鉛黃腸球菌(Enterococcus casseliflavus)在誘導劑甘油存在的條件下,經發酵培養可合成和分泌α-磷酸甘油氧化酶。該菌的無細胞抽提液可通過聚乙二醇(PEG)/(NH4)2SO4雙水相萃取法有效進行α-磷酸甘油氧化酶的分離和純化。研究結果表明,PEG分子大小、PEG濃度、pH、(NH4)2SO4濃度和無機鹽及粗酶液的加入量是影響該萃取系統的主要因素,最終確定的最適雙水相系統為16.5% (m/m)PEG2000、13.2%(m/m) (NH4)2SO4、pH 7.5和30%(m/m)的粗酶加入量。無機鹽NaCl的加入對萃取α-磷酸甘油氧化酶會產生負面影響,導致低的純化倍數和活性回收率。此雙水相萃取體系用于放大提取α-磷酸甘油氧化酶,其酶活性回收率可達89%、分配率為1.2、純化倍數為7.0。
引用本文： 孟堯, 金家貴, 劉雙鳳, 楊敏, 張慶蓮, 萬莉, 唐昆. 聚乙二醇/(NH4)2SO4雙水相體系分離純化α-磷酸甘油氧化酶. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(1): 136-141. doi: 10.7507/1001-5515.20140027 復制
引言
血清中甘油三酯的濃度是臨床高血脂和心臟病檢測的重要指標[1]。該檢測方法的反應機制可以概括為四步反應：
(1) ；(2) ；(3) ；(4)
作為現代臨床分析和檢測廣為使用的方法，α-磷酸甘油氧化酶(α-glycerophosphate oxidase,α-GPO,E.C.1.1.3 .21 )作為甘油三酯測定的關鍵酶之一，具有高特異性和高靈敏度的特點[2-4]。GPO不僅廣泛存在于飛行肌組織中[5]，而且也可以從微生物的發酵產物中提取獲得。國外對α-GPO的研究報道較多，發現能產生GPO的微生物包括Escherichia coli.、 Streptococcus faecalis、 Lactobacillus和鉛黃腸球菌(Enterococcus casseliflavus)等[6-10]。而國內有關α-GPO尤其是雙水相分離和純化的報道相對較少，除了馮詠梅和盧戌等[11-12]報道外尚未見其他報道。獲得該酶的另一條途徑是通過基因工程表達的方法，然而，由于GPO表達量低且成本昂貴等原因至今還未見相關報道。由于此酶在醫學診斷中的突出作用，我們有必要尋找一種新的方法來分離和純化該種酶以滿足臨床需要[13-14]。
雙水相萃取系統是一種應用于蛋白質、酶、菌體、細胞以及氨基酸、抗生素等生物小分子的新型分離純化技術[15-17]。該體系可由兩種化學結構不同的親水性聚合物組成，也可由一種親水性聚合物和無機鹽組成[18]。相對于以前的溶劑萃取來說，雙水相萃取體系最大的優勢在于萃取環境相對溫和，可在整個分離的過程中保持生物物質的活性及構象，而且雙水相萃取還有成本低、回收率高、可連續化操作、易于放大的優點。本文介紹了聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)/(NH4)2SO4雙水相體系成功應用于鉛黃腸球菌分離純化GPO，考察了pH、PEG濃度、PEG分子量等因素對該萃取系統效率的影響。
1 主要材料與設備
1.1 主要試劑
鉛黃腸球菌(ATCC number:12755)；蛋白胨 (tryptone)、酵母粉(yeast extract) 和牛肉膏 (beef extract)購自英國OXOID公司；牛血清白蛋白 (bovine serum albumin,BSA)、4-氨基安替比林 (4-aminoantipyrine,4-AA)、PEG400、PEG600和PEG2000購自Sigma公司。其他試劑均為國產分析純。
1.2 培養基
① 斜面培養基(%)：蛋白胨 1%、牛肉膏 0.3%、NaCl 0.5%、瓊脂 2%，pH 7.0~7.2。
② 種子培養基(%)：蛋白胨 1.2%、牛肉膏 0.5%、NaCl 0.5%、pH 7.0~7.2。
③ 發酵培養基(%)：酵母粉 1.5%、蛋白胨 1%、葡萄糖 0.1%、K2HPO4·3H2O 0.5%，甘油 0.2%，鹽溶液 0.25% (含MgSO4·7H2O 4%、MnCl2 1%、NaCl 20%)，pH 6.8。
1.3 主要儀器
高速冷凍離心機(Eppendorf 5804R)；紫外可見分光光度計 (UnicoTM UC-2102 PC) (上海第三分析儀器廠)；VCX-750超聲波細胞粉碎機 (Sonics公司)；電泳系統(Bio-Rad公司Power PAC300)；凝膠成像分析儀(Bio-Rad公司76S/02324)；GQ75B高速管式離心機(上海浦東天本離心機機械有限公司)；Mini-protean Ⅲ電泳槽(Bio-Rad)；Mini Pellicon (Millipore公司)。
2 實驗方法
2.1 菌體培養和粗酶的提取[10 -11 ]
將液體石蠟或甘油保存的鉛黃腸球菌菌落接種于斜面培養基上，28 ℃條件下培養24 h，用同樣方法活化3~4次。挑取生長飽滿的菌落，接到種子培養基中，28 ℃條件下200 r/min培養24 h。將種子液按5%比例接入裝有400 mL種子培養液的1 000 mL三角瓶中，30 ℃下200 r/min旋轉搖床震蕩培養18 h。將發酵液4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min后收集菌體。用20 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl緩沖液洗滌菌體3次，按1∶4 (w/v)比例懸浮于50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液中，冰浴條件下進行超聲波破碎 (50 kHz,600 W)，間隙持續40 min。破碎液于4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min，收集破碎液上清并測定粗酶液活性和蛋白含量。
2.2 雙水相萃取體系的建立
在室溫下按重量配制雙水相體系，總質量為1 g，準確稱取一定量的PEG和(NH4)2SO4溶液于混合器上混合均勻，然后加入10%的粗酶液，不足部分加蒸餾水以補充。靜置1 h或過夜，2 000 r/min離心10 min。待體系分為上下兩相后讀取上、下相體積及總體積，并測定酶活力和蛋白含量。
2.3 蛋白含量測定[19 ]
蛋白含量測定采用Bradford法，以BSA作為標準蛋白。
2.4 酶活力測定及酶活性單位的定義[10 ]
① 標準管：5 mL工作液，含2.5 mL、 0.2 mmol/L α-甘油磷酸溶液，0.7 mL (38 U/mL)過氧化物酶溶液，0.5 mL 0.1% 4-AA溶液，1 mL 0.1%苯酚溶液和0.1 mL酶稀釋液，于37 ℃保溫10 min后加入1 mL 0.25% SDS，于500 nm測光吸收值；② 樣品管：待測樣品測定操作同標準管；③ 空白管：先加入1 mL 0.25% SDS和5 mL工作液混勻后，保溫5 min，再加入100 μL適當稀釋的待測樣品37 ℃水浴中保溫15 min。以空白管調零點，讀取500 nm光吸收值。酶活性單位定義：在該實驗條件下每分鐘催化生成1.0 μmol/L H2O2所需酶量定義為一個酶活力單位。
| $\begin{align} & 酶活力\left( U/mL \right)=\frac{\Delta OD}{O{{D}_{test}}-O{{D}_{blank}}} \\ & \times Vt\times df\times \frac{1}{2}\times t\times 1.0\times Vs \\ \end{align}$ |
式中Vt為總體積，df為稀釋倍數，1/2表示每摩爾的H2O2可生成1/2摩爾的醌胺；t為反應時間，1.0表示比色皿的直徑，Vs為樣品體積。
2.5 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
4%濃縮膠，12%分離膠，電極緩沖液為pH 8.5 Tris-Gly-SDS緩沖液。用含2-巰基乙醇或不含2-巰基乙醇的處理液加熱樣品。樣品在濃縮膠中電壓為140 V，在分離膠中為180 V進行恒壓電泳。 考馬斯亮藍R-250染色蛋白條帶，檢測樣品分子量時以LMW Calibration Kit作為標準品。
2.6 分配系數、體積比、回收率和純化倍數的定義
雙水相萃取技術分離純化α-GPO是建立在被分離組分在兩相之間的選擇性分配之上，其分配行為由分配系數K來表示：
| ${{K}_{e}}=\frac{{{A}_{t}}}{{{A}_{b}}},{{K}_{p}}=\frac{{{P}_{t}}}{{{P}_{b}}}$ |
式中At,Ab和Pt,Pb分別代表上相中α-GPO活性(U/mL)和下相蛋白的濃度(mg/mL)。
相體積比(R)定義為上相體積與下相體積的比值。
酶活性回收率定義為上相α-GPO活性與下相最初粗酶活性的比值。
| $\operatorname{Recovery}%=\frac{{{A}_{t}}\times {{V}_{t}}}{{{A}_{I}}\times {{V}_{I}}}\times 100%,$ |
式中AI和VI表示粗酶液活性和體積，At和Vt表示GPO酶活性和體積。
純化倍數(purification fold)定義為上相中α-GPO比活與粗酶液比活的比值，計算公式如下：
| $Purification\quad \text{fold=}\frac{\text{Specific}\quad \text{activit}{{\text{y}}_{\text{top}\quad \text{phase}}}}{\text{Specific}\quad \text{activit}{{\text{y}}_{\text{crude}\quad \text{extract}}}}$ |
3 結果與討論
3.1 不同分子量PEG和(NH4)2SO4形成的雙水相體系相圖繪制
PEG/(NH4)2SO4雙水相體系成相的基本情況是確定實驗操作的基本條件，我們選擇在曲線上方的質量百分點作為萃取分離的參考條件。為防止鹽濃度過高導致鹽析現象的發生，故而濃度選擇在0~40%以內做相圖的分析。圖 1結果表明，在(NH4)2SO4濃度為12%時，要形成雙水相體系PEG 400濃度需要超過28%，PEG 600濃度需要超過20%，PEG 2000濃度需超過10%。當(NH4)2SO4濃度為15%時，要形成雙水相體系，PEG 400、600、2000濃度分別要超過25%、18%和5%。由此可知，當(NH4)2SO4濃度一定時，隨著PEG分子量的增大，形成雙水相體系所需成相的PEG濃度越小。
圖1
不同分子量PEG與(NH4)2SO4形成的雙水相相圖
Figure1.
Phase diagram of different molecular weights of PEG and (NH4)2SO4 in aqueous two-phase system
3.2 PEG分子大小對雙水相萃取α-GPO的影響
固定(NH4)2SO4濃度為15% (m/m)，加入粗酶搖勻，離心后發現兩相界面均析出大量蛋白，分析可能是由于鹽析造成。表 1結果表明PEG 400與(NH4)2SO4形成的雙水相體系使得部分酶進入上相而下相檢測不到酶活性，且上相中的酶活性較低、純化倍數也不理想，達不到分離純化的目的。
表1
PEG400對萃取α-GPO的影響
Table1.
Effect of PEG400 on extraction of α-GPO from Enterococcus casseliflavus
固定(NH4)2SO4濃度為15% (m/m)，除PEG濃度為17.5%形成的雙水相，其余濃度的雙水相體系兩相界面均會析出沉淀。由表 2可知，該酶未進入下相，少量酶存在上相中且酶活性很低，萃取后的比活和原來的比活相當，達不到分離純化的目的。
表2
PEG600對萃取α-GPO的影響
Table2.
Effect of PEG600 on extraction of α-GPO from Enterococcus casseliflavus
固定(NH4)2SO4濃度為10% (m/m)，組成一系列的雙水相體系并比較各體系萃取情況。實驗結果表明，在PEG 2000濃度高于16.5%時，酶的分配系數較高，回收率較好。但當PEG濃度增加至19.5%時，蛋白分配增大導致萃取后酶的比活和純化倍數降低。
通過分析三種分子量的PEG與(NH4)2SO4形成的雙水相，經比較后得知，隨著PEG分子量的增大，純化倍數有顯著提高，酶的回收率可達89%，故可選擇PEG 2000作為萃取α-GPO的最佳對象。
3.3 PEG濃度對α-GPO萃取的影響
固定(NH4)2SO4濃度為10% (m/m)，PEG 2000濃度分別為13.5%、15.0%、16.5%、18.0%和19.5% (m/m)，隨著PEG 2000濃度的增大，酶的分配系數也相應增大，在16.5%時達到最大，純化倍數達7.0，回收率達最高值(89%)。但當PEG濃度超過一定值時，蛋白質的分配系數增大，從而會降低純化倍數及活性回收率。因此，16.5%是萃取α-GPO的最佳PEG2000濃度。
3.4 (NH4)2SO4濃度對α-GPO萃取的影響
雙水相體系是一個PEG與(NH4)2SO4爭奪水分子的過程，當PEG的量很少時，隨著鹽濃度的增加，PEG分子會漸漸釋放出來。而(NH4)2SO4的相對增加則會使兩相間產生電位差，繼而影響分配系數和萃取效率。
固定PEG濃度16.5%，隨著(NH4)2SO4濃度的增加鹽析即會產生。當濃度分別為10.0%和13.2%時，酶的分配系數均較高，同時上相中的酶活性也較高。在考慮最終純化后的比活、純化倍數及活性回收率后，我們選擇 (NH4)2SO4濃度為13.2%作為最佳萃取條件。
3.5 pH值對α-GPO萃取的影響
將酶液在37 ℃條件下分別用不同pH的緩沖液進行稀釋，保溫1 h后在pH 8.0條件下測酶活性，如圖 2所示。結果表明該酶在pH 6.0~7.5時保留90%以上的酶活力；在pH＞9時酶活力僅殘存30%左右。
圖2
α-GPO的酸堿穩定性
Figure2.
pH stability of α-GPO
由圖 3、4可知，隨著pH值的升高，蛋白分配系數逐漸增大，在pH 7.5時，酶的分配系數達到最大，同時上相酶活性也最高。在pH 8.0時純化倍數達到最大，然而在兼顧活性回收率的情況下我們選擇pH 7.5作為雙水相萃取的最佳pH值。
圖3
pH值對酶和蛋白分配系數的影響
Figure3.
Effect of pH on distribution coefficient of α-GPO and protein
圖4
pH值對酶回收率和純化倍數的影響
Figure4.
Effect of pH on activity recovery and purification fold of α-GPO
3.6 鹽濃度對萃取α-GPO的影響
本實驗通過加入不同量的氯化鈉考察無機鹽對PEG/(NH4)2SO4雙水相體系的影響。由表 3結果可知，在萃取α-GPO時，無機鹽的加入對酶的分配系數和純化倍數均有負面影響，酶的分配系數、比活、純化倍數和回收率均有下降。因此，在萃取α-GPO時，可不加入無機鹽。
表3
加入無機鹽的萃取效果
Table3.
Effect of inorganic salt on α-GPO extraction
3.7 粗酶加入量對α-GPO萃取的影響
在雙水相體系中加入5%、10%、15%、20%、25%和30%質量百分比的粗酶液進行萃取。隨著加入酶量的增加，分相界面逐漸析出沉淀。由實驗結果可知，在加入酶量為15%時，酶的分配系數達到最大，純化倍數和回收率都較高；酶量為10%時，純化倍數最高但回收率偏低；酶量為30%時，回收率最高，純化倍數也較高。在綜合考慮成本、萃取效果和回收率的情況下我們最終選用30%的粗酶加入量。
3.8 酶萃取放大實驗
根據上述實驗條件，在PEG 2000濃度為16.5%、 (NH4)2SO4濃度為13.2%、pH 7.5條件下將萃取實驗進行放大。整個雙水相萃取體系的總質量分別為10、30和100 g，初酶液的加入量為30%。根據表 4得知，酶的分配系數、比活和活性回收率基本保持穩定。圖 5給出了α-GPO經雙水相萃取前后的SDS-PAGE分析情況，結果表明萃取后，樣品中雜蛋白明顯減少，與表 4中反映的情況基本一致。因此，該實驗方案可應用于該酶的大量分離純化。
圖5
α-GPO萃取前后的SDS-PAGE電泳圖
A、B：經雙水相萃取后樣品的SDS-PAGE電泳圖譜;C、D：經雙水相萃取前樣品的SDS-PAGE電泳圖譜
Figure5. SDS-PAGE of samples from extraction and non-extractionA,B: respectively present samples of extraction by aqueous two-phase system; C,D: respectively present crude enzyme before extraction
表4
萃取擴大實驗
Table4.
Extraction amplification experiment
4 結論
以鉛黃腸球菌發酵液為原料，用雙水相萃取技術提取α-GPO，考察了不同分子量PEG與硫酸銨濃度、無機鹽濃度、pH值和粗酶加入量對酶萃取的影響。分別分析了以上因素對雙水相成相行為和酶分配行為的影響，最終確立了該雙水相體系萃取α-GPO的最佳工藝條件。
在諸多因素中，影響最為顯著的是PEG分子量和雙水相組分的比例，其次是pH值。無機鹽NaCl的加入會對酶萃取產生負面影響，粗酶的加入量對萃取分離效果也有一定程度的影響。PEG分子量越大，體系越容易在組分低濃度的狀態下成相，酶的分配系數、純化倍數和回收率也隨之增加，據此確定PEG 2000作為萃取α-GPO的最佳PEG分子量。在(NH4)2SO4濃度一定的條件下，當PEG 2000濃度逐漸增大，酶的分配系數和回收率也會逐漸增加，但當PEG濃度超過16.5%時酶的分配系數和純化倍數均趨于減小。在選擇最佳(NH4)2SO4濃度時，不僅要選擇較好的分配系數，同時還要考慮到酶的萃取工藝成本和純化倍數及其活性回收率。此外，雙水相體系的pH值對酶的分配系數有較大的影響，在α-GPO的酸堿穩定pH范圍內，本文研究了pH值對酶萃取和回收的影響。蛋白質或酶的分配會受到溫度的變化而變化，這是因為溫度對相的形成起到了關鍵的作用。然而，在本實驗中構建相圖時，我們已經得出結論，即溫度對相圖影響最顯著的是在臨界點附近，此時蛋白質或酶在相體系中的分配會受到最大程度的影響；而當遠離這個臨界點時，溫度對相圖的影響就沒有那么顯著了。我們認為這是由于遠離臨界點的成相聚合物隨著濃度的增加，會對蛋白質或酶的結構起到一個穩定的作用。基于以上原因，本文所采取的雙水相操作均在室溫下進行，在遠離臨界點范圍后成相聚合物PEG就會對具有生物活性的蛋白酶(α-GPO)起到很好的穩定作用，因而達到雙水相萃取的目的。
傳統的分離策略需要經過(NH4)2SO4分級沉淀、脫鹽、DEAE-Sepharose F.F.離子交換層析、Phenyl Sepharose CL-4B疏水交換層析、Chelating Sepharose F.F.親和層析和Sephacryl S-200HR分子篩層析六步才能最終純化出所需的樣品，雖然回收率有所提高，但顯然費時、費力，成本也很難控制。由PEG 2000和(NH4)2SO4構成的雙水相體系經實驗證實，萃取α-GPO的最佳工藝條件是濃度為16.5%的PEG 2000、13.2% 的(NH4)2SO4、pH 7.5和30%的粗酶加入量。在此條件下可將萃取效果放大且結果有較好的重復性。最終經過DEAE-Sepharose F.F.陰離子交換層析柱一步即可分離純化出α-GPO。
引言
血清中甘油三酯的濃度是臨床高血脂和心臟病檢測的重要指標[1]。該檢測方法的反應機制可以概括為四步反應：
(1) ；(2) ；(3) ；(4)
作為現代臨床分析和檢測廣為使用的方法，α-磷酸甘油氧化酶(α-glycerophosphate oxidase,α-GPO,E.C.1.1.3 .21 )作為甘油三酯測定的關鍵酶之一，具有高特異性和高靈敏度的特點[2-4]。GPO不僅廣泛存在于飛行肌組織中[5]，而且也可以從微生物的發酵產物中提取獲得。國外對α-GPO的研究報道較多，發現能產生GPO的微生物包括Escherichia coli.、 Streptococcus faecalis、 Lactobacillus和鉛黃腸球菌(Enterococcus casseliflavus)等[6-10]。而國內有關α-GPO尤其是雙水相分離和純化的報道相對較少，除了馮詠梅和盧戌等[11-12]報道外尚未見其他報道。獲得該酶的另一條途徑是通過基因工程表達的方法，然而，由于GPO表達量低且成本昂貴等原因至今還未見相關報道。由于此酶在醫學診斷中的突出作用，我們有必要尋找一種新的方法來分離和純化該種酶以滿足臨床需要[13-14]。
雙水相萃取系統是一種應用于蛋白質、酶、菌體、細胞以及氨基酸、抗生素等生物小分子的新型分離純化技術[15-17]。該體系可由兩種化學結構不同的親水性聚合物組成，也可由一種親水性聚合物和無機鹽組成[18]。相對于以前的溶劑萃取來說，雙水相萃取體系最大的優勢在于萃取環境相對溫和，可在整個分離的過程中保持生物物質的活性及構象，而且雙水相萃取還有成本低、回收率高、可連續化操作、易于放大的優點。本文介紹了聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)/(NH4)2SO4雙水相體系成功應用于鉛黃腸球菌分離純化GPO，考察了pH、PEG濃度、PEG分子量等因素對該萃取系統效率的影響。
1 主要材料與設備
1.1 主要試劑
鉛黃腸球菌(ATCC number:12755)；蛋白胨 (tryptone)、酵母粉(yeast extract) 和牛肉膏 (beef extract)購自英國OXOID公司；牛血清白蛋白 (bovine serum albumin,BSA)、4-氨基安替比林 (4-aminoantipyrine,4-AA)、PEG400、PEG600和PEG2000購自Sigma公司。其他試劑均為國產分析純。
1.2 培養基
① 斜面培養基(%)：蛋白胨 1%、牛肉膏 0.3%、NaCl 0.5%、瓊脂 2%，pH 7.0~7.2。
② 種子培養基(%)：蛋白胨 1.2%、牛肉膏 0.5%、NaCl 0.5%、pH 7.0~7.2。
③ 發酵培養基(%)：酵母粉 1.5%、蛋白胨 1%、葡萄糖 0.1%、K2HPO4·3H2O 0.5%，甘油 0.2%，鹽溶液 0.25% (含MgSO4·7H2O 4%、MnCl2 1%、NaCl 20%)，pH 6.8。
1.3 主要儀器
高速冷凍離心機(Eppendorf 5804R)；紫外可見分光光度計 (UnicoTM UC-2102 PC) (上海第三分析儀器廠)；VCX-750超聲波細胞粉碎機 (Sonics公司)；電泳系統(Bio-Rad公司Power PAC300)；凝膠成像分析儀(Bio-Rad公司76S/02324)；GQ75B高速管式離心機(上海浦東天本離心機機械有限公司)；Mini-protean Ⅲ電泳槽(Bio-Rad)；Mini Pellicon (Millipore公司)。
2 實驗方法
2.1 菌體培養和粗酶的提取[10 -11 ]
將液體石蠟或甘油保存的鉛黃腸球菌菌落接種于斜面培養基上，28 ℃條件下培養24 h，用同樣方法活化3~4次。挑取生長飽滿的菌落，接到種子培養基中，28 ℃條件下200 r/min培養24 h。將種子液按5%比例接入裝有400 mL種子培養液的1 000 mL三角瓶中，30 ℃下200 r/min旋轉搖床震蕩培養18 h。將發酵液4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min后收集菌體。用20 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl緩沖液洗滌菌體3次，按1∶4 (w/v)比例懸浮于50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液中，冰浴條件下進行超聲波破碎 (50 kHz,600 W)，間隙持續40 min。破碎液于4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min，收集破碎液上清并測定粗酶液活性和蛋白含量。
2.2 雙水相萃取體系的建立
在室溫下按重量配制雙水相體系，總質量為1 g，準確稱取一定量的PEG和(NH4)2SO4溶液于混合器上混合均勻，然后加入10%的粗酶液，不足部分加蒸餾水以補充。靜置1 h或過夜，2 000 r/min離心10 min。待體系分為上下兩相后讀取上、下相體積及總體積，并測定酶活力和蛋白含量。
2.3 蛋白含量測定[19 ]
蛋白含量測定采用Bradford法，以BSA作為標準蛋白。
2.4 酶活力測定及酶活性單位的定義[10 ]
① 標準管：5 mL工作液，含2.5 mL、 0.2 mmol/L α-甘油磷酸溶液，0.7 mL (38 U/mL)過氧化物酶溶液，0.5 mL 0.1% 4-AA溶液，1 mL 0.1%苯酚溶液和0.1 mL酶稀釋液，于37 ℃保溫10 min后加入1 mL 0.25% SDS，于500 nm測光吸收值；② 樣品管：待測樣品測定操作同標準管；③ 空白管：先加入1 mL 0.25% SDS和5 mL工作液混勻后，保溫5 min，再加入100 μL適當稀釋的待測樣品37 ℃水浴中保溫15 min。以空白管調零點，讀取500 nm光吸收值。酶活性單位定義：在該實驗條件下每分鐘催化生成1.0 μmol/L H2O2所需酶量定義為一個酶活力單位。
| $\begin{align} & 酶活力\left( U/mL \right)=\frac{\Delta OD}{O{{D}_{test}}-O{{D}_{blank}}} \\ & \times Vt\times df\times \frac{1}{2}\times t\times 1.0\times Vs \\ \end{align}$ |
式中Vt為總體積，df為稀釋倍數，1/2表示每摩爾的H2O2可生成1/2摩爾的醌胺；t為反應時間，1.0表示比色皿的直徑，Vs為樣品體積。
2.5 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
4%濃縮膠，12%分離膠，電極緩沖液為pH 8.5 Tris-Gly-SDS緩沖液。用含2-巰基乙醇或不含2-巰基乙醇的處理液加熱樣品。樣品在濃縮膠中電壓為140 V，在分離膠中為180 V進行恒壓電泳。 考馬斯亮藍R-250染色蛋白條帶，檢測樣品分子量時以LMW Calibration Kit作為標準品。
2.6 分配系數、體積比、回收率和純化倍數的定義
雙水相萃取技術分離純化α-GPO是建立在被分離組分在兩相之間的選擇性分配之上，其分配行為由分配系數K來表示：
| ${{K}_{e}}=\frac{{{A}_{t}}}{{{A}_{b}}},{{K}_{p}}=\frac{{{P}_{t}}}{{{P}_{b}}}$ |
式中At,Ab和Pt,Pb分別代表上相中α-GPO活性(U/mL)和下相蛋白的濃度(mg/mL)。
相體積比(R)定義為上相體積與下相體積的比值。
酶活性回收率定義為上相α-GPO活性與下相最初粗酶活性的比值。
| $\operatorname{Recovery}%=\frac{{{A}_{t}}\times {{V}_{t}}}{{{A}_{I}}\times {{V}_{I}}}\times 100%,$ |
式中AI和VI表示粗酶液活性和體積，At和Vt表示GPO酶活性和體積。
純化倍數(purification fold)定義為上相中α-GPO比活與粗酶液比活的比值，計算公式如下：
| $Purification\quad \text{fold=}\frac{\text{Specific}\quad \text{activit}{{\text{y}}_{\text{top}\quad \text{phase}}}}{\text{Specific}\quad \text{activit}{{\text{y}}_{\text{crude}\quad \text{extract}}}}$ |
3 結果與討論
3.1 不同分子量PEG和(NH4)2SO4形成的雙水相體系相圖繪制
PEG/(NH4)2SO4雙水相體系成相的基本情況是確定實驗操作的基本條件，我們選擇在曲線上方的質量百分點作為萃取分離的參考條件。為防止鹽濃度過高導致鹽析現象的發生，故而濃度選擇在0~40%以內做相圖的分析。圖 1結果表明，在(NH4)2SO4濃度為12%時，要形成雙水相體系PEG 400濃度需要超過28%，PEG 600濃度需要超過20%，PEG 2000濃度需超過10%。當(NH4)2SO4濃度為15%時，要形成雙水相體系，PEG 400、600、2000濃度分別要超過25%、18%和5%。由此可知，當(NH4)2SO4濃度一定時，隨著PEG分子量的增大，形成雙水相體系所需成相的PEG濃度越小。
圖1
不同分子量PEG與(NH4)2SO4形成的雙水相相圖
Figure1.
Phase diagram of different molecular weights of PEG and (NH4)2SO4 in aqueous two-phase system
3.2 PEG分子大小對雙水相萃取α-GPO的影響
固定(NH4)2SO4濃度為15% (m/m)，加入粗酶搖勻，離心后發現兩相界面均析出大量蛋白，分析可能是由于鹽析造成。表 1結果表明PEG 400與(NH4)2SO4形成的雙水相體系使得部分酶進入上相而下相檢測不到酶活性，且上相中的酶活性較低、純化倍數也不理想，達不到分離純化的目的。
表1
PEG400對萃取α-GPO的影響
Table1.
Effect of PEG400 on extraction of α-GPO from Enterococcus casseliflavus
固定(NH4)2SO4濃度為15% (m/m)，除PEG濃度為17.5%形成的雙水相，其余濃度的雙水相體系兩相界面均會析出沉淀。由表 2可知，該酶未進入下相，少量酶存在上相中且酶活性很低，萃取后的比活和原來的比活相當，達不到分離純化的目的。
表2
PEG600對萃取α-GPO的影響
Table2.
Effect of PEG600 on extraction of α-GPO from Enterococcus casseliflavus
固定(NH4)2SO4濃度為10% (m/m)，組成一系列的雙水相體系并比較各體系萃取情況。實驗結果表明，在PEG 2000濃度高于16.5%時，酶的分配系數較高，回收率較好。但當PEG濃度增加至19.5%時，蛋白分配增大導致萃取后酶的比活和純化倍數降低。
通過分析三種分子量的PEG與(NH4)2SO4形成的雙水相，經比較后得知，隨著PEG分子量的增大，純化倍數有顯著提高，酶的回收率可達89%，故可選擇PEG 2000作為萃取α-GPO的最佳對象。
3.3 PEG濃度對α-GPO萃取的影響
固定(NH4)2SO4濃度為10% (m/m)，PEG 2000濃度分別為13.5%、15.0%、16.5%、18.0%和19.5% (m/m)，隨著PEG 2000濃度的增大，酶的分配系數也相應增大，在16.5%時達到最大，純化倍數達7.0，回收率達最高值(89%)。但當PEG濃度超過一定值時，蛋白質的分配系數增大，從而會降低純化倍數及活性回收率。因此，16.5%是萃取α-GPO的最佳PEG2000濃度。
3.4 (NH4)2SO4濃度對α-GPO萃取的影響
雙水相體系是一個PEG與(NH4)2SO4爭奪水分子的過程，當PEG的量很少時，隨著鹽濃度的增加，PEG分子會漸漸釋放出來。而(NH4)2SO4的相對增加則會使兩相間產生電位差，繼而影響分配系數和萃取效率。
固定PEG濃度16.5%，隨著(NH4)2SO4濃度的增加鹽析即會產生。當濃度分別為10.0%和13.2%時，酶的分配系數均較高，同時上相中的酶活性也較高。在考慮最終純化后的比活、純化倍數及活性回收率后，我們選擇 (NH4)2SO4濃度為13.2%作為最佳萃取條件。
3.5 pH值對α-GPO萃取的影響
將酶液在37 ℃條件下分別用不同pH的緩沖液進行稀釋，保溫1 h后在pH 8.0條件下測酶活性，如圖 2所示。結果表明該酶在pH 6.0~7.5時保留90%以上的酶活力；在pH＞9時酶活力僅殘存30%左右。
圖2
α-GPO的酸堿穩定性
Figure2.
pH stability of α-GPO
由圖 3、4可知，隨著pH值的升高，蛋白分配系數逐漸增大，在pH 7.5時，酶的分配系數達到最大，同時上相酶活性也最高。在pH 8.0時純化倍數達到最大，然而在兼顧活性回收率的情況下我們選擇pH 7.5作為雙水相萃取的最佳pH值。
圖3
pH值對酶和蛋白分配系數的影響
Figure3.
Effect of pH on distribution coefficient of α-GPO and protein
圖4
pH值對酶回收率和純化倍數的影響
Figure4.
Effect of pH on activity recovery and purification fold of α-GPO
3.6 鹽濃度對萃取α-GPO的影響
本實驗通過加入不同量的氯化鈉考察無機鹽對PEG/(NH4)2SO4雙水相體系的影響。由表 3結果可知，在萃取α-GPO時，無機鹽的加入對酶的分配系數和純化倍數均有負面影響，酶的分配系數、比活、純化倍數和回收率均有下降。因此，在萃取α-GPO時，可不加入無機鹽。
表3
加入無機鹽的萃取效果
Table3.
Effect of inorganic salt on α-GPO extraction
3.7 粗酶加入量對α-GPO萃取的影響
在雙水相體系中加入5%、10%、15%、20%、25%和30%質量百分比的粗酶液進行萃取。隨著加入酶量的增加，分相界面逐漸析出沉淀。由實驗結果可知，在加入酶量為15%時，酶的分配系數達到最大，純化倍數和回收率都較高；酶量為10%時，純化倍數最高但回收率偏低；酶量為30%時，回收率最高，純化倍數也較高。在綜合考慮成本、萃取效果和回收率的情況下我們最終選用30%的粗酶加入量。
3.8 酶萃取放大實驗
根據上述實驗條件，在PEG 2000濃度為16.5%、 (NH4)2SO4濃度為13.2%、pH 7.5條件下將萃取實驗進行放大。整個雙水相萃取體系的總質量分別為10、30和100 g，初酶液的加入量為30%。根據表 4得知，酶的分配系數、比活和活性回收率基本保持穩定。圖 5給出了α-GPO經雙水相萃取前后的SDS-PAGE分析情況，結果表明萃取后，樣品中雜蛋白明顯減少，與表 4中反映的情況基本一致。因此，該實驗方案可應用于該酶的大量分離純化。
圖5
α-GPO萃取前后的SDS-PAGE電泳圖
A、B：經雙水相萃取后樣品的SDS-PAGE電泳圖譜;C、D：經雙水相萃取前樣品的SDS-PAGE電泳圖譜
Figure5. SDS-PAGE of samples from extraction and non-extractionA,B: respectively present samples of extraction by aqueous two-phase system; C,D: respectively present crude enzyme before extraction
表4
萃取擴大實驗
Table4.
Extraction amplification experiment
4 結論
以鉛黃腸球菌發酵液為原料，用雙水相萃取技術提取α-GPO，考察了不同分子量PEG與硫酸銨濃度、無機鹽濃度、pH值和粗酶加入量對酶萃取的影響。分別分析了以上因素對雙水相成相行為和酶分配行為的影響，最終確立了該雙水相體系萃取α-GPO的最佳工藝條件。
在諸多因素中，影響最為顯著的是PEG分子量和雙水相組分的比例，其次是pH值。無機鹽NaCl的加入會對酶萃取產生負面影響，粗酶的加入量對萃取分離效果也有一定程度的影響。PEG分子量越大，體系越容易在組分低濃度的狀態下成相，酶的分配系數、純化倍數和回收率也隨之增加，據此確定PEG 2000作為萃取α-GPO的最佳PEG分子量。在(NH4)2SO4濃度一定的條件下，當PEG 2000濃度逐漸增大，酶的分配系數和回收率也會逐漸增加，但當PEG濃度超過16.5%時酶的分配系數和純化倍數均趨于減小。在選擇最佳(NH4)2SO4濃度時，不僅要選擇較好的分配系數，同時還要考慮到酶的萃取工藝成本和純化倍數及其活性回收率。此外，雙水相體系的pH值對酶的分配系數有較大的影響，在α-GPO的酸堿穩定pH范圍內，本文研究了pH值對酶萃取和回收的影響。蛋白質或酶的分配會受到溫度的變化而變化，這是因為溫度對相的形成起到了關鍵的作用。然而，在本實驗中構建相圖時，我們已經得出結論，即溫度對相圖影響最顯著的是在臨界點附近，此時蛋白質或酶在相體系中的分配會受到最大程度的影響；而當遠離這個臨界點時，溫度對相圖的影響就沒有那么顯著了。我們認為這是由于遠離臨界點的成相聚合物隨著濃度的增加，會對蛋白質或酶的結構起到一個穩定的作用。基于以上原因，本文所采取的雙水相操作均在室溫下進行，在遠離臨界點范圍后成相聚合物PEG就會對具有生物活性的蛋白酶(α-GPO)起到很好的穩定作用，因而達到雙水相萃取的目的。
傳統的分離策略需要經過(NH4)2SO4分級沉淀、脫鹽、DEAE-Sepharose F.F.離子交換層析、Phenyl Sepharose CL-4B疏水交換層析、Chelating Sepharose F.F.親和層析和Sephacryl S-200HR分子篩層析六步才能最終純化出所需的樣品，雖然回收率有所提高，但顯然費時、費力，成本也很難控制。由PEG 2000和(NH4)2SO4構成的雙水相體系經實驗證實，萃取α-GPO的最佳工藝條件是濃度為16.5%的PEG 2000、13.2% 的(NH4)2SO4、pH 7.5和30%的粗酶加入量。在此條件下可將萃取效果放大且結果有較好的重復性。最終經過DEAE-Sepharose F.F.陰離子交換層析柱一步即可分離純化出α-GPO。
