本研究的目的是觀察內脂素(visfatin)能否誘導心肌細胞發生肥大表型變化,并初步探討其機制。將體外培養的H9c2心肌細胞,分別用3種不同濃度的visfatin干預不同的時間后檢測心肌細胞是否發生肥大的表型改變。并在內質網應激(ERS)的阻斷劑普伐他汀或激動劑毒胡蘿卜素預處理的基礎上,再用visfatin刺激以進行機制探討。采用F-actin免疫熒光法檢測細胞骨架變化來觀察心肌細胞表面積的變化,用熒光定量PCR檢測肥大標志物心房鈉尿肽(ANP)、腦尿鈉肽(BNP),以及ERS標志物葡萄糖調節蛋白78(GRP78)、C/EPB環磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白(CHOP)及激活轉錄因子ATF6的基因表達水平變化。用Western blot檢測GRP78和CHOP的蛋白表達水平改變。結果顯示,100 ng/mL或150 ng/mL濃度的visfatin作用24 h,以及100 ng/mL濃度的visfatin作用24 h或48 h,均能誘導心肌細胞出現明顯的肥大表型。100 ng/mL濃度的visfatin作用24 h還能誘導心肌細胞發生ERS。普伐他汀預處理能明顯降低visfatin誘導的心肌細胞ANP及BNP的mRNA表達水平,而毒胡蘿卜素預處理則顯著增加上述因子的表達水平。實驗結果提示,visfatin可通過促發ERS而誘導心肌細胞發生肥大表型改變。
引用本文： 李君麗, 廖延標, 陸立慧, 馮駿, 吳文超, 劉小菁. visfatin誘導心肌細胞肥大的機制初探. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(2): 379-384. doi: 10.7507/1001-5515.20140071 復制
引言
心肌肥厚不僅是心臟對各種刺激的功能性代償反應，而且是心臟病發病及死亡的獨立危險因素，其發生的主要危險因素有高血壓、糖尿病、肥胖等[1]。目前認為肥胖是一種慢性炎癥性狀態；而內臟脂肪組織具有內分泌功能，通過分泌脂肪細胞因子參與了機體的免疫反應、糖脂代謝及炎癥反應等過程。這些脂肪細胞因子水平的變化，如瘦素的升高、脂聯素的下降等與心血管疾病發生發展有密切關系。
內脂素(visfatin)是2005年由Fukuhara等[2]發現的脂肪細胞因子，與2型糖尿病及心血管疾病發病密切相關[3]。近來研究提示，visfatin可能參與了心肌肥厚及心衰的發病過程[3-5]，但其機制尚不清楚；內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)介導了心肌細胞肥大的過程[6]，但visfatin與ERS間的關系亦尚未闡明。為此，本實驗觀察了visfatin能否誘導心肌細胞發生肥大表型改變，并初步探索ERS在其中的作用。
1 材料和試劑
大鼠心肌細胞H9c2是常用于體外研究的心肌細胞[7-8]，來源于美國模式培養物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)，由四川大學華西醫院移植與免疫實驗室惠贈，保存于本研究室。DMEM-高糖型培養基、胰蛋白酶、TRIzol購自美國Invitrogen公司，胎牛血清(FBS)由Hyclone提供，RT-PCR試劑盒(Rever Tra Ace組合型)購自TOYOBO，SsoFast EvaGreen Supermix 由BIO-RAD提供,PCR引物由Invitrogen公司合成。BCA蛋白定量試劑盒購自Pierce公司，小鼠抗GRP78抗體、小鼠抗β-actin抗體購自Santa-Cruz公司，兔抗CHOP抗體購自CST公司，山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋公司。其余試劑均為市售分析純產品。
2 實驗方法
2.1 細胞培養及干預
在體外實驗中，H9c2細胞具有和大鼠原代心肌細胞相似的肥大細胞表型應答[7]，因此我們將其作為研究細胞。H9c2心肌細胞用含10% FBS的DMEM高糖完全培養基，于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下靜置培養，細胞密度達90%后，以0.25%胰酶消化傳代。取對數生長期H9c2細胞,在含1%牛血清白蛋白的無血清培養基中饑餓6 h后進行干預。干預措施為：分別用濃度為50、100或150 ng/mL的visfatin(Biovision公司)刺激24 h，或在100 ng/mL濃度下分別刺激12、24或48 h后檢測各組細胞基因及蛋白水平變化。另外，分別在ERS的阻斷劑普伐他汀(10 μmol/L)或激動劑毒胡蘿卜素(0.1 μmol/L，Enzo公司)預處理2 h的基礎上再用100 ng/mL的visfatin進行干預24 h，收集細胞RNA或蛋白進行實驗。
2.2 RT-PCR定量法測定基因表達變化
采用TRIzol試劑提取H9c2心肌細胞總RNA，具體按試劑說明書操作。將1.5 μg 總RNA逆轉錄后采用SsoFast EvaGreen Supermix在定量PCR儀(CFX96TM，BIO-RAD)上對肥大標志基因心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、腦尿鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)，以及ERS標志物GRP78、CHOP、ATF6的mRNA變化進行熒光定量檢測。
檢測基因的引物序列如表 1所示，以β-actin作為內參基因對目的基因的表達量進行校正。實驗所用反應條件為：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性10 s，59 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環。同時做溶解曲線以觀察擴增產物的特異性。運用Pfaffl數據模型計算檢測基因的相對表達，并比較處理組與對照組之間基因的表達差異。
表1
定量RT-PCR所用的引物序列
Table1.
Primer sequences for real-time PCR
2.3 心肌細胞表面積測定
通過免疫熒光檢測細胞骨架F-actin的表達來測定心肌細胞表面積的變化[7-8]。首先制備心肌細胞爬片，visfatin刺激完成后取出細胞爬片，常規細胞骨架(10 μmol/L的 phalloidin)免疫熒光染色，倒置熒光顯微鏡(Nikon Eclipse TE2000-Y system,Japan)下觀察心肌細胞中F-actin的變化。結果用Media Cybemetics公司的Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件 (IPP)進行灰度值分析。
2.4 細胞總蛋白測定
細胞經過相應刺激后，分別加入含蛋白酶抑制劑復合物cocktail(Roche公司)的RIPA蛋白裂解液150 μL,收集細胞總蛋白，BCA法測定蛋白總量。
2.5 Western blot檢測蛋白水平變化
收集細胞總蛋白,取30 μg總蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后，將蛋白轉至PVDF膜；封閉后孵育一抗(GRP78，1∶200；CHOP,1∶1 000;β-actin,1∶4 000)4 ℃過夜。TBST洗滌后室溫孵育二抗(1∶4 000)2 h,增強化學發光(enhanced chemiluminescence,ECL，Pierce) 顯影。Quantity One4.6.1軟件對條帶進行灰度分析，將目的蛋白條帶與內參的比值作為半定量指標。
2.6 統計學方法
實驗結果以均數±標準差(
3 結果
3.1 visfatin刺激能誘導H9c2心肌細胞出現肥大表型
心肌細胞是一種高度分化的終末細胞，其肥大表型變化包括體積增大、心肌細胞內收縮蛋白類型改變、蛋白合成增加等，而ANP和BNP的誘導表達是目前公認的鑒定心肌細胞肥大的指標。我們的實驗結果顯示，100 ng/mL或150 ng/mL濃度的visfatin作用H9c2細胞24 h后，細胞中ANP及BNP的基因表達均明顯上調(見圖 1a)。100 ng/mL的visfatin作用24 h或48 h后，細胞中ANP和BNP的基因表達均顯著增加(見圖 1b)。
圖1
Visfatin刺激誘導心肌細胞肥大標志ANP、BNP基因的表達(n=3，(a)50、100及150 ng/mL visfatin刺激24h; (b)100 ng/mL的visfatin分別刺激12、24或48 h。*
(a) visfatin treatment of 50,100 or 150 ng/mL for 24 h; (b) visfatin treatment of 100 ng/mL for 12,24 or 48 h.*
蛋白總量測定及F-actin染色結果分別顯示，100 ng/mL的visfatin刺激24 h或48 h后，細胞總蛋白含量及心肌細胞面積均明顯增加(見圖 2)。
圖2
visfatin刺激對心肌細胞總蛋白及面積的影響(n=3，(a)細胞骨架F-actin染色的熒光顯微鏡觀察照片，綠色為F-actin染色，藍色為DAPI染細胞核(放大倍數 200×); (b)細胞總蛋白變化；(c)F-actin染色觀察細胞面積變化的半定量統計結果。*
(a) observation of cytoskeleton F-actin staining by fluorescence microscope; the green color indicated F-actin staining and the blue indicated the cell nucleus stained by DAPI (magnification 200×); (b) total protein contents change detected by BCA method; (c) statistical analysis of cell surface change in H9c2 cells. *
以上數據提示，100 ng/mL及150 ng/mL濃度的visfatin作用24 h，以及100 ng/mL濃度的visfatin作用24 h或48 h均能誘導心肌細胞出現明顯的肥大表型。研究報道急性心衰患者血漿中visfatin水平較正常人明顯增加[(79.3±6.2) ng/mL vs (16.9±2.3) ng/mL][5]，因此本研究的后續實驗采用100 ng/mL的visfatin刺激24 h，這也是國內外相關研究中常采用的刺激濃度及時間[9-10]。
3.2 ERS介導了visfatin誘導的心肌細胞肥大改變
研究顯示ERS參與了心肌細胞肥大的過程[6]。我們在實驗中觀察到，100 ng/mL濃度的visfatin刺激24 h后，細胞中內質網穩態的感受器和監測分子GRP78、CHOP及ATF6的mRNA與蛋白表達水平明顯上調(見圖 3a、b)。提示visfatin刺激破壞了心肌細胞內質網穩態并引發ERS。
圖3
ERS介導了visfatin誘導的心肌細胞肥大(n=3，(a)RT-PCR檢測visfatin刺激后ERS標志物GRP78、CHOP及ATF6的基因表達變化;(b)Western blot法測定CHOP及GRP78蛋白水平變化(C-1、C-2為對照組，V-24-1及V-24-2為visfatin刺激組);(c)RT-PCR檢測ERS抑制劑或激動劑預處理后ERS標志物GRP78、CHOP及ATF6基因表達變化;(d)RT-PCR檢測ERS抑制劑或激動劑預處理后心肌細胞肥大的標志ANP及BNP基因表達變化。*
(a) gene expressions of ERS markers GRP78,CHOP and ATF6 were detected by RT-PCR; (b) protein expression levels of CHOP and CRP78 were assessed by Western blot; (c) gene expressions of GRP78,CHOP and ATF6 were measured by RT-PCR after pravastatin or thapsigargin pre-treatment; (d) gene expressions of ANP and BNP in H9c2 cells were examined by RT-PCR after pravastatin or thapsigargin pre-treatment. *
為了進一步驗證此結果，我們用ERS阻斷劑普伐他汀或激動劑毒胡蘿卜素預處理細胞2 h后再用visfatin進行干預。普伐他汀預處理后，GRP78、CHOP及ATF6的mRNA表達水平較visfatin單獨刺激組明顯下調；而毒胡蘿卜素預處理后，GRP78、CHOP及ATF6的mRNA表達較visfatin單獨刺激組明顯升高(見圖 3c)。
更重要的是，普伐他汀預處理能顯著降低vistain誘導的心肌細胞ANP和BNP的mRNA表達水平，而毒胡蘿卜素預處理則顯著地增加它們的表達水平(見圖 3d)。上述結果提示，ERS可能介導了visfatin誘導的心肌細胞肥大過程。
4 討論
流行病學研究提示，肥胖是心肌肥厚發生的主要危險因素之一，但肥胖導致心肌肥厚的機制目前仍未完全闡明[1]。脂肪細胞因子是由內臟脂肪組織分泌的具有多種生理活性的蛋白質或多肽，介導其部分功能，主要有瘦素、脂聯素及visfatin等。
visfatin亦稱前B細胞克隆增強因子(pre-B-cell colony-enhancing factor,PBEF)，主要在內臟脂肪組織中表達，具有多種生物學活性,如參與炎癥應答、影響內皮功能、調節脂代謝等[3]。研究顯示，在血管內皮細胞中visfatin可誘導炎癥因子，如單核細胞趨化蛋白-1、細胞間黏附分子-1和血管細胞黏附分子-1等表達[10]。血管緊張素Ⅱ在誘導心肌細胞肥大過程中可上調visfatin的表達[4]；在急性心衰患者血漿中visfatin含量明顯增加，且心衰標志物NT-proBNP與血漿visfatin含量之間呈正相關關系[5]。但visfatin與心肌細胞肥大之間有何關系目前報道甚少。
本研究中，我們應用H9c2心肌細胞，觀察到100 ng/mL的visfatin作用24 h或48 h均能導致心肌細胞發生肥大的表型改變。同時，visfatin刺激還使內質網上分子伴侶GRP78及內質網膜上的感受器ATF6的表達增加，ERS特異性促細胞凋亡轉錄因子CHOP亦被誘導表達。
研究顯示，ERS參與了心肌細胞肥大及凋亡的過程，可能是調控心肌細胞重塑發生的又一新機制。當內質網穩態受到破壞，如發生未折疊或錯誤折疊蛋白質聚集、Ca2+耗竭或脂質合成紊亂等,將通過未折疊蛋白反應信號通路,引發細胞內一系列的反應,稱為ERS。適度的 ERS 有利于維持細胞穩態，持續的ERS則啟動其相關信號途徑從而介導心肌細胞肥大的發生發展過程[10-11] 。研究報道，肥胖能引起下丘腦發生ERS并產生瘦素抵抗[12]，而關于visfatin與ERS相互作用的研究卻不多。
為進一步驗證visfatin是通過促發ERS來誘導心肌細胞肥大的過程，我們在visfatin刺激細胞之前，應用ERS的阻斷劑普伐他汀和激動劑毒胡蘿卜素分別預處理H9c2細胞。結果顯示，普伐他汀預處理能明顯降低ERS的標志物GRP78、CHOP及ATF6的mRNA表達水平，而毒胡蘿卜素預處理則顯著地增加上述因子的表達水平。尤其重要的是，visfatin誘導的ANP和BNP的mRNA表達水平亦被ERS阻斷劑下調，而ANP及BNP的誘導表達則能被ERS激動劑進一步上調。
綜上，本研究提示ERS可能介導了visfatin誘導的心肌細胞肥大過程，但具體是ERS的哪條通路參與，以及visfatin是否還通過激活其它信號途徑來誘導心肌細胞肥大等，值得進一步研究。
引言
心肌肥厚不僅是心臟對各種刺激的功能性代償反應，而且是心臟病發病及死亡的獨立危險因素，其發生的主要危險因素有高血壓、糖尿病、肥胖等[1]。目前認為肥胖是一種慢性炎癥性狀態；而內臟脂肪組織具有內分泌功能，通過分泌脂肪細胞因子參與了機體的免疫反應、糖脂代謝及炎癥反應等過程。這些脂肪細胞因子水平的變化，如瘦素的升高、脂聯素的下降等與心血管疾病發生發展有密切關系。
內脂素(visfatin)是2005年由Fukuhara等[2]發現的脂肪細胞因子，與2型糖尿病及心血管疾病發病密切相關[3]。近來研究提示，visfatin可能參與了心肌肥厚及心衰的發病過程[3-5]，但其機制尚不清楚；內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)介導了心肌細胞肥大的過程[6]，但visfatin與ERS間的關系亦尚未闡明。為此，本實驗觀察了visfatin能否誘導心肌細胞發生肥大表型改變，并初步探索ERS在其中的作用。
1 材料和試劑
大鼠心肌細胞H9c2是常用于體外研究的心肌細胞[7-8]，來源于美國模式培養物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)，由四川大學華西醫院移植與免疫實驗室惠贈，保存于本研究室。DMEM-高糖型培養基、胰蛋白酶、TRIzol購自美國Invitrogen公司，胎牛血清(FBS)由Hyclone提供，RT-PCR試劑盒(Rever Tra Ace組合型)購自TOYOBO，SsoFast EvaGreen Supermix 由BIO-RAD提供,PCR引物由Invitrogen公司合成。BCA蛋白定量試劑盒購自Pierce公司，小鼠抗GRP78抗體、小鼠抗β-actin抗體購自Santa-Cruz公司，兔抗CHOP抗體購自CST公司，山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋公司。其余試劑均為市售分析純產品。
2 實驗方法
2.1 細胞培養及干預
在體外實驗中，H9c2細胞具有和大鼠原代心肌細胞相似的肥大細胞表型應答[7]，因此我們將其作為研究細胞。H9c2心肌細胞用含10% FBS的DMEM高糖完全培養基，于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下靜置培養，細胞密度達90%后，以0.25%胰酶消化傳代。取對數生長期H9c2細胞,在含1%牛血清白蛋白的無血清培養基中饑餓6 h后進行干預。干預措施為：分別用濃度為50、100或150 ng/mL的visfatin(Biovision公司)刺激24 h，或在100 ng/mL濃度下分別刺激12、24或48 h后檢測各組細胞基因及蛋白水平變化。另外，分別在ERS的阻斷劑普伐他汀(10 μmol/L)或激動劑毒胡蘿卜素(0.1 μmol/L，Enzo公司)預處理2 h的基礎上再用100 ng/mL的visfatin進行干預24 h，收集細胞RNA或蛋白進行實驗。
2.2 RT-PCR定量法測定基因表達變化
采用TRIzol試劑提取H9c2心肌細胞總RNA，具體按試劑說明書操作。將1.5 μg 總RNA逆轉錄后采用SsoFast EvaGreen Supermix在定量PCR儀(CFX96TM，BIO-RAD)上對肥大標志基因心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、腦尿鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)，以及ERS標志物GRP78、CHOP、ATF6的mRNA變化進行熒光定量檢測。
檢測基因的引物序列如表 1所示，以β-actin作為內參基因對目的基因的表達量進行校正。實驗所用反應條件為：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性10 s，59 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環。同時做溶解曲線以觀察擴增產物的特異性。運用Pfaffl數據模型計算檢測基因的相對表達，并比較處理組與對照組之間基因的表達差異。
表1
定量RT-PCR所用的引物序列
Table1.
Primer sequences for real-time PCR
2.3 心肌細胞表面積測定
通過免疫熒光檢測細胞骨架F-actin的表達來測定心肌細胞表面積的變化[7-8]。首先制備心肌細胞爬片，visfatin刺激完成后取出細胞爬片，常規細胞骨架(10 μmol/L的 phalloidin)免疫熒光染色，倒置熒光顯微鏡(Nikon Eclipse TE2000-Y system,Japan)下觀察心肌細胞中F-actin的變化。結果用Media Cybemetics公司的Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件 (IPP)進行灰度值分析。
2.4 細胞總蛋白測定
細胞經過相應刺激后，分別加入含蛋白酶抑制劑復合物cocktail(Roche公司)的RIPA蛋白裂解液150 μL,收集細胞總蛋白，BCA法測定蛋白總量。
2.5 Western blot檢測蛋白水平變化
收集細胞總蛋白,取30 μg總蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后，將蛋白轉至PVDF膜；封閉后孵育一抗(GRP78，1∶200；CHOP,1∶1 000;β-actin,1∶4 000)4 ℃過夜。TBST洗滌后室溫孵育二抗(1∶4 000)2 h,增強化學發光(enhanced chemiluminescence,ECL，Pierce) 顯影。Quantity One4.6.1軟件對條帶進行灰度分析，將目的蛋白條帶與內參的比值作為半定量指標。
2.6 統計學方法
實驗結果以均數±標準差(
3 結果
3.1 visfatin刺激能誘導H9c2心肌細胞出現肥大表型
心肌細胞是一種高度分化的終末細胞，其肥大表型變化包括體積增大、心肌細胞內收縮蛋白類型改變、蛋白合成增加等，而ANP和BNP的誘導表達是目前公認的鑒定心肌細胞肥大的指標。我們的實驗結果顯示，100 ng/mL或150 ng/mL濃度的visfatin作用H9c2細胞24 h后，細胞中ANP及BNP的基因表達均明顯上調(見圖 1a)。100 ng/mL的visfatin作用24 h或48 h后，細胞中ANP和BNP的基因表達均顯著增加(見圖 1b)。
圖1
Visfatin刺激誘導心肌細胞肥大標志ANP、BNP基因的表達(n=3，(a)50、100及150 ng/mL visfatin刺激24h; (b)100 ng/mL的visfatin分別刺激12、24或48 h。*
(a) visfatin treatment of 50,100 or 150 ng/mL for 24 h; (b) visfatin treatment of 100 ng/mL for 12,24 or 48 h.*
蛋白總量測定及F-actin染色結果分別顯示，100 ng/mL的visfatin刺激24 h或48 h后，細胞總蛋白含量及心肌細胞面積均明顯增加(見圖 2)。
圖2
visfatin刺激對心肌細胞總蛋白及面積的影響(n=3，(a)細胞骨架F-actin染色的熒光顯微鏡觀察照片，綠色為F-actin染色，藍色為DAPI染細胞核(放大倍數 200×); (b)細胞總蛋白變化；(c)F-actin染色觀察細胞面積變化的半定量統計結果。*
(a) observation of cytoskeleton F-actin staining by fluorescence microscope; the green color indicated F-actin staining and the blue indicated the cell nucleus stained by DAPI (magnification 200×); (b) total protein contents change detected by BCA method; (c) statistical analysis of cell surface change in H9c2 cells. *
以上數據提示，100 ng/mL及150 ng/mL濃度的visfatin作用24 h，以及100 ng/mL濃度的visfatin作用24 h或48 h均能誘導心肌細胞出現明顯的肥大表型。研究報道急性心衰患者血漿中visfatin水平較正常人明顯增加[(79.3±6.2) ng/mL vs (16.9±2.3) ng/mL][5]，因此本研究的后續實驗采用100 ng/mL的visfatin刺激24 h，這也是國內外相關研究中常采用的刺激濃度及時間[9-10]。
3.2 ERS介導了visfatin誘導的心肌細胞肥大改變
研究顯示ERS參與了心肌細胞肥大的過程[6]。我們在實驗中觀察到，100 ng/mL濃度的visfatin刺激24 h后，細胞中內質網穩態的感受器和監測分子GRP78、CHOP及ATF6的mRNA與蛋白表達水平明顯上調(見圖 3a、b)。提示visfatin刺激破壞了心肌細胞內質網穩態并引發ERS。
圖3
ERS介導了visfatin誘導的心肌細胞肥大(n=3，(a)RT-PCR檢測visfatin刺激后ERS標志物GRP78、CHOP及ATF6的基因表達變化;(b)Western blot法測定CHOP及GRP78蛋白水平變化(C-1、C-2為對照組，V-24-1及V-24-2為visfatin刺激組);(c)RT-PCR檢測ERS抑制劑或激動劑預處理后ERS標志物GRP78、CHOP及ATF6基因表達變化;(d)RT-PCR檢測ERS抑制劑或激動劑預處理后心肌細胞肥大的標志ANP及BNP基因表達變化。*
(a) gene expressions of ERS markers GRP78,CHOP and ATF6 were detected by RT-PCR; (b) protein expression levels of CHOP and CRP78 were assessed by Western blot; (c) gene expressions of GRP78,CHOP and ATF6 were measured by RT-PCR after pravastatin or thapsigargin pre-treatment; (d) gene expressions of ANP and BNP in H9c2 cells were examined by RT-PCR after pravastatin or thapsigargin pre-treatment. *
為了進一步驗證此結果，我們用ERS阻斷劑普伐他汀或激動劑毒胡蘿卜素預處理細胞2 h后再用visfatin進行干預。普伐他汀預處理后，GRP78、CHOP及ATF6的mRNA表達水平較visfatin單獨刺激組明顯下調；而毒胡蘿卜素預處理后，GRP78、CHOP及ATF6的mRNA表達較visfatin單獨刺激組明顯升高(見圖 3c)。
更重要的是，普伐他汀預處理能顯著降低vistain誘導的心肌細胞ANP和BNP的mRNA表達水平，而毒胡蘿卜素預處理則顯著地增加它們的表達水平(見圖 3d)。上述結果提示，ERS可能介導了visfatin誘導的心肌細胞肥大過程。
4 討論
流行病學研究提示，肥胖是心肌肥厚發生的主要危險因素之一，但肥胖導致心肌肥厚的機制目前仍未完全闡明[1]。脂肪細胞因子是由內臟脂肪組織分泌的具有多種生理活性的蛋白質或多肽，介導其部分功能，主要有瘦素、脂聯素及visfatin等。
visfatin亦稱前B細胞克隆增強因子(pre-B-cell colony-enhancing factor,PBEF)，主要在內臟脂肪組織中表達，具有多種生物學活性,如參與炎癥應答、影響內皮功能、調節脂代謝等[3]。研究顯示，在血管內皮細胞中visfatin可誘導炎癥因子，如單核細胞趨化蛋白-1、細胞間黏附分子-1和血管細胞黏附分子-1等表達[10]。血管緊張素Ⅱ在誘導心肌細胞肥大過程中可上調visfatin的表達[4]；在急性心衰患者血漿中visfatin含量明顯增加，且心衰標志物NT-proBNP與血漿visfatin含量之間呈正相關關系[5]。但visfatin與心肌細胞肥大之間有何關系目前報道甚少。
本研究中，我們應用H9c2心肌細胞，觀察到100 ng/mL的visfatin作用24 h或48 h均能導致心肌細胞發生肥大的表型改變。同時，visfatin刺激還使內質網上分子伴侶GRP78及內質網膜上的感受器ATF6的表達增加，ERS特異性促細胞凋亡轉錄因子CHOP亦被誘導表達。
研究顯示，ERS參與了心肌細胞肥大及凋亡的過程，可能是調控心肌細胞重塑發生的又一新機制。當內質網穩態受到破壞，如發生未折疊或錯誤折疊蛋白質聚集、Ca2+耗竭或脂質合成紊亂等,將通過未折疊蛋白反應信號通路,引發細胞內一系列的反應,稱為ERS。適度的 ERS 有利于維持細胞穩態，持續的ERS則啟動其相關信號途徑從而介導心肌細胞肥大的發生發展過程[10-11] 。研究報道，肥胖能引起下丘腦發生ERS并產生瘦素抵抗[12]，而關于visfatin與ERS相互作用的研究卻不多。
為進一步驗證visfatin是通過促發ERS來誘導心肌細胞肥大的過程，我們在visfatin刺激細胞之前，應用ERS的阻斷劑普伐他汀和激動劑毒胡蘿卜素分別預處理H9c2細胞。結果顯示，普伐他汀預處理能明顯降低ERS的標志物GRP78、CHOP及ATF6的mRNA表達水平，而毒胡蘿卜素預處理則顯著地增加上述因子的表達水平。尤其重要的是，visfatin誘導的ANP和BNP的mRNA表達水平亦被ERS阻斷劑下調，而ANP及BNP的誘導表達則能被ERS激動劑進一步上調。
綜上，本研究提示ERS可能介導了visfatin誘導的心肌細胞肥大過程，但具體是ERS的哪條通路參與，以及visfatin是否還通過激活其它信號途徑來誘導心肌細胞肥大等，值得進一步研究。
