本文通過動物實驗,觀察N-果糖修飾的殼聚糖季銨鹽衍生物對大鼠皮膚傷口愈合的效果。實驗用SD大鼠40只,隨機分8組。其中4組為實驗組,4組為對照組。沿背部脊柱旁皮膚建立1.50 cm×2.00 cm×0.16 cm全層皮膚切除傷口模型,實驗組用N-果糖修飾的殼聚糖季銨鹽衍生物軟膏敷傷口,對照組用無菌醫用凡士林進行處理。每日換藥2次,觀察各組傷口愈合。在3、7、10、15 d之后觀察各組創面愈合情況,創口病理觀察。結果顯示傷口愈合時間在實驗組和對照組之間差異有統計學意義(P＜0.05);創口愈合面積和容積愈合程度兩組之間差異有統計學意義(P＜0.05)。綜上所述,N-果糖修飾的殼聚糖季銨鹽衍生物對皮膚沒有毒副作用,對皮膚愈合有促進作用,適宜作為皮膚修復材料,是醫用敷料的理想原料。
引用本文： 余珍, 章志量, 尹洪萍, 熊文說. 殼聚糖天然高分子衍生物促進大鼠皮膚愈合. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(1): 142-145. doi: 10.7507/1001-5515.20140028 復制
引言
創傷是外科常見的問題，目前有許多藥物及輔料用于創面愈合。例如多糖敷料、藻酸鹽敷料、水凝膠敷料、水膠體敷料等。殼聚糖具有無毒、無抗原性、抗氧化性、良好的生物相容性和生物降解性等優點； 水溶性殼聚糖易溶于水，有良好的吸收、保濕、調理、抑菌等功能[1-4]。殼聚糖及其衍生物的一些生物特性決定了其可以加速傷口愈合過程，增強炎癥細胞、巨噬細胞和成纖維細胞的功能，被認為是最有希望應用于皮膚組織的材料[5-6]。殼聚糖的衍生物N-果糖修飾的殼聚糖季銨鹽具有優異的吸濕保濕性能和DPPH自由基清除能力[7]。本文采用N-果糖修飾的殼聚糖季銨鹽衍生物對大鼠傷口愈合進行觀察研究。
1 材料與方法
1.1 動物
Sprague-Dawley大鼠40只，體重200～230 g(杭州師范大學實驗動物中心提供)。大鼠在培養間內飼養，環境溫度為22 ℃，以12 h為一周期改變光照和黑暗，食物和水隨意提供。
1.2 試劑
實驗組：N-果糖修飾的殼聚糖季銨鹽衍生物(MW=200.2 kD，浙江工業大學藥學院提供)。該物質的制備方法及紅外譜圖和抗氧化性能表征參見熊文說等[7]的研究結果。將N-果糖修飾的殼聚糖季銨鹽衍生物配制成20%的濃溶液，放入冰箱4 ℃保存備用。
對照組：醫用凡士林(浙江大學附屬第二醫院提供)。
1.3 分組
SD 大鼠40只，體重為200～230 g。隨機分組，每5只為一組。其中20只為實驗組，20只為空白對照組。每日傷口給藥2次(12 h/次)。
1.4 全層皮膚急性傷口模型
傷口創面設計全層皮膚急性傷口模型，深度達背脊肌肌膜，創面外口與背脊肌肌膜(深部)創面大小一致，未設瘺道、隧道創面。稱重后，大鼠取俯臥位，剪去大鼠背部毛發，用4%硫化鈉脫毛，4%水合氯醛麻醉(1 mL/100 g)，用碘伏及70%乙醇常規消毒皮膚后，切開皮膚全層，抵達背脊肌肌膜。沿背部左右各0.75 cm行脊柱旁切口，長2 cm，切除皮膚全層，建立1.50 cm×2.00 cm×0.16 cm急性傷口模型，實驗組用N-果糖修飾的殼聚糖季銨鹽衍生物軟膏敷傷口，對照組用醫用凡士林敷傷口，敷藥后兩組均用無菌紗布覆蓋傷口。以后按此規則，前三天每日換藥兩次，三天后每日換藥一次，觀察各組傷口愈合，及時記錄。
1.5 結果觀察
每天觀察傷口變化并記錄創口表面顏色、滲液、肉芽組織床生長情況，查看傷口是否有瘺道、隧道形成，是否有異味。分別在3、7、10、15 d用脫椎法處死動物，稱大鼠體重，用透明膠膜法和注水法測量創口的面積和容積，并分別提取包括傷口的皮膚組織進行病理觀察，用HE和MASSON染色觀察肉芽組織生長情況和再上皮化生等變化。
1.6 統計學分析
用t檢驗處理以上各試驗數據，觀察各實驗組和對照組比較差異是否有統計學意義，以上所有數據均用SPSS 18.0 軟件進行分析，以P＜0.05為有統計學意義。
2 實驗結果
2.1 傷口愈合觀察
實驗組給藥3 d后傷口開始縮小，傷口創傷組織呈粉紅色，表面平整、濕潤，無明顯傷口滲液，沒有壞死或腐肉組織，沒有異味，無瘺管、隧道形成。傷口邊緣和周圍皮膚組織顏色淺紅、彈性好、有輕度水腫，敷料干燥，無膿性及血性分泌物黏附；7 d時創面明顯縮小，創面干燥，無分泌物，創口有很薄的結痂，邊緣由長方形逐漸變化呈梭形；10 d時結痂收縮得更快，對照組結痂收縮相對緩慢；15 d時實驗組和對照組均已無明顯的傷口，創緣整齊,對合好,無感染，線狀瘢痕，傷口完全愈合(見圖 1)。實驗組和對照組傷口愈合時間分別為(10.5±0.53)和(12.0±0.54)d,兩組之間差異有統計學意義(P＜0.05)。
圖1
肉眼觀察大鼠皮膚傷口愈合
Figure1.
Macroscopic observation of rat skin wound healing process
2.2 給藥后實驗組與對照組大鼠傷口表面積的差異
動物經試驗后活動減少，3 d后兩組創傷面積有明顯差異(P＜0.05)；傷后7 d傷口明顯縮小，以實驗組更為明顯(P＜0.05)；傷后15 d隨著時間延長，兩組創口基本愈合。用SPSS統計軟件分析實驗組與對照組3、7、10、15 d傷口表面積，發現兩組之間3、7、10、15 d創面面積差異均有統計學意義(P＜0.05)(見表 1)。
表1
給藥后大鼠實驗組與對照組傷口表面積和容積
Table1.
Surface area and volume of wound in experimental and control groups after administration
2.3 給藥后實驗組與對照組大鼠創口容積的差異
兩組創口容積改變規律與面積改變相一致，在3 d時實驗組容積減少已較對照組明顯(P＜0.05)，隨著時間延長，在7、10和15 d兩組創口逐漸縮小，實驗組縮小更明顯(P＜0.05)(見表 1)。
2.4 病理切片分析(見圖 2 )
3 d時實驗組創面出現肉芽組織，成纖維細胞增生活躍,膠原組織增生明顯，有較多的毛細血管增生。傷后7 d時，實驗組創面膠原纖維增生明顯，毛細血管增生明顯，毛細血管量和成纖維細胞、膠原纖維明顯多于對照組。15 d時實驗組膠原纖維增生明顯，分布均勻，傷口內未見異物組織，沒有組織破壞和壞死現象，創面可見連續的上皮覆蓋；而對照組7 d時膠原纖維增生程度較實驗組弱，15 d時膠原纖維增生與7 d和10 d相比沒有明顯改變，纖維排列平整度稍差，創面可見間斷的上皮覆蓋。
圖2
Masson & He染料對皮膚組織進行染色(400×)
1：毛細血管；2：成纖維細胞；3：膠原纖維
Figure2. Staining of skin tissue (400×) with Masson & HE dye1： blood capillary； 2： fibroblasts； 3： collagenous fiber
3 討論
傷口愈合是一個生物事件，有復雜的過程，涉及多種機制，包括五個階段：即炎癥導致止血及血栓形成，纖維組織增生和新生血管形成，肉芽組織增生，上皮化再生，最后是新的細胞外基質和組織重塑的形成[8]。殼聚糖大分子鏈上分布著許多羥基和氨基,使其具有良好的生物相容性和反應活性。
本實驗結果顯示，在肉眼觀察下，用N-果糖修飾的殼聚糖季銨鹽衍生物處理的實驗組大鼠，比用無菌凡士林處理的對照組大鼠傷口表面積縮小發生的時間更早，創口愈合平整，沒有組織壞死。統計學分析愈合面積和體積，實驗組3、7和15 d時創口愈合均明顯好于凡士林對照組(P＜0.05),說明殼聚糖衍生物對皮膚有明顯的促進愈合作用，能促進創口提前愈合。
組織學染色觀察實驗組成纖維細胞增生以及膠原纖維、毛細血管增生比對照組出現得更早,創傷后3 d毛細血管明顯增生；成纖維細胞開始增殖，第7 d后開始合成膠原蛋白、毛細血管明顯增多；10 d后成纖維細胞迅速增殖，膠原組織大量增生，使創面得以填充并引起收縮，創面迅速愈合；膠原蛋白進行改建，排列平整有序；創口15 d時已基本愈合，膠原蛋白豐富，毛細血管數量減少，創口內未見異物，傷口收縮比對照組明顯提前。說明殼聚糖處理傷口可以加速膠原蛋白的分泌，在創傷修復的全過程中，膠原蛋白大量合成。
4 結論
殼聚糖衍生物處理皮膚創口后創口愈合平整，愈合時間較對照組提前，植入物短時間內能完全降解，說明殼聚糖天然高分子衍生物對皮膚愈合有促進作用，對大鼠的生理影響小于對照組，適宜作為皮膚修復材料，是醫用敷料的理想原料。
引言
創傷是外科常見的問題，目前有許多藥物及輔料用于創面愈合。例如多糖敷料、藻酸鹽敷料、水凝膠敷料、水膠體敷料等。殼聚糖具有無毒、無抗原性、抗氧化性、良好的生物相容性和生物降解性等優點； 水溶性殼聚糖易溶于水，有良好的吸收、保濕、調理、抑菌等功能[1-4]。殼聚糖及其衍生物的一些生物特性決定了其可以加速傷口愈合過程，增強炎癥細胞、巨噬細胞和成纖維細胞的功能，被認為是最有希望應用于皮膚組織的材料[5-6]。殼聚糖的衍生物N-果糖修飾的殼聚糖季銨鹽具有優異的吸濕保濕性能和DPPH自由基清除能力[7]。本文采用N-果糖修飾的殼聚糖季銨鹽衍生物對大鼠傷口愈合進行觀察研究。
1 材料與方法
1.1 動物
Sprague-Dawley大鼠40只，體重200～230 g(杭州師范大學實驗動物中心提供)。大鼠在培養間內飼養，環境溫度為22 ℃，以12 h為一周期改變光照和黑暗，食物和水隨意提供。
1.2 試劑
實驗組：N-果糖修飾的殼聚糖季銨鹽衍生物(MW=200.2 kD，浙江工業大學藥學院提供)。該物質的制備方法及紅外譜圖和抗氧化性能表征參見熊文說等[7]的研究結果。將N-果糖修飾的殼聚糖季銨鹽衍生物配制成20%的濃溶液，放入冰箱4 ℃保存備用。
對照組：醫用凡士林(浙江大學附屬第二醫院提供)。
1.3 分組
SD 大鼠40只，體重為200～230 g。隨機分組，每5只為一組。其中20只為實驗組，20只為空白對照組。每日傷口給藥2次(12 h/次)。
1.4 全層皮膚急性傷口模型
傷口創面設計全層皮膚急性傷口模型，深度達背脊肌肌膜，創面外口與背脊肌肌膜(深部)創面大小一致，未設瘺道、隧道創面。稱重后，大鼠取俯臥位，剪去大鼠背部毛發，用4%硫化鈉脫毛，4%水合氯醛麻醉(1 mL/100 g)，用碘伏及70%乙醇常規消毒皮膚后，切開皮膚全層，抵達背脊肌肌膜。沿背部左右各0.75 cm行脊柱旁切口，長2 cm，切除皮膚全層，建立1.50 cm×2.00 cm×0.16 cm急性傷口模型，實驗組用N-果糖修飾的殼聚糖季銨鹽衍生物軟膏敷傷口，對照組用醫用凡士林敷傷口，敷藥后兩組均用無菌紗布覆蓋傷口。以后按此規則，前三天每日換藥兩次，三天后每日換藥一次，觀察各組傷口愈合，及時記錄。
1.5 結果觀察
每天觀察傷口變化并記錄創口表面顏色、滲液、肉芽組織床生長情況，查看傷口是否有瘺道、隧道形成，是否有異味。分別在3、7、10、15 d用脫椎法處死動物，稱大鼠體重，用透明膠膜法和注水法測量創口的面積和容積，并分別提取包括傷口的皮膚組織進行病理觀察，用HE和MASSON染色觀察肉芽組織生長情況和再上皮化生等變化。
1.6 統計學分析
用t檢驗處理以上各試驗數據，觀察各實驗組和對照組比較差異是否有統計學意義，以上所有數據均用SPSS 18.0 軟件進行分析，以P＜0.05為有統計學意義。
2 實驗結果
2.1 傷口愈合觀察
實驗組給藥3 d后傷口開始縮小，傷口創傷組織呈粉紅色，表面平整、濕潤，無明顯傷口滲液，沒有壞死或腐肉組織，沒有異味，無瘺管、隧道形成。傷口邊緣和周圍皮膚組織顏色淺紅、彈性好、有輕度水腫，敷料干燥，無膿性及血性分泌物黏附；7 d時創面明顯縮小，創面干燥，無分泌物，創口有很薄的結痂，邊緣由長方形逐漸變化呈梭形；10 d時結痂收縮得更快，對照組結痂收縮相對緩慢；15 d時實驗組和對照組均已無明顯的傷口，創緣整齊,對合好,無感染，線狀瘢痕，傷口完全愈合(見圖 1)。實驗組和對照組傷口愈合時間分別為(10.5±0.53)和(12.0±0.54)d,兩組之間差異有統計學意義(P＜0.05)。
圖1
肉眼觀察大鼠皮膚傷口愈合
Figure1.
Macroscopic observation of rat skin wound healing process
2.2 給藥后實驗組與對照組大鼠傷口表面積的差異
動物經試驗后活動減少，3 d后兩組創傷面積有明顯差異(P＜0.05)；傷后7 d傷口明顯縮小，以實驗組更為明顯(P＜0.05)；傷后15 d隨著時間延長，兩組創口基本愈合。用SPSS統計軟件分析實驗組與對照組3、7、10、15 d傷口表面積，發現兩組之間3、7、10、15 d創面面積差異均有統計學意義(P＜0.05)(見表 1)。
表1
給藥后大鼠實驗組與對照組傷口表面積和容積
Table1.
Surface area and volume of wound in experimental and control groups after administration
2.3 給藥后實驗組與對照組大鼠創口容積的差異
兩組創口容積改變規律與面積改變相一致，在3 d時實驗組容積減少已較對照組明顯(P＜0.05)，隨著時間延長，在7、10和15 d兩組創口逐漸縮小，實驗組縮小更明顯(P＜0.05)(見表 1)。
2.4 病理切片分析(見圖 2 )
3 d時實驗組創面出現肉芽組織，成纖維細胞增生活躍,膠原組織增生明顯，有較多的毛細血管增生。傷后7 d時，實驗組創面膠原纖維增生明顯，毛細血管增生明顯，毛細血管量和成纖維細胞、膠原纖維明顯多于對照組。15 d時實驗組膠原纖維增生明顯，分布均勻，傷口內未見異物組織，沒有組織破壞和壞死現象，創面可見連續的上皮覆蓋；而對照組7 d時膠原纖維增生程度較實驗組弱，15 d時膠原纖維增生與7 d和10 d相比沒有明顯改變，纖維排列平整度稍差，創面可見間斷的上皮覆蓋。
圖2
Masson & He染料對皮膚組織進行染色(400×)
1：毛細血管；2：成纖維細胞；3：膠原纖維
Figure2. Staining of skin tissue (400×) with Masson & HE dye1： blood capillary； 2： fibroblasts； 3： collagenous fiber
3 討論
傷口愈合是一個生物事件，有復雜的過程，涉及多種機制，包括五個階段：即炎癥導致止血及血栓形成，纖維組織增生和新生血管形成，肉芽組織增生，上皮化再生，最后是新的細胞外基質和組織重塑的形成[8]。殼聚糖大分子鏈上分布著許多羥基和氨基,使其具有良好的生物相容性和反應活性。
本實驗結果顯示，在肉眼觀察下，用N-果糖修飾的殼聚糖季銨鹽衍生物處理的實驗組大鼠，比用無菌凡士林處理的對照組大鼠傷口表面積縮小發生的時間更早，創口愈合平整，沒有組織壞死。統計學分析愈合面積和體積，實驗組3、7和15 d時創口愈合均明顯好于凡士林對照組(P＜0.05),說明殼聚糖衍生物對皮膚有明顯的促進愈合作用，能促進創口提前愈合。
組織學染色觀察實驗組成纖維細胞增生以及膠原纖維、毛細血管增生比對照組出現得更早,創傷后3 d毛細血管明顯增生；成纖維細胞開始增殖，第7 d后開始合成膠原蛋白、毛細血管明顯增多；10 d后成纖維細胞迅速增殖，膠原組織大量增生，使創面得以填充并引起收縮，創面迅速愈合；膠原蛋白進行改建，排列平整有序；創口15 d時已基本愈合，膠原蛋白豐富，毛細血管數量減少，創口內未見異物，傷口收縮比對照組明顯提前。說明殼聚糖處理傷口可以加速膠原蛋白的分泌，在創傷修復的全過程中，膠原蛋白大量合成。
4 結論
殼聚糖衍生物處理皮膚創口后創口愈合平整，愈合時間較對照組提前，植入物短時間內能完全降解，說明殼聚糖天然高分子衍生物對皮膚愈合有促進作用，對大鼠的生理影響小于對照組，適宜作為皮膚修復材料，是醫用敷料的理想原料。
