研究核因子κB受體活化因子配體(RANKL)對唑來膦酸(ZOL)誘發的破骨細胞生成及NF-κB p50和c-Jun基因表達抑制的挽救效應。體外分離小鼠顱骨成骨細胞(OB),并與RAW264.7細胞共培養。將細胞分為4組,給予ZOL和RANKL處理;于不同時間點檢測破骨細胞(OC)生成及NF-κB p50和c-Jun基因表達情況。B組(ZOL組) TRAP陽性多核OC及吸收陷窩最少(P＜0.05或P＜0.01),其次為C組(ZOL+RANKL組),D組(RANKL組) OC及吸收陷窩最多,與A組(對照)相似(P＞0.05)。NF-κB p50和c-Jun基因表達也是B組最低(P＜0.05或P＜0.01),而C組較B組顯著升高(P＜0.05),A組和D組基因表達最高且表達水平相近(P＞0.05)。實驗結果表明,RANKL可以在共培養體系中部分挽救ZOL對OC生成的抑制作用;而NF-κB p50和c-Jun可能介導了RANKL和ZOL對OC的上述效應。
引用本文： 徐純峰, 李鵬, 董偉, 丁士育, 李任, 戚孟春, 李金源. 核因子κB受體活化因子配體對唑來膦酸誘發的破骨細胞生成及NF-κBp50和c-Jun基因表達抑制的挽救效應. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(2): 385-388. doi: 10.7507/1001-5515.20140072 復制
引言
破骨細胞(osteoclast,OC)是體內惟一具有骨吸收功能的多核巨細胞，在骨質疏松、風濕性關節炎、Paget’s 病等疾病中發揮著重要作用[1]。OC分化、生成離不開成骨細胞(osteoblast,OB)的信號刺激；OB產生核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)，與OC表面受體RANK結合，激活胞內NF-κB、JNK/c-Jun、c-Fos等信號通路，誘發NFATc1等基因表達，促使OC分化和生成[2]。含氮雙膦酸鹽作為治療上述疾病的首選藥物，主要通過抑制OC生成、黏附、骨吸收，誘發細胞凋亡來發揮作用[3]，但其確切分子機制尚需進一步澄清。本研究通過與OB共培養法培養OC，探討唑來膦酸(zoledronate acid,ZOL)對OC胞內RANKL下游信號分子NF-κB、c-Jun基因表達的影響，以及外源性RANKL對ZOL作用的挽救效應，以進一步揭示雙膦酸鹽作用的分子機制。
1 材料和方法
1.1 實驗材料
RAW264.7細胞株購自北京軍事醫學科學院；唑來膦酸、PGE2、l,25-(OH)2 VitD3、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色試劑盒，美國Sigma公司；DMEM培養基、胎牛血清，美國Hyclone公司；RANKL，美國Biovision公司；鼠抗鼠NF-κB P50單克隆抗體，美國SANTA CRUZ公司；兔抗鼠c-Jun多克隆抗體，英國ABCAM公司；羊抗兔GAPDH多克隆抗體，杭州賢至生物；熒光FITC標記的IgG，武漢博士德生物科技有限公司。
1.2 OB-OC共培養及實驗分組
胰酶消化法獲取小鼠顱骨OB[4]，體外培養；第3代OB用于共培養實驗。將第3代OB 1×103個/孔和破骨前體細胞(RAW264.7) 4×103個/孔混合接種于48孔板。用含有前列腺素(1×10-7 mol/L)、l，25-(OH)2D3(1×10-8 mol/L)、10%胎牛血清的DMEM完全培養基37 ℃、5% CO2條件下培養。
細胞分為4組：A組為對照組，不進行處理；B組用2.5×10-8 mol/L ZOL處理；C組用2.5×10-8 mol/L ZOL和50 ng/mL RANKL處理；D組用50 ng/mL RANKL處理。于共培養第4 d，細胞分別進行藥物處理；24 h后撤去藥液；繼續培養。
1.3 OC生成檢測
TRAP染色：取共培養第8 d的細胞爬片，按TRAP染色試劑盒操作說明進行染色，顯微鏡下觀察。OC數目計算方法為：200倍下隨機選取5個視野，計數每視野中TRAP染色陽性細胞(細胞核≥3個，胞質內出現棕褐色顆粒)數目，5個視野平均值為該細胞爬片的OC數目。
吸收陷窩檢測：取共培養第8 d的牙本質磨片，掃描電鏡下觀察。500倍下隨機選取5個視野拍照，用醫學數碼圖像分析系統Med6.0測量5個視野吸收陷窩數目及陷窩面積，5個視野平均值代表該牙本質磨片的陷窩數目及面積。
1.4 real-time PCR檢測c-Jun和p50基因表達
細胞給藥后繼續培養24 h，收獲細胞，提取細胞總RNA；逆轉錄為cDNA；所用引物為：c-Jun上游5′-CGGACCGTTCTATGACTGC-3′ ，下游3-′GTGATGTGCCCATTGCTG-5′；NF-κB p50上游5′-AGTTTGACGGTCGTGAGCT -3′，下游3′-TGTGGGTAGGATTTCTTGTTC-5′；GAPDH上游5′-AATGTGTCCGTCGTGGATCT-3′，下游5′-TCC ACCACCCTGTTGCTGTA-3′。然后在Rotor-Gene 3000熒光定量PCR儀上進行擴增；總反應體系為20 μL，反應條件為：95 ℃，15 s；60 ℃，40 s；72 ℃，15 s；50個循環。每組細胞取三孔標本進行檢測。
1.5 Western blot 檢測
細胞經藥物處理后繼續培養24 h，收獲細胞，RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑混合液(100∶1)提取蛋白質，測定蛋白質濃度，煮沸變性5 min，凝膠電泳并轉膜，經5% BSA室溫封閉2 h，NF-κB P50、c-Jun、GADPH抗體作為一抗孵育過夜。二抗室溫1 h，DAB顯色1 min。用ImageJ分析軟件檢測膜上每個條帶的灰度值。
1.6 統計學處理
數據用均數±標準差(
2 結果
2.1 RANKL及ZOL對OC生成的影響
細胞共培養第8 d，各組均有TRAP染色陽性多核OC形成(見圖 1、表 1)，但各組OC數目存在明顯差異。B組OC數量最少，顯著少于其它各組(P＜0.01)；C組顯著多于B組(P＜0.01)；而A組和D組最多，二者的OC數量相近(P＞0.05)。上述結果提示，ZOL可顯著抑制共培育體系中OC生成，而外源性RANKL則對OC生成有促進作用，部分抵消了ZOL對OC的抑制。
圖1
TRAP染色檢測四組破骨細胞生成情況(200×)
Figure1.
Examination of osteoclastogenesis in 4 groups by TRAP staning (200×)
表1
各組細胞TRAP陽性細胞及骨吸收陷窩計數 (n=5,牙本質磨片SEM檢測結果如圖 2和表 1所示。各組比較，B組吸收陷窩數目最少，面積最小(P＜0.01或P＜0.05)；C組次之；D組吸收陷窩數目最多，面積最大，但與A組相近(P＞0.05)。上述結果說明，ZOL可顯著抑制共培育體系中OC的骨吸收功能，而外源性RANKL則對OC骨吸收有促進作用，并部分抵消了ZOL對OC的抑制。
圖2
掃描電鏡檢測牙本質磨片吸收陷窩情況 (500×)
Figure2.
Detection of dentin resorption lacunae by scanning electron microscope (500×)
2.2 c-Jun、NF-κB p50 mRNA水平
c-Jun、NF-κB p50基因mRNA相對濃度如表 2所示。兩者相對濃度均為B組最低(P＜0.05)；C組較B組顯著上升(P＜0.05)，但仍低于A組(P＜0.05)；D組mRNA則與A組相似(P＞0.05)。上述結果提示ZOL可顯著抑制p50、c-Jun mRNA水平；而外源性RANKL則可部分減弱ZOL對上述基因表達的抑制。
表2
real-timePCR檢測細胞c-Jun、NF-κBp50基因mRNA水平(n=3,2.3 NF-κB p50和c-Jun蛋白表達
NF-κB p50、c-Jun蛋白表達如圖 3所示。B組p50、c-Jun蛋白灰度值較A組明顯減弱，分別為A組的32.8%和41.29%；C組則較B組明顯增強，分別為A組的56.56%和52.00%；D組則和A組相似，分別為A組的89.79%和103.50%。上述結果說明，ZOL可顯著抑制NF-κB p50、c-Jun蛋白在OC中的表達；而外源性RANKL則可促進上述蛋白表達，減弱ZOL對OC的抑制作用。
圖3
Western blot檢測NF-κB p50、c-Jun在OC中表達
Figure3.
Detection of NF-κB p50 and c-Jun expression in osteoclasts by Western blot
3 討論
OC分化、生成受許多因子的調節，其中OB產生的RANKL和骨保護素(osteoprotegerin，OPG)發揮著至關重要的作用。RANKL與OC表面受體RANK結合，募集適配分子腫瘤壞死因子受體相關因子6(TNF receptor-associated factor 6，TRAP6)，進而激活下游一系列信號通路，如NF-κB、Akt、MAPKs(包括JNK/c-Jun和p38)、AP-1等[2, 5]，進而激活c-Fos、NFATc1等下游關鍵基因表達，最終誘使OC分化、生成[5]。
NF-κB家族有5個成員：RelA (p65)、 p50、 p52、 RelB 和 c-Rel；其中p50和RelA組成的異源二構體是NF-κB最常見的形式[6]。p50-RelA二聚體通常與其抑制蛋白IκBα結合，處于無活性狀態；在上游分子作用下，IκBα被蛋白水解酶迅速降解，使NF-κB異源二聚體進入胞核；調控細胞因子、酶、生長因子等表達，促使OC分化、生成[6]。研究表明，NF-κB是OC分化的重要信號通路；p50/p52雙敲除小鼠由于OC前體不能向成熟OC分化[7]，而出現牙齒萌出障礙和骨硬化癥[8]；這些小鼠來源的脾細胞即使在RANKL刺激下，也不表達c-Fos和NFATc1，形成OC[9]。
c-Jun是RANKL胞內MAPKs信號通路的重要分子；在外界刺激下，激酶JNK使之磷酸化并激活。c-Jun與Fos家族中c-Fos組成二聚體，形成AP-1；而AP-1是調控NFATc1等許多OC關鍵基因的轉錄因子[2]。c-Jun基因敲除可導致體外OC分化發生明顯障礙[10]。而表達無活性c-Jun(dominant-negative)的轉基因小鼠也因OC生成障礙出現嚴重的骨硬化癥；這些小鼠的脾細胞在RANKL刺激下向OC分化的能力及NFATc1表達均受到嚴重抑制[11]。上述結果說明，c-Jun表達及活性對RANKL依賴的OC分化是不可替代的。
本研究中，在OC-OB共培養第4 d用ZOL處理；此時，正處于OC前體細胞分化的細胞融合(多核化)階段；所用ZOL濃度(2.5×10-8 mol/L)較低，時間較短(24 h)，未發現細胞毒性。ZOL作用下，NF-κB p50和c-Jun mRNA及蛋白水平均顯著降低，隨后(第8 d)TRAP陽性多核OC生成及牙本質磨片上骨吸收陷窩也受到顯著抑制，提示ZOL可在OC分化階段發揮抑制作用，而NF-κB p50和c-Jun 可能介導了其對OC分化的抑制。我們前期研究發現，ZOL可以抑制OC胞內c-Fos、NFATc1、Atp6v0d2等基因表達；這可能與ZOL對上游分子NF-κB、c-Jun的表達抑制有關。而Cheng等[12]的研究也證實，人參皂甙(ginsenoside)Rb1對OC生成及c-Fos、NFATc1基因表達的抑制是由JNK/c-Jun及NF-κB信號通路介導的。
RANKL可以通過多種胞內信號通路誘發OC分化、生成；而ZOL則對OC生成具有顯著抑制作用。那么，補充外源性RANKL能否克服ZOL對OC生成的抑制及其機制如何，目前尚不清楚。本研究在共培養體系中，用ZOL處理的同時加入50 ng/mL RANKL，發現NF-κB p50和c-Jun基因表達顯著上升，TRAP陽性多核OC生成及骨吸收陷窩也顯著增加；提示外源性RANKL部分挽救了ZOL對OC的抑制作用，而NF-κB p50和c-Jun參與了上述作用。Sutherland等[13]研究也表明，外源性RANKL可顯著減弱阿倫膦酸誘發的OC凋亡，促進OC生成及骨吸收；也支持RANKL對雙膦酸鹽的這種挽救效應。
需要指出的是，本研究中D組OC生成及基因表達情況與對照組A組相似，提示共培養體系中OB產生的RANKL水平足以調控OC分化、生成；而外源性RANKL作用有限。同時，C組外源性RANKL并未完全挽救ZOL對NF-κB p50、c-Jun基因表達及OC生成的抑制，這可能與加入的外源性RANKL劑量較低及ZOL其它胞內抑制效應(如對甲羥戊酸信號途徑的抑制)有關。
本研究顯示，在OB-OC共培養體系中，RANKL可以在OC分化階段部分挽救ZOL對OC生成的抑制；RANKL和ZOL的效應可能由信號分子NF-κB p50、c-Jun介導。
引言
破骨細胞(osteoclast,OC)是體內惟一具有骨吸收功能的多核巨細胞，在骨質疏松、風濕性關節炎、Paget’s 病等疾病中發揮著重要作用[1]。OC分化、生成離不開成骨細胞(osteoblast,OB)的信號刺激；OB產生核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)，與OC表面受體RANK結合，激活胞內NF-κB、JNK/c-Jun、c-Fos等信號通路，誘發NFATc1等基因表達，促使OC分化和生成[2]。含氮雙膦酸鹽作為治療上述疾病的首選藥物，主要通過抑制OC生成、黏附、骨吸收，誘發細胞凋亡來發揮作用[3]，但其確切分子機制尚需進一步澄清。本研究通過與OB共培養法培養OC，探討唑來膦酸(zoledronate acid,ZOL)對OC胞內RANKL下游信號分子NF-κB、c-Jun基因表達的影響，以及外源性RANKL對ZOL作用的挽救效應，以進一步揭示雙膦酸鹽作用的分子機制。
1 材料和方法
1.1 實驗材料
RAW264.7細胞株購自北京軍事醫學科學院；唑來膦酸、PGE2、l,25-(OH)2 VitD3、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色試劑盒，美國Sigma公司；DMEM培養基、胎牛血清，美國Hyclone公司；RANKL，美國Biovision公司；鼠抗鼠NF-κB P50單克隆抗體，美國SANTA CRUZ公司；兔抗鼠c-Jun多克隆抗體，英國ABCAM公司；羊抗兔GAPDH多克隆抗體，杭州賢至生物；熒光FITC標記的IgG，武漢博士德生物科技有限公司。
1.2 OB-OC共培養及實驗分組
胰酶消化法獲取小鼠顱骨OB[4]，體外培養；第3代OB用于共培養實驗。將第3代OB 1×103個/孔和破骨前體細胞(RAW264.7) 4×103個/孔混合接種于48孔板。用含有前列腺素(1×10-7 mol/L)、l，25-(OH)2D3(1×10-8 mol/L)、10%胎牛血清的DMEM完全培養基37 ℃、5% CO2條件下培養。
細胞分為4組：A組為對照組，不進行處理；B組用2.5×10-8 mol/L ZOL處理；C組用2.5×10-8 mol/L ZOL和50 ng/mL RANKL處理；D組用50 ng/mL RANKL處理。于共培養第4 d，細胞分別進行藥物處理；24 h后撤去藥液；繼續培養。
1.3 OC生成檢測
TRAP染色：取共培養第8 d的細胞爬片，按TRAP染色試劑盒操作說明進行染色，顯微鏡下觀察。OC數目計算方法為：200倍下隨機選取5個視野，計數每視野中TRAP染色陽性細胞(細胞核≥3個，胞質內出現棕褐色顆粒)數目，5個視野平均值為該細胞爬片的OC數目。
吸收陷窩檢測：取共培養第8 d的牙本質磨片，掃描電鏡下觀察。500倍下隨機選取5個視野拍照，用醫學數碼圖像分析系統Med6.0測量5個視野吸收陷窩數目及陷窩面積，5個視野平均值代表該牙本質磨片的陷窩數目及面積。
1.4 real-time PCR檢測c-Jun和p50基因表達
細胞給藥后繼續培養24 h，收獲細胞，提取細胞總RNA；逆轉錄為cDNA；所用引物為：c-Jun上游5′-CGGACCGTTCTATGACTGC-3′ ，下游3-′GTGATGTGCCCATTGCTG-5′；NF-κB p50上游5′-AGTTTGACGGTCGTGAGCT -3′，下游3′-TGTGGGTAGGATTTCTTGTTC-5′；GAPDH上游5′-AATGTGTCCGTCGTGGATCT-3′，下游5′-TCC ACCACCCTGTTGCTGTA-3′。然后在Rotor-Gene 3000熒光定量PCR儀上進行擴增；總反應體系為20 μL，反應條件為：95 ℃，15 s；60 ℃，40 s；72 ℃，15 s；50個循環。每組細胞取三孔標本進行檢測。
1.5 Western blot 檢測
細胞經藥物處理后繼續培養24 h，收獲細胞，RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑混合液(100∶1)提取蛋白質，測定蛋白質濃度，煮沸變性5 min，凝膠電泳并轉膜，經5% BSA室溫封閉2 h，NF-κB P50、c-Jun、GADPH抗體作為一抗孵育過夜。二抗室溫1 h，DAB顯色1 min。用ImageJ分析軟件檢測膜上每個條帶的灰度值。
1.6 統計學處理
數據用均數±標準差(
2 結果
2.1 RANKL及ZOL對OC生成的影響
細胞共培養第8 d，各組均有TRAP染色陽性多核OC形成(見圖 1、表 1)，但各組OC數目存在明顯差異。B組OC數量最少，顯著少于其它各組(P＜0.01)；C組顯著多于B組(P＜0.01)；而A組和D組最多，二者的OC數量相近(P＞0.05)。上述結果提示，ZOL可顯著抑制共培育體系中OC生成，而外源性RANKL則對OC生成有促進作用，部分抵消了ZOL對OC的抑制。
圖1
TRAP染色檢測四組破骨細胞生成情況(200×)
Figure1.
Examination of osteoclastogenesis in 4 groups by TRAP staning (200×)
表1
各組細胞TRAP陽性細胞及骨吸收陷窩計數 (n=5,牙本質磨片SEM檢測結果如圖 2和表 1所示。各組比較，B組吸收陷窩數目最少，面積最小(P＜0.01或P＜0.05)；C組次之；D組吸收陷窩數目最多，面積最大，但與A組相近(P＞0.05)。上述結果說明，ZOL可顯著抑制共培育體系中OC的骨吸收功能，而外源性RANKL則對OC骨吸收有促進作用，并部分抵消了ZOL對OC的抑制。
圖2
掃描電鏡檢測牙本質磨片吸收陷窩情況 (500×)
Figure2.
Detection of dentin resorption lacunae by scanning electron microscope (500×)
2.2 c-Jun、NF-κB p50 mRNA水平
c-Jun、NF-κB p50基因mRNA相對濃度如表 2所示。兩者相對濃度均為B組最低(P＜0.05)；C組較B組顯著上升(P＜0.05)，但仍低于A組(P＜0.05)；D組mRNA則與A組相似(P＞0.05)。上述結果提示ZOL可顯著抑制p50、c-Jun mRNA水平；而外源性RANKL則可部分減弱ZOL對上述基因表達的抑制。
表2
real-timePCR檢測細胞c-Jun、NF-κBp50基因mRNA水平(n=3,2.3 NF-κB p50和c-Jun蛋白表達
NF-κB p50、c-Jun蛋白表達如圖 3所示。B組p50、c-Jun蛋白灰度值較A組明顯減弱，分別為A組的32.8%和41.29%；C組則較B組明顯增強，分別為A組的56.56%和52.00%；D組則和A組相似，分別為A組的89.79%和103.50%。上述結果說明，ZOL可顯著抑制NF-κB p50、c-Jun蛋白在OC中的表達；而外源性RANKL則可促進上述蛋白表達，減弱ZOL對OC的抑制作用。
圖3
Western blot檢測NF-κB p50、c-Jun在OC中表達
Figure3.
Detection of NF-κB p50 and c-Jun expression in osteoclasts by Western blot
3 討論
OC分化、生成受許多因子的調節，其中OB產生的RANKL和骨保護素(osteoprotegerin，OPG)發揮著至關重要的作用。RANKL與OC表面受體RANK結合，募集適配分子腫瘤壞死因子受體相關因子6(TNF receptor-associated factor 6，TRAP6)，進而激活下游一系列信號通路，如NF-κB、Akt、MAPKs(包括JNK/c-Jun和p38)、AP-1等[2, 5]，進而激活c-Fos、NFATc1等下游關鍵基因表達，最終誘使OC分化、生成[5]。
NF-κB家族有5個成員：RelA (p65)、 p50、 p52、 RelB 和 c-Rel；其中p50和RelA組成的異源二構體是NF-κB最常見的形式[6]。p50-RelA二聚體通常與其抑制蛋白IκBα結合，處于無活性狀態；在上游分子作用下，IκBα被蛋白水解酶迅速降解，使NF-κB異源二聚體進入胞核；調控細胞因子、酶、生長因子等表達，促使OC分化、生成[6]。研究表明，NF-κB是OC分化的重要信號通路；p50/p52雙敲除小鼠由于OC前體不能向成熟OC分化[7]，而出現牙齒萌出障礙和骨硬化癥[8]；這些小鼠來源的脾細胞即使在RANKL刺激下，也不表達c-Fos和NFATc1，形成OC[9]。
c-Jun是RANKL胞內MAPKs信號通路的重要分子；在外界刺激下，激酶JNK使之磷酸化并激活。c-Jun與Fos家族中c-Fos組成二聚體，形成AP-1；而AP-1是調控NFATc1等許多OC關鍵基因的轉錄因子[2]。c-Jun基因敲除可導致體外OC分化發生明顯障礙[10]。而表達無活性c-Jun(dominant-negative)的轉基因小鼠也因OC生成障礙出現嚴重的骨硬化癥；這些小鼠的脾細胞在RANKL刺激下向OC分化的能力及NFATc1表達均受到嚴重抑制[11]。上述結果說明，c-Jun表達及活性對RANKL依賴的OC分化是不可替代的。
本研究中，在OC-OB共培養第4 d用ZOL處理；此時，正處于OC前體細胞分化的細胞融合(多核化)階段；所用ZOL濃度(2.5×10-8 mol/L)較低，時間較短(24 h)，未發現細胞毒性。ZOL作用下，NF-κB p50和c-Jun mRNA及蛋白水平均顯著降低，隨后(第8 d)TRAP陽性多核OC生成及牙本質磨片上骨吸收陷窩也受到顯著抑制，提示ZOL可在OC分化階段發揮抑制作用，而NF-κB p50和c-Jun 可能介導了其對OC分化的抑制。我們前期研究發現，ZOL可以抑制OC胞內c-Fos、NFATc1、Atp6v0d2等基因表達；這可能與ZOL對上游分子NF-κB、c-Jun的表達抑制有關。而Cheng等[12]的研究也證實，人參皂甙(ginsenoside)Rb1對OC生成及c-Fos、NFATc1基因表達的抑制是由JNK/c-Jun及NF-κB信號通路介導的。
RANKL可以通過多種胞內信號通路誘發OC分化、生成；而ZOL則對OC生成具有顯著抑制作用。那么，補充外源性RANKL能否克服ZOL對OC生成的抑制及其機制如何，目前尚不清楚。本研究在共培養體系中，用ZOL處理的同時加入50 ng/mL RANKL，發現NF-κB p50和c-Jun基因表達顯著上升，TRAP陽性多核OC生成及骨吸收陷窩也顯著增加；提示外源性RANKL部分挽救了ZOL對OC的抑制作用，而NF-κB p50和c-Jun參與了上述作用。Sutherland等[13]研究也表明，外源性RANKL可顯著減弱阿倫膦酸誘發的OC凋亡，促進OC生成及骨吸收；也支持RANKL對雙膦酸鹽的這種挽救效應。
需要指出的是，本研究中D組OC生成及基因表達情況與對照組A組相似，提示共培養體系中OB產生的RANKL水平足以調控OC分化、生成；而外源性RANKL作用有限。同時，C組外源性RANKL并未完全挽救ZOL對NF-κB p50、c-Jun基因表達及OC生成的抑制，這可能與加入的外源性RANKL劑量較低及ZOL其它胞內抑制效應(如對甲羥戊酸信號途徑的抑制)有關。
本研究顯示，在OB-OC共培養體系中，RANKL可以在OC分化階段部分挽救ZOL對OC生成的抑制；RANKL和ZOL的效應可能由信號分子NF-κB p50、c-Jun介導。
