本研究首次報道具有牙釉質結合活性的環肽序列(-CMPQVMPMC-)。在反篩試驗中,投入等量牙釉質粉末和相同滴度噬菌體,外殼蛋白pⅢ上表達該展示肽的噬菌體回收量明顯高于不含展示肽的野生型噬菌體M13。固相法體外合成該環狀七肽以模擬展示肽在噬菌體表面的構象,并利用96孔板體外快速凝膠單擴散系統驗證其對鈣/磷沉積的影響。礦化開始后的24 h內,每隔6 h記錄各樣本在405 nm的OD值。各樣本的相對濁度表示為所占24 h末空白組OD值增量(100%)的百分比。結果顯示,牙釉質結合肽(EBP)能明顯延遲凝膠中的鈣磷成核,且延遲效果與添加的濃度相關。在礦化24 h末,含結合肽的各組凝膠內濁度明顯低于空白組,但高于BSA組。
引用本文： 魏蔚, 彭周, 鄧捷, 張威, 毛靖. 牙釉質結合肽的體外礦化研究. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(1): 132-135. doi: 10.7507/1001-5515.20140026 復制
引言
出自基因工程的無機物結合肽(genetically engineered peptides for inorganics，GEPIs)[1]是一類能與無機材料結合，并在相應的生物礦化過程中起調控作用的生物活性分子。隨著分子生物學技術的快速發展，越來越多的物質結合肽[2-5] (material binding peptides)進入研究人員的視野。這些結合肽不僅極大地豐富了GEPIs的內涵，也使得“GEPIs-底物礦化”成為新型生物材料和硬組織再生研究中的新熱點。
沿c軸擇優取向排列的生物羥基磷灰石是牙釉質的主要礦物成分，其優異的機械力學性能和生物學性能是單純化學法合成的磷灰石所無法比擬的。研究者們利用有機添加物，特別是磷灰石類礦物結合肽進行釉質仿生礦化的研究，不僅有利于對現有修復材料的改性，也為運用組織工程學進行牙體硬組織再生提供了新的思路[6]。
本研究首次報道了來源于噬菌體展示肽庫，具有牙釉質結合活性的肽序列(-CMPQVMPMC-)，并利用96孔板體外快速凝膠單擴散系統驗證體外合成的該環狀七肽對鈣/磷沉積的影響。
1 材料和方法
1.1 牙釉質結合力測定
1.1.1 牙釉質粉的制備
經患者同意，收集無明顯釉質齲損及發育異常的離體牙(華中科技大學附屬同濟醫院口腔醫學中心提供)。Isomet 1000慢速鋸(Buehler，USA)水冷條件磨除唇及舌側表面以收集牙釉質粉末，100目過篩，高壓滅菌。溶液200 μL等量分裝于1.5 mL離心管中備用。
1.1.2 結合力測定
參考試劑盒(Cat.E8120S,New England Biolabs，USA)的標準程序[3]，從第四輪淘選產物(以牙釉質為底物)中挑選單克隆擴增得到含有特定序列展示肽的噬菌體儲液。取含有等量牙釉質粉末的離心管，分別加入1×1011pfu含展示肽的噬菌體和野生型噬菌體M13(藍白篩選中由白色菌斑擴增得到)。測定洗脫液噬菌體滴度，并選取結合力明顯強于野生型噬菌體M13的單克隆，由上海生工生物工程有限公司的ABI3730XL自動DNA測序儀測定噬菌體插入序列(-CMPQVMPMC-)。
1.2 牙釉質結合肽的體外合成
固相法合成牙釉質結合肽(enamel-binding peptide，EBP) (-CMPQVMPMC-)凍干粉由上海生工生物工程有限公司提供。結合肽末端以二硫鍵成環以模擬噬菌體表面展示的肽構象。高效液相色譜(HPLC)及質譜(MS)報告其純度＞98.62%。
1.3 體外凝膠礦化實驗
1.3.1 礦化液配置
分析純化學試劑，去離子水配置礦化液及緩沖液。配置2×凝膠磷溶液：氯化鈉0.30 mol/L，磷酸氫二鈉0.02 mol/L，Hepes 0.05 mol/L，pH值為7.40。加熱溶液配置1.0%瓊脂糖-磷液，水浴55 ℃備用；配置1×鈣溶液：氯化鈉0.15 mol/L，氯化鈣0.01 mol/L，Hepes 0.05 mol/L，pH值為7.40，常溫備用；配置不同濃度2×EBP水溶液，常溫備用。
1.3.2 實驗分組及檢測
取適量肽儲液和凝膠磷溶液快速混勻，取100 μL加樣于96孔板中，每組6個重復。使凝膠中EBP的終濃度依次為1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mg/mL。以不含添加劑的凝膠磷溶液為空白對照組，含2.0 mg/mL BSA的凝膠磷液為控制組。待成膠后，每孔加入150 μL 1×鈣溶液，空白組留一空加150 μL去離子水。加樣完畢后，每間隔6 h，于Synergy2多功能酶標儀(Biotek，USA)測量405 nm OD值。測量間期，用封口膜封板，100%濕度下常溫保存。所得數據導入SPSS軟件，用ANOVA法進行統計分析。
2 實驗結果
2.1 牙釉質結合力的測定
投入相同濃度噬菌體的情況下，含展示肽序列(-CMPQVMPMC-)的噬菌體回收滴度為5×103 pfu/μL，而野生型噬菌體為2×105 pfu/μL。
2.2 EBP的分子鑒定
EBP(-CMPQVMPMC-)是環狀七肽，在N-端和C-端分別添加一個半胱氨酸，以二硫鍵成環。分子量約為1 037.38。HPLC及MS分析如圖 1所示。
圖1
EBP(-CMPQVMPMC-)質譜和色譜分析
(a)質譜分析；(b)高效液相色譜分析
Figure1. Mass spectrometry and chromatography analysis of EBP (-CMPQVMPMC-)(a) MS analysis； (b) HPLC analysis
2.3 凝膠礦化系統檢測EBP(-CMPQVMPMC-)對鈣/磷沉積的影響
以空白組(n=6)24 h末OD值增加量為標準(100%)，BSA控制組及各濃度EBP組(n=6)每6 h OD值相對增加量及累積增加量所占標準的百分比如圖 2所示。
圖2
各組樣本的相對OD值所占空白組(100%)的百分比
“-”表示24 h末各組OD值累計增量的標準差
Figure2. Relative absorbance values expressed as percentages relative to the blank group“-” represented the standard deviation of accumulated OD values at the 24th hour
以6 h內OD值增量＞50%為評價沉積高峰的標準，各組沉積高峰出現的時間依次為：空白組為6~12 h，2.5和3.0 mg/mL EBP組為12~18 h，1.0、1.5和2.0 mg/mL EBP組為18~24 h。在24 h觀測末期，EBP組OD值明顯大于BSA組(P＜0.01)而小于空白組(P＜0.05)。
3 討論
牙釉質是人體內最堅硬的硬組織，其礦物成分主要是非化學計量比并含有多種離子取代的納米級羥基磷灰石。沿c軸擇優排列的生物羥磷灰石在晶體結構和化學組成上與化學合成的羥磷灰石有明顯差異。以牙釉質為底物，利用噬菌體展示技術淘選的生物羥磷灰石結合肽，在靶向藥物治療和引導牙體組織再生等方面具有廣闊的應用前景。
由于生物羥磷灰石成分較為復雜，經四輪標準噬菌體肽庫篩選后沒有得到明顯的共有序列。雖然本文報道的EBP(-CMPQVMPMC-)序列與前期報道的磷灰石類礦物結合序列略有不同[3, 5]，但在結合力測試中，EBP(-CMPQVMPMC-)表現出較強的牙釉質的親和能力(約為野生型噬菌體的40倍)，因此選用該序列進一步驗證該肽在體外礦化試驗中對鈣/磷沉積的影響。
本文選用Fujisawa等[7]1996年提出的微孔板體外凝膠系統礦化法并稍加改良以模擬生物體內磷灰石緩慢沉積的過程。此法屬于單擴散快速凝膠礦化系統，在凝膠中加入不同濃度的添加劑，選用96孔板作為礦化載體，可以方便地使用多功能酶標儀對各樣本凝膠渾濁變化進行實時測量。
礦化實驗結果表明，在不加入任何有機添加劑的情況下，礦化開始的6 h內，由于離子擴散作用，凝膠中形成局部鈣/磷離子過飽和區域，鈣磷沉積在局部形成。隨著鈣離子濃度逐漸累積，鈣磷沉積在6~12 h內迅速發生(見圖 2中12 h末空白組累積濁度增加＞80%)。沉積高峰過后，凝膠中鈣/磷過飽和度逐漸下降，礦物沉積速度也隨之降低。
相比而言，凝膠中2.0 mg/mL 的BSA添加劑能明顯抑制本法的鈣磷沉積。至觀察結束點24 h止，BSA組總相對增量不到空白組的20%(P＜0.001)，并且在觀測全程內未檢測到沉積高峰的出現。BSA對羥磷灰石的非特異性吸附和BSA-磷灰石可溶性復合物形成[8-9]可能是觀測時段內未發現沉積高峰的原因。
實驗組礦化結果顯示，凝膠中EBP(-CMPQVMPMC-)對鈣磷沉積行為有明顯影響，且這種影響具有一定的濃度效應。如當EBP濃度為2.5~3.0 mg/mL時，鈣磷沉積高峰延遲至12~18 h(空白組為6~18 h)；而當EBP濃度低于2.0 mg/mL時，鈣磷沉積高峰進一步后移至18~24 h之間。且在所測的濃度范圍內(1.0~3.0 mg/mL)，EBP各組24 h鈣磷的沉積量低于空白組(P＜0.05)。沉積高峰的出現是大量鈣/磷晶核形成和繼發晶核外延生長兩方面協同作用的結果。EBP對上述鈣/磷結晶行為的影響可以解釋為：一方面EBP能與游離的鈣磷離子相互作用，以減少晶體成核的有效離子濃度；但與此同時，EBP與磷根離子競爭選擇性吸附于鈣/磷晶核表面的某些位點，在一定程度上妨礙了晶核的外延性生長。兩種影響的協同作用造成了超過時間閾值后的鈣磷沉積高峰。
由于本系統所測的OD值和鈣磷沉積量不是線性關系，故只能通過凝膠濁度的變化半定量測定來指示鈣/磷沉積的多少[10]。各濃度EBP抑制鈣/磷沉積的能力明顯低于2.0 mg/mL的BSA，說明EBP封閉鈣/磷沉積相關活性位點的能力明顯不如具有非特異性結合能力的BSA。但由于測試手段的局限，尚不能明確指出EBP(-CMPQVMPMC-)是否對某些位點具有特殊的嗜好。而且，EBP在影響凝膠系統鈣磷結晶行為中所表現出的“濃度效應”[11]可能暗示在不同濃度情況下，EBP對結晶行為的影響機制有一定的差異。此外，EBP(-CMPQVMPMC-)是否具有單獨成核的能力以及對晶體形貌的影響尚有待進一步驗證。
4 結論
本研究體外合成了具有牙釉質結合活性的環肽序列(-CMPQVMPMC-)。在96孔板體外快速凝膠單擴散系統礦化實驗中，發現該肽能夠抑制凝膠中鈣/磷沉積的量并影響其結晶速率，且具有較顯著的濃度效應。
引言
出自基因工程的無機物結合肽(genetically engineered peptides for inorganics，GEPIs)[1]是一類能與無機材料結合，并在相應的生物礦化過程中起調控作用的生物活性分子。隨著分子生物學技術的快速發展，越來越多的物質結合肽[2-5] (material binding peptides)進入研究人員的視野。這些結合肽不僅極大地豐富了GEPIs的內涵，也使得“GEPIs-底物礦化”成為新型生物材料和硬組織再生研究中的新熱點。
沿c軸擇優取向排列的生物羥基磷灰石是牙釉質的主要礦物成分，其優異的機械力學性能和生物學性能是單純化學法合成的磷灰石所無法比擬的。研究者們利用有機添加物，特別是磷灰石類礦物結合肽進行釉質仿生礦化的研究，不僅有利于對現有修復材料的改性，也為運用組織工程學進行牙體硬組織再生提供了新的思路[6]。
本研究首次報道了來源于噬菌體展示肽庫，具有牙釉質結合活性的肽序列(-CMPQVMPMC-)，并利用96孔板體外快速凝膠單擴散系統驗證體外合成的該環狀七肽對鈣/磷沉積的影響。
1 材料和方法
1.1 牙釉質結合力測定
1.1.1 牙釉質粉的制備
經患者同意，收集無明顯釉質齲損及發育異常的離體牙(華中科技大學附屬同濟醫院口腔醫學中心提供)。Isomet 1000慢速鋸(Buehler，USA)水冷條件磨除唇及舌側表面以收集牙釉質粉末，100目過篩，高壓滅菌。溶液200 μL等量分裝于1.5 mL離心管中備用。
1.1.2 結合力測定
參考試劑盒(Cat.E8120S,New England Biolabs，USA)的標準程序[3]，從第四輪淘選產物(以牙釉質為底物)中挑選單克隆擴增得到含有特定序列展示肽的噬菌體儲液。取含有等量牙釉質粉末的離心管，分別加入1×1011pfu含展示肽的噬菌體和野生型噬菌體M13(藍白篩選中由白色菌斑擴增得到)。測定洗脫液噬菌體滴度，并選取結合力明顯強于野生型噬菌體M13的單克隆，由上海生工生物工程有限公司的ABI3730XL自動DNA測序儀測定噬菌體插入序列(-CMPQVMPMC-)。
1.2 牙釉質結合肽的體外合成
固相法合成牙釉質結合肽(enamel-binding peptide，EBP) (-CMPQVMPMC-)凍干粉由上海生工生物工程有限公司提供。結合肽末端以二硫鍵成環以模擬噬菌體表面展示的肽構象。高效液相色譜(HPLC)及質譜(MS)報告其純度＞98.62%。
1.3 體外凝膠礦化實驗
1.3.1 礦化液配置
分析純化學試劑，去離子水配置礦化液及緩沖液。配置2×凝膠磷溶液：氯化鈉0.30 mol/L，磷酸氫二鈉0.02 mol/L，Hepes 0.05 mol/L，pH值為7.40。加熱溶液配置1.0%瓊脂糖-磷液，水浴55 ℃備用；配置1×鈣溶液：氯化鈉0.15 mol/L，氯化鈣0.01 mol/L，Hepes 0.05 mol/L，pH值為7.40，常溫備用；配置不同濃度2×EBP水溶液，常溫備用。
1.3.2 實驗分組及檢測
取適量肽儲液和凝膠磷溶液快速混勻，取100 μL加樣于96孔板中，每組6個重復。使凝膠中EBP的終濃度依次為1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mg/mL。以不含添加劑的凝膠磷溶液為空白對照組，含2.0 mg/mL BSA的凝膠磷液為控制組。待成膠后，每孔加入150 μL 1×鈣溶液，空白組留一空加150 μL去離子水。加樣完畢后，每間隔6 h，于Synergy2多功能酶標儀(Biotek，USA)測量405 nm OD值。測量間期，用封口膜封板，100%濕度下常溫保存。所得數據導入SPSS軟件，用ANOVA法進行統計分析。
2 實驗結果
2.1 牙釉質結合力的測定
投入相同濃度噬菌體的情況下，含展示肽序列(-CMPQVMPMC-)的噬菌體回收滴度為5×103 pfu/μL，而野生型噬菌體為2×105 pfu/μL。
2.2 EBP的分子鑒定
EBP(-CMPQVMPMC-)是環狀七肽，在N-端和C-端分別添加一個半胱氨酸，以二硫鍵成環。分子量約為1 037.38。HPLC及MS分析如圖 1所示。
圖1
EBP(-CMPQVMPMC-)質譜和色譜分析
(a)質譜分析；(b)高效液相色譜分析
Figure1. Mass spectrometry and chromatography analysis of EBP (-CMPQVMPMC-)(a) MS analysis； (b) HPLC analysis
2.3 凝膠礦化系統檢測EBP(-CMPQVMPMC-)對鈣/磷沉積的影響
以空白組(n=6)24 h末OD值增加量為標準(100%)，BSA控制組及各濃度EBP組(n=6)每6 h OD值相對增加量及累積增加量所占標準的百分比如圖 2所示。
圖2
各組樣本的相對OD值所占空白組(100%)的百分比
“-”表示24 h末各組OD值累計增量的標準差
Figure2. Relative absorbance values expressed as percentages relative to the blank group“-” represented the standard deviation of accumulated OD values at the 24th hour
以6 h內OD值增量＞50%為評價沉積高峰的標準，各組沉積高峰出現的時間依次為：空白組為6~12 h，2.5和3.0 mg/mL EBP組為12~18 h，1.0、1.5和2.0 mg/mL EBP組為18~24 h。在24 h觀測末期，EBP組OD值明顯大于BSA組(P＜0.01)而小于空白組(P＜0.05)。
3 討論
牙釉質是人體內最堅硬的硬組織，其礦物成分主要是非化學計量比并含有多種離子取代的納米級羥基磷灰石。沿c軸擇優排列的生物羥磷灰石在晶體結構和化學組成上與化學合成的羥磷灰石有明顯差異。以牙釉質為底物，利用噬菌體展示技術淘選的生物羥磷灰石結合肽，在靶向藥物治療和引導牙體組織再生等方面具有廣闊的應用前景。
由于生物羥磷灰石成分較為復雜，經四輪標準噬菌體肽庫篩選后沒有得到明顯的共有序列。雖然本文報道的EBP(-CMPQVMPMC-)序列與前期報道的磷灰石類礦物結合序列略有不同[3, 5]，但在結合力測試中，EBP(-CMPQVMPMC-)表現出較強的牙釉質的親和能力(約為野生型噬菌體的40倍)，因此選用該序列進一步驗證該肽在體外礦化試驗中對鈣/磷沉積的影響。
本文選用Fujisawa等[7]1996年提出的微孔板體外凝膠系統礦化法并稍加改良以模擬生物體內磷灰石緩慢沉積的過程。此法屬于單擴散快速凝膠礦化系統，在凝膠中加入不同濃度的添加劑，選用96孔板作為礦化載體，可以方便地使用多功能酶標儀對各樣本凝膠渾濁變化進行實時測量。
礦化實驗結果表明，在不加入任何有機添加劑的情況下，礦化開始的6 h內，由于離子擴散作用，凝膠中形成局部鈣/磷離子過飽和區域，鈣磷沉積在局部形成。隨著鈣離子濃度逐漸累積，鈣磷沉積在6~12 h內迅速發生(見圖 2中12 h末空白組累積濁度增加＞80%)。沉積高峰過后，凝膠中鈣/磷過飽和度逐漸下降，礦物沉積速度也隨之降低。
相比而言，凝膠中2.0 mg/mL 的BSA添加劑能明顯抑制本法的鈣磷沉積。至觀察結束點24 h止，BSA組總相對增量不到空白組的20%(P＜0.001)，并且在觀測全程內未檢測到沉積高峰的出現。BSA對羥磷灰石的非特異性吸附和BSA-磷灰石可溶性復合物形成[8-9]可能是觀測時段內未發現沉積高峰的原因。
實驗組礦化結果顯示，凝膠中EBP(-CMPQVMPMC-)對鈣磷沉積行為有明顯影響，且這種影響具有一定的濃度效應。如當EBP濃度為2.5~3.0 mg/mL時，鈣磷沉積高峰延遲至12~18 h(空白組為6~18 h)；而當EBP濃度低于2.0 mg/mL時，鈣磷沉積高峰進一步后移至18~24 h之間。且在所測的濃度范圍內(1.0~3.0 mg/mL)，EBP各組24 h鈣磷的沉積量低于空白組(P＜0.05)。沉積高峰的出現是大量鈣/磷晶核形成和繼發晶核外延生長兩方面協同作用的結果。EBP對上述鈣/磷結晶行為的影響可以解釋為：一方面EBP能與游離的鈣磷離子相互作用，以減少晶體成核的有效離子濃度；但與此同時，EBP與磷根離子競爭選擇性吸附于鈣/磷晶核表面的某些位點，在一定程度上妨礙了晶核的外延性生長。兩種影響的協同作用造成了超過時間閾值后的鈣磷沉積高峰。
由于本系統所測的OD值和鈣磷沉積量不是線性關系，故只能通過凝膠濁度的變化半定量測定來指示鈣/磷沉積的多少[10]。各濃度EBP抑制鈣/磷沉積的能力明顯低于2.0 mg/mL的BSA，說明EBP封閉鈣/磷沉積相關活性位點的能力明顯不如具有非特異性結合能力的BSA。但由于測試手段的局限，尚不能明確指出EBP(-CMPQVMPMC-)是否對某些位點具有特殊的嗜好。而且，EBP在影響凝膠系統鈣磷結晶行為中所表現出的“濃度效應”[11]可能暗示在不同濃度情況下，EBP對結晶行為的影響機制有一定的差異。此外，EBP(-CMPQVMPMC-)是否具有單獨成核的能力以及對晶體形貌的影響尚有待進一步驗證。
4 結論
本研究體外合成了具有牙釉質結合活性的環肽序列(-CMPQVMPMC-)。在96孔板體外快速凝膠單擴散系統礦化實驗中，發現該肽能夠抑制凝膠中鈣/磷沉積的量并影響其結晶速率，且具有較顯著的濃度效應。
