的主要來源[5-6]。
目前MSCs分選方法主要包括貼壁篩選法、流式細胞分選法、免疫磁珠分選法等，流式細胞儀或免疫磁珠篩選需要標記，并易造成細胞機械性損傷，因此，目前多采用貼壁傳代篩選，根據細胞生長速度差異，通過反復貼壁培養，篩選純化MSCs[7]。本研究在體外分離骨髓單核細胞，貼壁培養骨髓來源的MSCs，結果發現原代培養MSCs開始貼壁階段，細胞形態不一，增殖較慢，5~6 d后細胞增殖快速，細胞形態以長梭形細胞為主。經過4~5次傳代培養，MSCs細胞形狀呈長梭形，呈放射狀或旋渦樣排列。
MSCs是來源于中胚層的成體干細胞，可分化成為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、內皮細胞和平滑肌細胞等中胚層的組織細胞[8-9]。MSCs表達微血管系統早期發育和血管內皮細胞增殖的標志物CD105，還表達參與血管生成的內皮細胞黏附分子VEGFR-2、血管內皮細胞黏附分子(VCAM-1)和細胞間黏附分子(I-CAM-1)。目前MSCs向內皮細胞的誘導及分化機制尚未清楚。Wang等[10]用內皮細胞條件培養基培養小鼠骨髓來源的單核細胞，能形成血管內皮細胞克隆，進一步檢測發現，血管內皮細胞條件培養基包含VEGF、人堿性成纖維細胞生長因子和粒細胞-巨噬細胞克隆刺激因子，能刺激內皮祖細胞增殖，抑制MSCs生長。Kuwana等[11]用包含VEGF、人堿性成纖維細胞生長因子和IGF-1等的EBM-2培養基誘導MSCs向ELCs分化，結果發現誘導后的ELCs表達血管內皮細胞的特異性標志CD31和vWF因子，ELCs在體外可形成毛細血管樣的結構，具有與人血管內皮細胞一樣的表型和功能特征。本研究與Kuwana等采用的誘導方法相似，通過包含VEGF、hFGF-b、IGF-1和hEGF的EBM-2培養基，誘導MSCs向ELCs分化，流式細胞儀和免疫熒光的結果均顯示，誘導后的ELCs表達內皮細胞表面標記物CD31和vW因子，證實MSCs具有向血管內皮細胞分化的潛能。盡管目前誘導MSCs向內皮細胞分化的因子和誘導條件不盡相同，但誘導因子中均包含VEGF和人堿性成纖維細胞生長因子，VEGF具有上調其受體KDR和FLT-l的表達，促進內皮細胞的生長[12]，因此，VEGF被認為是MSCs分化為血管內皮細胞的重要條件。
種子細胞來源是血管組織工程面臨的一大難題。尋找合適的種子細胞是目前血管組織工程學研究的熱點。MSCs具有取材損傷小、體外擴增、不存在免疫排斥、多向分化潛能等優點，最有希望成為血管組織工程理想的種子細胞。本研究通過定向誘導MSCs分化為ELCs，證實MSCs來源的ELCs具有血管內皮特征，為MSCs作為血管組織工程細胞的可行性提供理論和實驗依據。
引言
種子細胞來源是構建組織工程血管面臨的主要問題，合適的種子細胞應該具有易獲取、無創性、高增殖和易擴增的特點[1]。盡管自體血管壁細胞來源的內皮細胞具有不產生免疫排異和血栓形成等優勢[2]，但成體的內皮細胞屬于分化成熟細胞，增殖能力弱，且取材具有創傷性，限制了其在臨床上的應用。骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有易獲得、旺盛的增殖及向內皮細胞分化的潛能，獨特的免疫特性以及可自體移植等優勢，目前認為是最理想的組織工程血管種子細胞。本研究通過體外培養人MSCs，定向誘導MSCs分化為內皮樣細胞(vascular endothelial-like cells,ELCs)，探討MSCs作為血管組織工程種子細胞的可行性。
1 材料與方法
1.1 細胞及動物來源
細胞來源于安徽醫科大學婦產科流產女性胎兒2例，胎齡為孕16~20周，簽署知情同意書。
1.2 主要試劑
細胞培養試劑DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、0.25%胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)、多聚賴氨酸、GlutaMAX、青鏈霉素等購自Invitrogen公司；單核細胞分離液(Ficoll-PaqueTM Plus)購自StemCell公司；EBM-2(endothelial cell growth medium-2)培養液包含5%FBS、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、人成纖維細胞生長因子(human fibroblast growth factor,hFGF)、胰島素樣生長因子-1(insulin like growth factors 1,IGF-1)、人表皮生長因子(human epidermal growth factor,EGF)、氫化可的松(Hydrocortisone)和抗壞血酸(Ascorbic acid)等，購自Cambrex公司；熒光抗體PE標記的CD133購自Miltenyi Biotec公司、FITC標記的血管內皮鈣粘素(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)購自Santa Cruz公司、PE標記的CD31購自BD Bioscience公司；單克隆兔抗人vWF(Von Willebrand factor,vWF)抗體購自Dako公司；多克隆兔抗人CD31抗體購自Santa Cruz公司；其他為國產分析純。
1.3 MSCs和臍靜脈內皮細胞培養
MSCs培養：無菌取胎兒脛骨、股骨，用預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)液沖洗骨髓腔，收集沖洗的液體，Ficoll分離液梯度離心獲得骨髓單個核細胞，經PBS洗滌兩次，含10% FBS的DMEM重懸細胞，按1.5×105 cell/cm2接種細胞于培養瓶中，置于飽和濕度、37 ℃、5% CO2恒溫培養箱培養，2 d后更換培養液，當細胞達80%融合時，常規消化、傳代，首次按1∶3的比例傳代培養。
臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)培養：無菌取胎兒臍帶，用預冷的PBS沖洗靜脈管腔，將臍靜脈一端用止血鉗夾閉，從另一端注入預熱37 ℃的0.25%胰蛋白酶至血管充盈，37 ℃水浴中消化10 min，收集消化液，加入2倍于消化液的含20% FBS的DMEM終止消化，1 000 r/min離心10 min，EBM-2完全培養液重懸，1×104 cell/cm2接種于預先包被的培養瓶，置37 ℃、5% CO2孵育箱中培養，2 d后更換培養液，待細胞長至80%融合狀態后傳代培養。
1.4 MSCs體外誘導分化
取第3代生長狀態良好的MSCs，按1×104 cell/cm2種植密度接種于預先包被的培養瓶，加入EBM-2誘導培養液誘導分化，每3 d更換培養液一次，待長到80%~90%融合時以1∶3傳代，傳代3次以上，倒置顯微鏡觀察細胞形態，免疫熒光染色鑒定。對照組單純加入含10%胎牛血清的DMEM培養液，傳代培養。
1.5 細胞表型鑒定
收集MSCs及其誘導分化的ELCs，以及胎兒臍帶靜脈來源的HUVECs，PBS洗滌2次，重懸在100 μL包含1% BSA的PBS，轉入FCM試管，每管細胞總數約1×106，分別加入PE或FITC標記的VE-cadherin、CD133和CD31熒光抗體，4 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀(Becton Dickinson)檢測。Win MDI 2.9軟件分析結果。
1.6 免疫熒光鑒定
4%多聚甲醛固定培養的MSCs及其誘導分化的ELCs，以及臍帶靜脈來源的HUVECs，PBS沖洗3次，0.01% Triton-X100孵育，PBS沖洗3次，加CD31、vWF抗體，37 ℃孵育60 min(對照組用PBS代替一抗)，PBS沖洗3次，加入熒光標記的二抗，37 ℃孵育60 min，PBS沖洗3次，DAPI染核10 min，PBS沖洗3次，甘油封片，顯微鏡觀察、照相。
2 結果
2.1 MSCs及HUVECs原代培養
胎兒來源的骨髓單核細胞培養48 h后，可見貼壁的細胞體積小、圓形、多角形，散在生長(見圖 1a)。培養72 h后可見貼壁細胞呈集落樣生長，細胞呈長梭形、三角形、紡錘形或不規則形狀細胞(見圖 1b)。5~6 d后成片生長的細胞集落相互連接，細胞呈螺旋狀、放射狀排列(見圖 1c)。傳代培養后長梭形細胞生長快，傳代2~3次后，基本為均一的成纖維樣細胞。
圖1
MSCs及HUVECs原代培養
(a)胎兒骨髓來源的單核細胞貼壁培養，48 h后可見多種形狀的貼壁細胞；(b)長梭形細胞生長快速，3 d后以長梭形細胞為主；(c)培養5 d后可見細胞達到80%融合，長梭形細胞呈渦旋狀生長; (d)胎兒臍靜脈來源的內皮細胞貼壁培養，24 h后細胞貼壁，伸出偽足，48 h后可見多種形狀的貼壁細胞；(e)5 d后細胞達到80%融合，以橢圓型細胞為主；(f)細胞完全融合后，呈鋪路石樣排列
Figure1. Primary culture of MSCs and HUVECs(a) monocytes adherent cultured for 48 hours; (b) primary culture for 72 hours; (c) spindle-shaped cells arranged in the vortex growth after 5 days; (d) HUVECs adherent cultured for 48 hours; (e) cells are 80% confluent after 3-5 days; (f) cobblestone-shaped cells arranged as a monolayer
原代培養的HUVECs貼壁培養48 h，伸出偽足，細胞呈圓形或不規則形狀(見圖 1d)。3~5 d生長至80%融合狀態(見圖 1e)。生長到融合狀態的細胞呈單層“鋪路石”樣排列(見圖 1f)。
2.2 細胞表型鑒定
流式細胞儀結果顯示，MSCs誘導分化的ELCs具有HUVECs特征，高表達內皮細胞特異性標志CD31和VE-cadherin，不表達造血干/祖細胞特異性表面標志CD133(見圖 2)。
圖2
MSCs來源的的ELCs和HUVECs細胞表面標志
(a)HUVECs表達CD31；(b)HUVECs表達VE-cadherin；(c)HUVECs不表達CD133;(d)MSCs來源的ELCs表達CD31；(e)MSCs來源的ELCs表達VE-cadherin；(f)MSCs來源的ELCs不表達CD133
Figure2. Cell surface markers of ELCs and HUVECs derived from MSCs(a) HUVECs expressed CD31； (b) HUVECs expressed VE-cadherin； (c) HUVECs did not express CD133; (d) MSCs dervied ELCs expressed CD31； (e) MSCs dervied ELCs expressed VE-cadherin；(f) MSCs dervied ELCs did not express CD133
2.3 MSCs向內皮細胞分化
傳代培養的MSCs加入EBM-2誘導培養液誘導分化，倒置顯微鏡下觀察誘導4 d后MSCs細胞形態發生改變，細胞趨于圓形(見圖 3b)，誘導7 d后細胞形態進一步趨于圓形(見圖 3c)。免疫熒光檢測顯示，誘導后的細胞表達CD31(見圖 3d)，部分表達vWF(見圖 3e)。對照組MSCs細胞形態為長梭形(見圖 3a)，不表達CD31和vWF(結果未顯示)。
圖3
MSCs誘導分化成為ELCs
(a)傳代培養的MSCs；(b)誘導分化4 d后細胞形態趨向于圓形；(c)進一步誘導分化，7 d后細胞以圓形為主；(d)誘導后的ELCs表達CD31；(e)部分表達vWF
Figure3. MSCs differentiation into ELCs(a) the passged culture of MSCs; (b) the morphology of cells induced by EBM-2 medium changed from spindle to round; (c) the number of round cells reached about 80% after 7 days of induction; (d) the cells expressed CD31 after induction; (e) the cells expressed vWF factor partly after induction
3 討論
種子細胞的獲取、培養是組織工程血管研究的關鍵環節。理想的血管組織工程種子細胞具有易于獲得和體外擴增、低免疫源性、內皮細胞分化能力等特點[3-4]。MSCs具有易分離、取材方便、對機體無害、取自自體、不存在組織配型及免疫排斥問題，以及能自我復制和向內皮細胞分化等特性，有望成為組織工程血管種子細胞的主要來源[5-6]。
目前MSCs分選方法主要包括貼壁篩選法、流式細胞分選法、免疫磁珠分選法等，流式細胞儀或免疫磁珠篩選需要標記，并易造成細胞機械性損傷，因此，目前多采用貼壁傳代篩選，根據細胞生長速度差異，通過反復貼壁培養，篩選純化MSCs[7]。本研究在體外分離骨髓單核細胞，貼壁培養骨髓來源的MSCs，結果發現原代培養MSCs開始貼壁階段，細胞形態不一，增殖較慢，5~6 d后細胞增殖快速，細胞形態以長梭形細胞為主。經過4~5次傳代培養，MSCs細胞形狀呈長梭形，呈放射狀或旋渦樣排列。
MSCs是來源于中胚層的成體干細胞，可分化成為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、內皮細胞和平滑肌細胞等中胚層的組織細胞[8-9]。MSCs表達微血管系統早期發育和血管內皮細胞增殖的標志物CD105，還表達參與血管生成的內皮細胞黏附分子VEGFR-2、血管內皮細胞黏附分子(VCAM-1)和細胞間黏附分子(I-CAM-1)。目前MSCs向內皮細胞的誘導及分化機制尚未清楚。Wang等[10]用內皮細胞條件培養基培養小鼠骨髓來源的單核細胞，能形成血管內皮細胞克隆，進一步檢測發現，血管內皮細胞條件培養基包含VEGF、人堿性成纖維細胞生長因子和粒細胞-巨噬細胞克隆刺激因子，能刺激內皮祖細胞增殖，抑制MSCs生長。Kuwana等[11]用包含VEGF、人堿性成纖維細胞生長因子和IGF-1等的EBM-2培養基誘導MSCs向ELCs分化，結果發現誘導后的ELCs表達血管內皮細胞的特異性標志CD31和vWF因子，ELCs在體外可形成毛細血管樣的結構，具有與人血管內皮細胞一樣的表型和功能特征。本研究與Kuwana等采用的誘導方法相似，通過包含VEGF、hFGF-b、IGF-1和hEGF的EBM-2培養基，誘導MSCs向ELCs分化，流式細胞儀和免疫熒光的結果均顯示，誘導后的ELCs表達內皮細胞表面標記物CD31和vW因子，證實MSCs具有向血管內皮細胞分化的潛能。盡管目前誘導MSCs向內皮細胞分化的因子和誘導條件不盡相同，但誘導因子中均包含VEGF和人堿性成纖維細胞生長因子，VEGF具有上調其受體KDR和FLT-l的表達，促進內皮細胞的生長[12]，因此，VEGF被認為是MSCs分化為血管內皮細胞的重要條件。
種子細胞來源是血管組織工程面臨的一大難題。尋找合適的種子細胞是目前血管組織工程學研究的熱點。MSCs具有取材損傷小、體外擴增、不存在免疫排斥、多向分化潛能等優點，最有希望成為血管組織工程理想的種子細胞。本研究通過定向誘導MSCs分化為ELCs，證實MSCs來源的ELCs具有血管內皮特征，為MSCs作為血管組織工程細胞的可行性提供理論和實驗依據。
