為了對金剛烷胺(AM)和聯苯雙酯(DDB)抗乙肝病毒(HBV)的作用進行動物實驗研究,采用高壓注射體內轉染法建立HBV復制小鼠模型,對模型小鼠給藥3 d后處死。用Southern雜交檢測小鼠肝臟HBV DNA復制中間體;ELISA檢測血清中HBeAg和HBsAg。給予AM和二種藥物聯合處理后,小鼠體內HBV DNA復制中間體和HBeAg、HBsAg的水平較對照組明顯降低,而該兩組相比無明顯差異。僅給予DDB的小鼠肝臟HBV DNA復制中間體和血清抗原水平與對照組相比無明顯差異。因此,AM能夠抑制小鼠體內HBV的復制、表達,而連續3 d給予DDB對小鼠體內HBV無抑制作用。
引用本文： 劉鳳君, 蔣智, 周巧玲, 于毅, 孟黃花, 石瑤. 金剛烷胺和聯苯雙酯抗乙型肝炎病毒作用的動物實驗研究. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(2): 400-404. doi: 10.7507/1001-5515.20140075 復制
引言
乙型肝炎是一種嚴重危害人類健康的傳染病，不僅發病人數眾多，而且慢性乙型肝炎易發展成肝硬化和肝癌。慢性乙型肝炎治療的關鍵是抗病毒，病毒的清除或抑制可以阻止或減輕肝臟的損害和疾病的進展。但因為目前尚無徹底清除乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的措施，所以目前慢性乙型肝炎的治療目標是持續抑制HBV的復制，延緩肝病的進展，最終阻止肝硬化和肝癌的發生，藥物主要是干擾素和核苷類似物。然而，現有抗HBV藥物的療效尚不令人滿意，且核苷類似物的長期應用可能導致病毒耐藥株的產生。因此，慢性乙型肝炎抗病毒這一領域的發展方向是尋找新的抗病毒措施，以替代目前抗HBV藥物或與之聯用，延緩或減少耐藥的產生，增強抗HBV的療效。
金剛烷胺(amantadine,AM)是臨床治療帕金森病的藥物之一，也用于預防或治療A型流感病毒的感染。其抗病毒機制尚未完全清楚，主要抑制病毒膜基質蛋白M2的合成，該蛋白為病毒進入宿主細胞所必需，因此可以抑制病毒穿入細胞。同時還可能有以下幾種機制：封閉細胞膜上的病毒通道，抑制病毒脫殼，改變細胞表面電荷，抑制病毒增殖等。以往的研究及循證醫學證據表明該藥對丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)有一定的抑制作用[1-4]。
聯苯雙脂(biphenyl dimethyl dicarboxylate,DDB)是我國中藥五味子的提取物，能有效降低谷丙轉氨酶(alanine transaminase,ALT)的水平，長期作為一種傳統的保肝藥物用于急、慢性肝炎的治療，動物實驗研究發現DDB對小鼠受抑制的體液及細胞免疫功能具有一定的增強作用[5-6]。而Joo等[7-8]利用HBV體外復制細胞模型的研究發現：AM和DDB對HBV的復制具有抑制作用，二者聯用抗病毒作用大大增強。其機制尚不清楚，可能通過激活干擾素樣信號傳導通路而實現的。崔速南等[9-10]在臨床研究中也初步觀察到，大劑量DDB有一定抗HBV的作用。
本研究擬進行動物實驗，進一步驗證以上兩種藥物是否具有抗HBV的作用。目前抗HBV藥物的篩選主要用HBV轉基因小鼠，但轉基因小鼠的獲得非常耗時、費力。而本實驗小組建立的HBV復制型小鼠模型，具有簡便、經濟的特點，最重要的是使用該小鼠模型能夠檢測到目前抗病毒藥物對HBV復制的抑制作用，可用于抗HBV藥物的篩選[11-14]。所以本研究擬用HBV復制小鼠模型對以上兩種藥物抗HBV的作用進行體內研究。
1 材料與方法
1.1 主要試驗材料
復制型HBV 重組質粒pHBV4.1由美國Scripps研究所Alan Mclachlan 教授惠贈，由本研究室保存；質粒DNA轉化感受肽大腸桿菌JM109，擴增、提取及純化采用QIAGEN TIP-500，操作按試劑盒說明書的程序進行。AM由江蘇鵬鷂藥業有限公司生產，批號：H32023575。DDB由浙江海翔藥業股份有限公司提供。AM每日用藥量為720 μg/kg，DDB的每日用量為450 μg/kg，根據體重計算出每只小鼠的用量，分兩次給藥。
1.2 實驗方法
1.2.1 動物實驗
雄性BALB/c小鼠,體重18～20 g,購自四川大學華西實驗動物中心。將10 μg pHBV4.1質粒DNA溶于2 mL的生理鹽水中，在5~8 s內通過尾靜脈注入小鼠體內。注射24 h后，根據小鼠體重、年齡和血清HBeAg水平進行配對，將模型小鼠分成4組：AM組、DDB組、AM+DDB組和對照(NS)組，每組4只。實驗組給予相應的藥物灌胃，NS組給予生理鹽水。用12號小鼠灌胃針灌胃，每日兩次，共3 d。最后一次給藥后6 h處死小鼠，留取小鼠的血清和肝臟。血清儲存于-20 ℃。將小鼠肝組織立即置入液氮迅速冷凍，然后置于-70 ℃保存備用。動物實驗過程如圖 1所示。
圖1
動物實驗流程
Figure1.
The procedure of animal experiment
1.2.2 小鼠肝組織HBV DNA復制中間體的提取及檢測
小鼠肝組織HBV DNA復制中間體的提取和檢測按照我們已報道的方法進行[11]，具體如下：將凍存的肝組織在液氮中碾成粉末，用于提取HBV DNA復制中間體。將0.12 g肝粉溶入0.6 mL的細胞膜裂解液[100 mmol/L Tris.HCL(pH 8.0)、0.2%(vol/vol)NP40]中，14 000 r/min離心1 min。取上清加入MgOAC和DNAaseⅠ使其終濃度分別為6.75 mmol/L 和200 μg/mL，37 ℃孵育1 h。再依次加入 EDTA、SDS、NaCl、蛋白酶使其終濃度分別為10 mmol/L、0.8%(wt/vol)、100 mmol/L和1.6 mg/mL，37 ℃孵育1 h后。然后用酚/氯仿抽提2次，0.7倍體積的異丙醇沉淀DNA,DNA沉淀溶于30 μL[10 mmol/L Tris (pH 8.0),1 mmol/L EDTA],-20 ℃保存備用。取30 μL HBV DNA復制中間體以10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，用Southern雜交檢測HBV DNA復制中間體，雜交采用地高辛標記的HBV全長基因組探針，并用地高辛發光檢測試劑盒檢測結果(Roche Applied Science)。
1.2.3 ELISA檢測小鼠血清HBV相關抗原
分別取50 μL血清采用ELISA檢測HBV表面抗原(HBV surface antigen,HBsAg)和HBV e抗原(HBV e antigen,HBeAg)，抗原的檢測分別采用HBsAg和 HBeAg檢測試劑盒(中國上海科華)。操作按試劑盒說明書進行。
2 結果
2.1 AM和DDB對小鼠體內HBV復制的影響
Southern雜交結果顯示：與對照組相比，AM組和AM+DDB組小鼠肝臟中HBV 復制中間體DNA的水平均降低,經Quantity one 軟件分析，兩組HBV DNA 復制中間體均較對照組降低約30%，但兩組間HBV DNA復制中間體的水平沒有明顯差別。DDB組小鼠肝臟中HBV DNA復制中間體水平與對照組無明顯差異(見圖 2)。
圖2
AM和DDB對HBV轉染小鼠體內病毒復制的影響
(a)Southern雜交檢測HBV DNA復制中間體，HBV RC DNA為HBV 疏松環狀DNA，HBV SS DNA為HBV 單鏈DNA；(b)HBV DNA復制中間體的定量分析，對照組小鼠HBV DNA復制中間體的量設為1.0，其它小鼠的水平與之相比計算出相對值,平均值及標準差來源于2次重復實驗，共8只小鼠
Figure2. Effect of AM and DDB on viral replication in HBV transfected mice(a) DNA (Southern) filter hybridization analysis of HBV replication intermediate： HBV RC DNA: HBV relaxed DNA; HBV SS DNA： HBV single-stranded DNA; (b) quantitative analysis of the HBV DNA replication intermediates. The levels of HBV DNA intermediates were reported to the levels of the control mice,which were set at 1.0. The mean DNA levels plus standard deviation (indicated by error bars) from 8 mice of two repeated experiments were shown
2.2 AM和DDB對小鼠體內HBV抗原表達的影響
與對照組相比，AM組和AM+DDB組小鼠血清中HBsAg的水平下降，而這兩組小鼠之間HBsAg水平沒有明顯差別。僅給予DDB處理的小鼠，血清HBsAg的水平與對照組相比沒有明顯變化。同樣，各組小鼠血清HBeAg結果的比較與HBsAg相似：AM組和AM+DDB組小鼠HBeAg水平低于對照組，而這兩組之間比較抗原水平無明顯差異；DDB組小鼠HBeAg的水平與對照組比較無明顯差異(見圖 3)。
圖3
AM和DDB對HBV轉染小鼠血清HBsAg(左)和HBeAg(右)表達的影響
圖中顯示了兩次重復實驗8只小鼠的平均水平
Figure3. Effect of AM and DDB on HBsAg (left) and HBeAg (right) in HBV transfection micethe datd represented the mean value of eight mice from two repeated experiments
3 討論
眾所周知，HBV嚴重危害人類健康，我國屬于乙型肝炎高發地區。全球許多科學家致力于乙型肝炎的相關研究，近年來取得了很大的進展，使乙型肝炎由“不治之癥”變為可控性的疾病。近10余年，隨著抗HBV藥物的相繼上市，慢性乙型肝炎患者的預后得到很大的改善。但是隨著抗病毒藥物應用的時間延長，其耐藥性也顯現出來，這使抗HBV的療效受到影響。因此，尋找新的抗病毒藥物仍然是這一領域的努力方向。新藥研究包括了新的化合物的研發及老藥新用的研究。體外研究發現AM和DDB具有抗HBV的作用，這兩種藥物均是臨床常用藥，價格低廉，安全性較好，如能證實確有抗HBV的作用，對于慢性乙型肝炎的治療具有重要的意義。
AM是臨床治療帕金森病的藥物之一，也用于預防或治療A型流感病毒所引起的感染。AM在治療、預防流感中已廣泛使用十余年，并取得顯著的療效。多項多中心、隨機、安慰劑對照的前瞻性臨床研究發現，與標準二聯方案(干擾素或長效干擾素+利巴韋林)相比，加入AM的三聯方案能夠提高慢性丙型肝炎的持續病毒應答率，尤其對于單用干擾素或標準二聯方案無應答的患者，優勢尤為突出[1-4]。循證醫學證據也支持這一結論[15-16]。另有研究發現，在標準方案的基礎上加入AM(每日200 mg，療程12個月)不僅不會影響慢性丙型肝炎患者的日常生活質量，還可減輕患者的焦慮等情緒反應[3, 17]。以上的研究提示，AM對丙肝病毒具有抑制作用，且長期使用具有很好的安全性。而最近利用HBV體外復制細胞模型的研究發現，AM對HBV的復制有抑制作用。本研究結果發現，對HBV復制型小鼠單獨給予AM或與DDB聯合處理3 d后，小鼠肝臟中HBV DNA復制中間體和血清中HBsAg和HBeAg的水平均降低，提示該藥對小鼠體內HBV病毒的復制和抗原的表達有抑制作用。其作用機制尚不清楚。體外研究發現，AM可以激活HepG2 2.2.15 細胞膜上的干擾素IFN-α受體(IFNAR)以及干擾素信號通路的多種細胞因子表達，如酪氨酸激酶JAK1、信號轉導和轉錄激活因子STAT2、寡聚腺苷酸合成酶OAS等，且使HBV復制周期中的前基因組RNA(pgRNA)的水平降低，由此推測AM抗HBV的機制可能通過干擾素信號通路實現的。由于干擾素信號傳導通路中需要多種激酶的參與，在體內的作用效果優于體外，因此可從這一方向設計動物實驗進一步研究AM抗HBV的機制。雖然本研究未能涉及AM抗HBV機制，但在體外研究結果的基礎上，進一步在動物體內證實了AM對HBV的抑制作用，為以后的相關深入研究和臨床應用奠定基礎。
DDB是我國中藥五味子的提取物，能有效降低ALT的水平，自1974年首次問世以來一直作為一種傳統的保肝藥物用于急、慢性肝炎的治療。其突出的優點是降酶速度快、毒副作用少、價格便宜。大量實驗證實，DDB可以減輕毒性物質引起肝細胞膜的損傷，保護肝細胞內質網結構和功能的完整性。最近的體外實驗證實，DDB對HBV的復制具有抑制作用[7-8],與AM聯用抗病毒作用增強。而且，崔速南等在臨床研究也初步觀察到，大劑量DDB具有一定的抗HBV作用。但我們的研究結果提示，對HBV復制型小鼠，單獨給予DDB處理，小鼠肝臟中HBV DNA復制中間體和血清中HBV相關抗原水平與對照組相比均無明顯差別。而且，結果還提示AM對HBV復制型小鼠體內的病毒復制和表達有抑制作用，但與DDB聯用后，抗病毒作用無明顯變化。因此，以上結果提示DDB單獨使用未能抑制小鼠體內HBV的復制和表達，也未能增強AM的抗HBV作用，與體外的實驗結果不同[7-8]。其原因可能如下：該小鼠模型為一短期的HBV復制模型，HBV復制的高峰時間為轉染后第3 d，而我們的藥物處理持續時間為3 d，可能在如此短的時間內，藥物抗HBV的作用尚未顯示出來。因此，可使用長期HBV復制模型，延長給藥時間，進一步證實該藥在體內對HBV是否具有抑制作用。
總之，本研究在體外研究結果的基礎上，應用HBV復制小鼠模型進一步在體內證實AM對HBV的復制和表達具有抑制作用，為進一步深入研究和臨床應用提供基礎。連續3 d給予DDB處理對HBV的復制表達無影響，這需要更進一步的研究，如延長給藥時間來證實該藥在小鼠體內對HBV是否具有抑制作用。
引言
乙型肝炎是一種嚴重危害人類健康的傳染病，不僅發病人數眾多，而且慢性乙型肝炎易發展成肝硬化和肝癌。慢性乙型肝炎治療的關鍵是抗病毒，病毒的清除或抑制可以阻止或減輕肝臟的損害和疾病的進展。但因為目前尚無徹底清除乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的措施，所以目前慢性乙型肝炎的治療目標是持續抑制HBV的復制，延緩肝病的進展，最終阻止肝硬化和肝癌的發生，藥物主要是干擾素和核苷類似物。然而，現有抗HBV藥物的療效尚不令人滿意，且核苷類似物的長期應用可能導致病毒耐藥株的產生。因此，慢性乙型肝炎抗病毒這一領域的發展方向是尋找新的抗病毒措施，以替代目前抗HBV藥物或與之聯用，延緩或減少耐藥的產生，增強抗HBV的療效。
金剛烷胺(amantadine,AM)是臨床治療帕金森病的藥物之一，也用于預防或治療A型流感病毒的感染。其抗病毒機制尚未完全清楚，主要抑制病毒膜基質蛋白M2的合成，該蛋白為病毒進入宿主細胞所必需，因此可以抑制病毒穿入細胞。同時還可能有以下幾種機制：封閉細胞膜上的病毒通道，抑制病毒脫殼，改變細胞表面電荷，抑制病毒增殖等。以往的研究及循證醫學證據表明該藥對丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)有一定的抑制作用[1-4]。
聯苯雙脂(biphenyl dimethyl dicarboxylate,DDB)是我國中藥五味子的提取物，能有效降低谷丙轉氨酶(alanine transaminase,ALT)的水平，長期作為一種傳統的保肝藥物用于急、慢性肝炎的治療，動物實驗研究發現DDB對小鼠受抑制的體液及細胞免疫功能具有一定的增強作用[5-6]。而Joo等[7-8]利用HBV體外復制細胞模型的研究發現：AM和DDB對HBV的復制具有抑制作用，二者聯用抗病毒作用大大增強。其機制尚不清楚，可能通過激活干擾素樣信號傳導通路而實現的。崔速南等[9-10]在臨床研究中也初步觀察到，大劑量DDB有一定抗HBV的作用。
本研究擬進行動物實驗，進一步驗證以上兩種藥物是否具有抗HBV的作用。目前抗HBV藥物的篩選主要用HBV轉基因小鼠，但轉基因小鼠的獲得非常耗時、費力。而本實驗小組建立的HBV復制型小鼠模型，具有簡便、經濟的特點，最重要的是使用該小鼠模型能夠檢測到目前抗病毒藥物對HBV復制的抑制作用，可用于抗HBV藥物的篩選[11-14]。所以本研究擬用HBV復制小鼠模型對以上兩種藥物抗HBV的作用進行體內研究。
1 材料與方法
1.1 主要試驗材料
復制型HBV 重組質粒pHBV4.1由美國Scripps研究所Alan Mclachlan 教授惠贈，由本研究室保存；質粒DNA轉化感受肽大腸桿菌JM109，擴增、提取及純化采用QIAGEN TIP-500，操作按試劑盒說明書的程序進行。AM由江蘇鵬鷂藥業有限公司生產，批號：H32023575。DDB由浙江海翔藥業股份有限公司提供。AM每日用藥量為720 μg/kg，DDB的每日用量為450 μg/kg，根據體重計算出每只小鼠的用量，分兩次給藥。
1.2 實驗方法
1.2.1 動物實驗
雄性BALB/c小鼠,體重18～20 g,購自四川大學華西實驗動物中心。將10 μg pHBV4.1質粒DNA溶于2 mL的生理鹽水中，在5~8 s內通過尾靜脈注入小鼠體內。注射24 h后，根據小鼠體重、年齡和血清HBeAg水平進行配對，將模型小鼠分成4組：AM組、DDB組、AM+DDB組和對照(NS)組，每組4只。實驗組給予相應的藥物灌胃，NS組給予生理鹽水。用12號小鼠灌胃針灌胃，每日兩次，共3 d。最后一次給藥后6 h處死小鼠，留取小鼠的血清和肝臟。血清儲存于-20 ℃。將小鼠肝組織立即置入液氮迅速冷凍，然后置于-70 ℃保存備用。動物實驗過程如圖 1所示。
圖1
動物實驗流程
Figure1.
The procedure of animal experiment
1.2.2 小鼠肝組織HBV DNA復制中間體的提取及檢測
小鼠肝組織HBV DNA復制中間體的提取和檢測按照我們已報道的方法進行[11]，具體如下：將凍存的肝組織在液氮中碾成粉末，用于提取HBV DNA復制中間體。將0.12 g肝粉溶入0.6 mL的細胞膜裂解液[100 mmol/L Tris.HCL(pH 8.0)、0.2%(vol/vol)NP40]中，14 000 r/min離心1 min。取上清加入MgOAC和DNAaseⅠ使其終濃度分別為6.75 mmol/L 和200 μg/mL，37 ℃孵育1 h。再依次加入 EDTA、SDS、NaCl、蛋白酶使其終濃度分別為10 mmol/L、0.8%(wt/vol)、100 mmol/L和1.6 mg/mL，37 ℃孵育1 h后。然后用酚/氯仿抽提2次，0.7倍體積的異丙醇沉淀DNA,DNA沉淀溶于30 μL[10 mmol/L Tris (pH 8.0),1 mmol/L EDTA],-20 ℃保存備用。取30 μL HBV DNA復制中間體以10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，用Southern雜交檢測HBV DNA復制中間體，雜交采用地高辛標記的HBV全長基因組探針，并用地高辛發光檢測試劑盒檢測結果(Roche Applied Science)。
1.2.3 ELISA檢測小鼠血清HBV相關抗原
分別取50 μL血清采用ELISA檢測HBV表面抗原(HBV surface antigen,HBsAg)和HBV e抗原(HBV e antigen,HBeAg)，抗原的檢測分別采用HBsAg和 HBeAg檢測試劑盒(中國上海科華)。操作按試劑盒說明書進行。
2 結果
2.1 AM和DDB對小鼠體內HBV復制的影響
Southern雜交結果顯示：與對照組相比，AM組和AM+DDB組小鼠肝臟中HBV 復制中間體DNA的水平均降低,經Quantity one 軟件分析，兩組HBV DNA 復制中間體均較對照組降低約30%，但兩組間HBV DNA復制中間體的水平沒有明顯差別。DDB組小鼠肝臟中HBV DNA復制中間體水平與對照組無明顯差異(見圖 2)。
圖2
AM和DDB對HBV轉染小鼠體內病毒復制的影響
(a)Southern雜交檢測HBV DNA復制中間體，HBV RC DNA為HBV 疏松環狀DNA，HBV SS DNA為HBV 單鏈DNA；(b)HBV DNA復制中間體的定量分析，對照組小鼠HBV DNA復制中間體的量設為1.0，其它小鼠的水平與之相比計算出相對值,平均值及標準差來源于2次重復實驗，共8只小鼠
Figure2. Effect of AM and DDB on viral replication in HBV transfected mice(a) DNA (Southern) filter hybridization analysis of HBV replication intermediate： HBV RC DNA: HBV relaxed DNA; HBV SS DNA： HBV single-stranded DNA; (b) quantitative analysis of the HBV DNA replication intermediates. The levels of HBV DNA intermediates were reported to the levels of the control mice,which were set at 1.0. The mean DNA levels plus standard deviation (indicated by error bars) from 8 mice of two repeated experiments were shown
2.2 AM和DDB對小鼠體內HBV抗原表達的影響
與對照組相比，AM組和AM+DDB組小鼠血清中HBsAg的水平下降，而這兩組小鼠之間HBsAg水平沒有明顯差別。僅給予DDB處理的小鼠，血清HBsAg的水平與對照組相比沒有明顯變化。同樣，各組小鼠血清HBeAg結果的比較與HBsAg相似：AM組和AM+DDB組小鼠HBeAg水平低于對照組，而這兩組之間比較抗原水平無明顯差異；DDB組小鼠HBeAg的水平與對照組比較無明顯差異(見圖 3)。
圖3
AM和DDB對HBV轉染小鼠血清HBsAg(左)和HBeAg(右)表達的影響
圖中顯示了兩次重復實驗8只小鼠的平均水平
Figure3. Effect of AM and DDB on HBsAg (left) and HBeAg (right) in HBV transfection micethe datd represented the mean value of eight mice from two repeated experiments
3 討論
眾所周知，HBV嚴重危害人類健康，我國屬于乙型肝炎高發地區。全球許多科學家致力于乙型肝炎的相關研究，近年來取得了很大的進展，使乙型肝炎由“不治之癥”變為可控性的疾病。近10余年，隨著抗HBV藥物的相繼上市，慢性乙型肝炎患者的預后得到很大的改善。但是隨著抗病毒藥物應用的時間延長，其耐藥性也顯現出來，這使抗HBV的療效受到影響。因此，尋找新的抗病毒藥物仍然是這一領域的努力方向。新藥研究包括了新的化合物的研發及老藥新用的研究。體外研究發現AM和DDB具有抗HBV的作用，這兩種藥物均是臨床常用藥，價格低廉，安全性較好，如能證實確有抗HBV的作用，對于慢性乙型肝炎的治療具有重要的意義。
AM是臨床治療帕金森病的藥物之一，也用于預防或治療A型流感病毒所引起的感染。AM在治療、預防流感中已廣泛使用十余年，并取得顯著的療效。多項多中心、隨機、安慰劑對照的前瞻性臨床研究發現，與標準二聯方案(干擾素或長效干擾素+利巴韋林)相比，加入AM的三聯方案能夠提高慢性丙型肝炎的持續病毒應答率，尤其對于單用干擾素或標準二聯方案無應答的患者，優勢尤為突出[1-4]。循證醫學證據也支持這一結論[15-16]。另有研究發現，在標準方案的基礎上加入AM(每日200 mg，療程12個月)不僅不會影響慢性丙型肝炎患者的日常生活質量，還可減輕患者的焦慮等情緒反應[3, 17]。以上的研究提示，AM對丙肝病毒具有抑制作用，且長期使用具有很好的安全性。而最近利用HBV體外復制細胞模型的研究發現，AM對HBV的復制有抑制作用。本研究結果發現，對HBV復制型小鼠單獨給予AM或與DDB聯合處理3 d后，小鼠肝臟中HBV DNA復制中間體和血清中HBsAg和HBeAg的水平均降低，提示該藥對小鼠體內HBV病毒的復制和抗原的表達有抑制作用。其作用機制尚不清楚。體外研究發現，AM可以激活HepG2 2.2.15 細胞膜上的干擾素IFN-α受體(IFNAR)以及干擾素信號通路的多種細胞因子表達，如酪氨酸激酶JAK1、信號轉導和轉錄激活因子STAT2、寡聚腺苷酸合成酶OAS等，且使HBV復制周期中的前基因組RNA(pgRNA)的水平降低，由此推測AM抗HBV的機制可能通過干擾素信號通路實現的。由于干擾素信號傳導通路中需要多種激酶的參與，在體內的作用效果優于體外，因此可從這一方向設計動物實驗進一步研究AM抗HBV的機制。雖然本研究未能涉及AM抗HBV機制，但在體外研究結果的基礎上，進一步在動物體內證實了AM對HBV的抑制作用，為以后的相關深入研究和臨床應用奠定基礎。
DDB是我國中藥五味子的提取物，能有效降低ALT的水平，自1974年首次問世以來一直作為一種傳統的保肝藥物用于急、慢性肝炎的治療。其突出的優點是降酶速度快、毒副作用少、價格便宜。大量實驗證實，DDB可以減輕毒性物質引起肝細胞膜的損傷，保護肝細胞內質網結構和功能的完整性。最近的體外實驗證實，DDB對HBV的復制具有抑制作用[7-8],與AM聯用抗病毒作用增強。而且，崔速南等在臨床研究也初步觀察到，大劑量DDB具有一定的抗HBV作用。但我們的研究結果提示，對HBV復制型小鼠，單獨給予DDB處理，小鼠肝臟中HBV DNA復制中間體和血清中HBV相關抗原水平與對照組相比均無明顯差別。而且，結果還提示AM對HBV復制型小鼠體內的病毒復制和表達有抑制作用，但與DDB聯用后，抗病毒作用無明顯變化。因此，以上結果提示DDB單獨使用未能抑制小鼠體內HBV的復制和表達，也未能增強AM的抗HBV作用，與體外的實驗結果不同[7-8]。其原因可能如下：該小鼠模型為一短期的HBV復制模型，HBV復制的高峰時間為轉染后第3 d，而我們的藥物處理持續時間為3 d，可能在如此短的時間內，藥物抗HBV的作用尚未顯示出來。因此，可使用長期HBV復制模型，延長給藥時間，進一步證實該藥在體內對HBV是否具有抑制作用。
總之，本研究在體外研究結果的基礎上，應用HBV復制小鼠模型進一步在體內證實AM對HBV的復制和表達具有抑制作用，為進一步深入研究和臨床應用提供基礎。連續3 d給予DDB處理對HBV的復制表達無影響，這需要更進一步的研究，如延長給藥時間來證實該藥在小鼠體內對HBV是否具有抑制作用。
