隨著分子生物學技術的進步和基因遺傳學的發展，病毒載體系統不斷地得到改良及優化，并以其特有的優勢逐漸成為眼科基因治療的良好載體之一。目前，多種病毒載體已應用于眼科疾病的基因治療研究并取得較好成果。腺病毒載體具有瞬時表達的特點，在減輕角膜移植免疫反應等領域發揮重要作用；慢病毒載體具有穩定高效的特點，在體內可長期緩慢表達，為青光眼治療提供了新的給藥方案；腺相關病毒載體具有免疫原性低，精準持久等特點，可感染多種視網膜細胞，其與成簇規律間隔的短回文重復序列及其相關蛋白9聯合使用，為眼科遺傳疾病的精準治療提供了新的思路。病毒載體的出現大大提高了基因治療的應用潛力，具有傳統療法不可比擬的優勢。相信隨著技術的進步，以病毒為載體的基因轉導技術將會很快進入臨床應用，解決更多的眼科疑難問題。
引用本文： 東莉潔, 張慧, 王瓊, 洪雅茹, 李筱榮. 以病毒為載體的基因轉導技術在眼科研究中的應用. 中華眼底病雜志, 2020, 36(2): 165-170. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2020.02.019 復制
隨著對基因治療的深入研究和分子生物學技術的進步，以病毒為載體攜帶功能基因轉導視網膜的基因治療成為目前國內外研究熱點。病毒載體因具有轉導效率高和自動完成復雜的裝配過程等優勢而得到廣泛應用。目前在眼科常用的病毒載體有腺病毒載體（AdV）、慢病毒載體（LV）、腺相關病毒載體（AAV）等。Kalesnykas等[1]曾將AdV、LV、AAV三種病毒載體分別轉染視網膜細胞，發現其在轉染效率、外源基因維持時間、侵染部位及組織親和力等方面存在顯著差異。這提示在研究眼科某種疾病時，可不局限于使用某種特定載體，而應根據疾病的具體需求，有針對性地對所要使用的病毒載體加以選擇，以期達到最佳的治療效果。現就以病毒為載體的基因轉導技術在眼科研究中的應用作一綜述。
1 眼科研究中常用的病毒載體
1.1 AdV
腺病毒是一種線性雙鏈DNA病毒，在自然界分布廣泛。其利用病毒可感染宿主細胞的特點，簡便有效地將目的基因導入靶細胞，并實現其高效表達[2-3]。腺病毒的基因包裝容量較大，可插入的大片段外源基因最多可達35 kb。腺病毒可轉染不同類型的人組織細胞，但其進入細胞內并不整合到宿主細胞基因組，僅瞬間表達，因而具有較高的安全性。目前共有三代AdV，第一代可能誘發宿主體內細胞免疫和體液免疫反應而導致組織損傷，第二代和第三代在容量和安全性方面有所改良[4]。但目前應用最廣泛的仍為第一代AdV。其在眼前節及眼后節均表現出較高的轉導效率[5-9]。
1.2 LV
慢病毒屬逆轉錄病毒科，是一種正鏈RNA病毒。其載體具有高效穩定的轉移效率、低細胞毒性和低免疫應答性。LV是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒為基礎發展起來的基因治療載體。它較AdV的免疫反應小，可重復應用[10]。慢病毒可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，并隨細胞基因組分裂而分裂，從而達到持續穩定表達的目的。在體外實驗及體內實驗的研究中，慢病毒己經成為表達外源基因常用的載體形式之一，并廣泛應用于角膜病、新生血管疾病和青光眼等多種眼科疾病建模及治療[11-14]。
1.3 AAV
腺相關病毒是非致病的微小病毒家族成員，包裹著大約4.7 kb的線性單鏈DNA基因組，其只有依賴輔助病毒才可以增生。目前在人體中發現的AAV血清型有12種，其衣殼蛋白各不相同，并因此導致各種血清型的病毒載體對不同的組織和細胞有不同的轉染效率。作為基因療法載體的重組腺相關病毒攜帶的蛋白衣殼與野生型腺相關病毒幾乎相同，但重組腺相關病毒衣殼內攜帶治療型轉基因，野生型攜帶病毒組基因。一方面可以最大化AAV攜帶轉基因的容量，另一方面減小體內遞送轉基因時產生的免疫原性和細胞毒性。因此，AAV具有免疫原性低、毒性小的特點，并且提供長期的轉基因表達，單次給藥后可以持續長達6年[15]。在過去的十年中，研究者們已逐漸證實，不同血清型來源的AAV可以成功轉染光感受器細胞、RPE細胞、Müller細胞和人角膜上皮細胞等[16-19]。AAV已經成為眼科領域應用最廣泛的病毒載體之一。
1.4 AAV與CRISPR/Cas9基因編輯
由成簇規律間隔的短回文重復序列（CRISPR）/CRISPR相關蛋白9（Cas9）系統改造的第三代人工核酸內切酶可以在短時間內或低水平表達的靶向DNA編輯。其中Cas9 DNA核酸內切酶在基因組中的目標位置產生雙鏈DNA斷裂，激活內源性DNA修復機制[20]。其具有簡單快捷、突變效率高、成本低廉、適用范圍廣等優點，CRISPR/Cas9已經成為體外基因組編輯的最流行系統。在體內實驗中，基因編輯受到Cas9的導入問題的限制，需要借助載體；而AAV由于安全性較高，已被廣泛應用于CRISPR/Cas9系統的遞送[21]。并且，AAV介導的CRISPR/Cas9系統可以在體內成功轉導人視網膜細胞，具有很大的應用前景[22-23]。
2 病毒載體在眼科研究中的應用
2.1 AdV
AdV因其良好的轉染效率和較高的安全性已被廣泛應用在基因治療抑制新生血管的研究中。在氧誘導視網膜病變（OIR）模型研究中，AdV通過轉染S100A4-RNA干擾可降低環磷酸腺苷反應元件結合蛋白的表達，并且通過調節Bcl-2的抗細胞凋亡作用減少OIR視網膜新生血管的發生[24]。另一方面，Li等[25]通過腺病毒介導的siRNA沉默視網膜還原型輔酶Ⅱ氧化酶4的表達，觀察到其可以顯著降低OIR中細胞外調節蛋白激酶的激活，并減少視網膜新生血管的形成。Han和Li[26]發現，Ad-p21在OIR小鼠模型中也有抑制視網膜新生血管的作用。
以腺病毒為載體的基因療法在抑制角膜移植免疫排斥方面取得了一些進展。Wang等[27]使用含IL-10基因的重組AdV體外轉染大鼠骨髓來源的樹突狀細胞（DC），抑制DC的成熟，且IL-10基因修飾的未成熟DC能減少角膜移植排斥反應，促進免疫耐受的形成，從而延長角膜植片的存活時間。Kaufmann等[28]使用AdV介導IL-10細胞因子轉染同種異體角膜移植物，結果表明該方法可以延長大鼠模型中角膜緣同種異體移植物的存活時間。李漢林等[29]在高危角膜新生血管兔的角膜下注射重組AdV介導的血管抑制素，結果顯示實驗組的炎癥反應減輕。這表明重組AdV介導的血管抑制素可抑制角膜新生血管的生成，降低角膜移植手術的風險。在AdV的種類方面，Serratrice等[30]比較了犬腺病毒2型（CAV-2）載體在小鼠和非人靈長類動物體內轉導角膜細胞，以及在狗和人角膜外植體體外轉導的功效，結果提示依賴于輔助病毒的CAV-2可以作為基因治療的有效載體。
2.2 LV
原發性開角型青光眼（POAG）是世界范圍內導致不可逆盲的原因之一。小梁網、Schlemm管、集合管、鞏膜靜脈等房水流出通道發生病變阻礙房水流出是POAG中眼壓升高的主要機制。經LV對小梁網細胞進行的靶向基因治療是近期研究的熱點。Loewen等[31]將兩種LV或另一種逆轉錄病毒載體注入到人類供體眼的房水循環中，結果表明LV可以成功轉染小梁網細胞。這提示LV可以有效對人小梁網細胞進行遺傳修飾。另一方面，Aktas等[32]發現，MG132蛋白酶體抑制劑提高了LV在人小梁網細胞中的轉導效率，可作為LV向小梁網細胞傳遞治療基因的輔助手段。近幾年，研究者發現抑制RGC凋亡可以有效控制青光眼的進展。Sun等[33]通過LV轉染RGC-5s使母系表達基因3（MEG3）過表達或敲除，可上調MEG3，通過促進RGC凋亡參與青光眼的發病過程。Song等[34]向眼內注射Atoh7表達載體PGC-FU-Atoh7-GFP慢病毒和空的PGC-FU-GFP慢病毒，發現Atoh7在青光眼大鼠模型中促進Müller細胞來源的干細胞向RGC分化，使RGC軸突生長缺陷，從而導致信號轉導受阻。針對這一現象，He等[35]通過PGC-FU-Atoh7-GFP慢病毒將miR-124或anti-miR-124轉染到Müller細胞來源的干細胞中，結果顯示LV介導的miR-124具有治療青光眼的潛力。目前青光眼患者需長期用藥，給生理和生活帶來不便。慢病毒可以感染分裂后的細胞，具有持續表達目標基因的能力。Tan等[36]使用LV攜帶C3轉移酶基因轉染猴眼前節，可以達到長期降低眼內壓的效果。這說明LV可以更長效地作用于靶組織，其介導的藥物可以減少患者局部用藥的頻次。LV具有穩定高效的特點，是揭示青光眼發病機制和研發新藥物的有效工具。
白內障囊外摘除手術或晶狀體遭受外傷后，殘留的皮質和脫落在晶狀體后囊上的上皮細胞增生，在瞳孔區形成半透明的膜稱為后發性白內障。Krüppel樣因子6對于晶狀體上皮細胞（LECs）整合轉化的研究表明，LECs的存活、增生和分化作用顯著[37-38]。轉錄因子4和衰老標記蛋白30已被證實可以抑制LECs增生，同時可以減緩細胞增生，延長細胞周期[39-40]。不僅如此，慢病毒介導的小RNA感染可參與新生血管的調控作用[41]。這表明構建LV轉染宿主細胞可作為長期穩定抑制靶基因的有效方法。
2.3 AAV
Leber先天性黑矇（LCA）是一種常染色體隱性遺傳疾病，發病早，常導致嬰幼兒先天性盲。大約6%的LCA患者存在RPE65的突變。RPE65是一種相對分子質量為65×103的膜相關光轉導蛋白，負責將RPE中的全反式視黃酯轉變為11-順式視黃醇。RPE65突變可導致全反式視黃酯堆積和光感受器功能障礙。在具有RPE65突變的Rd12小鼠中，AAV2/5介導的RPE65基因轉導可恢復視桿細胞及光感受器功能，維持視網膜形態穩定達7個月[42]。在RPE65缺陷犬模型中，Acland等[43]證實AAV-RPE65恢復了視錐細胞及視桿細胞的功能并且具有較高的安全性。隨后在針對LCA患者開展的臨床試驗中觀察到，在視網膜下注射不同劑量的AAV均可改善患者視力，并且具有良好的耐受性[44-45]。對初次注射的對側眼進行AAV轉導治療，同樣具有較好的安全性和有效性[46]。基于AAV轉導RPE65的高效性及安全性并經過大量臨床試驗，2017年美國食品與藥物管理局批準Voretigene neparvovec-rzyl（VN）用于治療RPE65突變相關性視網膜營養不良。VN是第一個針對特定基因突變引起疾病的基因療法。Maguire等[47]對接受VN治療的患者進行隨訪觀察，發現該療法可以改善患者視力并且無不良免疫反應發生，在注射30 d后改善視力的效果達到最佳，目前觀測到該療效可持續4年。
滲出型老年性黃斑變性（AMD）常伴有脈絡膜新生血管（CNV），而VEGF在新生血管形成中起重要作用。可溶性VEGF受體-1（sFlt-1）是一種有效的天然抗VEGF蛋白。Lai等[48]使用AAV轉導和表達sFlt-1，結果顯示該基因在小鼠和猴中持續表達8個月和17個月。Rakoczy等[49]將AAV轉導的sFlt-1應用到人供體眼中，結果顯示滲出型AMD患眼對視網膜下注射AAV-sFlt-1有良好的耐受性，并且單次給藥具有較長的時效性。隨后Heier等[50]構建了AAV-sFlt-1并且注入到受試者玻璃體液中，近一年的追蹤發現并無不良反應，并且出現了視網膜下積液減少等現象。這表明玻璃體內注射AAV-sFlt-1安全性較好，可作為臨床藥物進行治療。另一方面，補體激活在AMD發病機制中起關鍵作用[51]。Schnabolk等[52]通過AAV5介導的基因替代方法，經視網膜下注射向RPE或脈絡膜提供相似水平的補體受體2片段，結果證實CNV減少。AAV介導的基因替代方法的成功應用說明了補體旁路途徑在CNV發展中的重要性及其在AMD治療中的潛在作用。AAV是一種高效的基因治療工具，為研究AMD發病及轉化機制和藥物開發開辟了新的途徑。
RGC凋亡及丟失導致青光眼患者視神經發生損害，造成視力下降。近幾年來，研究者試圖通過基因療法保護RGC功能。Kwong等[53]在小鼠玻璃體腔內注射AAV2-熱休克蛋白70（HSP70），發現成功轉染的細胞中75%為RGC，且上調HSP70的表達對受損的RGC有保護作用。 已有研究證明，病毒載體可能通過形成雙鏈AAV（scAAV）而有效轉導體外培養的人小梁網細胞[54]。隨后Buie等[55]發現，scAAV在大鼠和猴小梁網中提供了長時間的安全轉導。Bogner等[56]發現，與scAAV8相比，scAAV2轉導角膜內皮細胞、纖毛非上皮細胞、虹膜和小梁網更有效，表面暴露的酪氨酸殘基的誘變大大提高了scAAV2在這些組織中的轉導效率。近期Wang等[57]也證實了scAAV可以轉染小鼠小梁網細胞，甚至可以高效的在眼前節進行表達。該載體的穩定表達和安全特性促進了小梁網基因療法的開發。另一方面，O'Callaghan等[58]發現，通過輔助使用滴眼劑進行周期性誘導可以使AAV介導的MMP-3基因表達，并且將蛋白質分泌到房水中，有促使眼壓降低的效果。這為常規降眼壓藥物不敏感的青光眼患者帶來了新的治療方法。
2.4 AAV與CRISPR/Cas9基因編輯
CRISPR/Cas9由于具有特異而高效的編輯靶基因組以及同時靶向多個基因的能力，其與AAV聯合應用可以在體內對基因組進行編輯，在眼科遺傳性疾病的研究中應用廣泛[59]。視網膜色素變性（RP）是常見的致盲性眼病，發病機制為RPE或光感受器細胞基因突變或基因表達紊亂。常規醫療手段幾乎不可治愈，基因治療是近幾年的研究熱門。
RP的基因突變主要影響視桿細胞，在造成這些細胞退化和失去功能之后，還會進一步影響到視錐細胞，導致視力精確度下降。神經視網膜亮氨酸拉鏈（Nrl）是一種視網膜轉錄因子，Nrl與它下游的轉錄因子Nr2e3能促進視桿細胞的分化與形成。Zhu等[60]針對兩種不同的RP小鼠模型中的Nrl或Nr2e3，使用兩個單獨的AAV進行Cas9轉導，Nrl及Nr2e3的表達被成功抑制；部分視桿細胞被重編程為視錐細胞，且維持了視網膜中應有的正常細胞結構；ERG檢測結果進一步表明，小鼠的電生理功能和視力得到了明顯改善。同時，Yu等[61]通過AAV介導Cas9靶向Nrl治療RP，在3種RP小鼠模型中觀察到視桿細胞存活率顯著提高。在臨床治療應用方面，精確的靶向基因組編輯至關重要。Suzuki等[62]設計了一種不依賴同源性的靶向整合（HITI）策略進行CRISPR/Cas9基因編輯，使其在體內實驗中更加精準高效。該研究選取遺傳性RP皇家外科學院（RCS）大鼠模型，該大鼠由于Mertk基因缺陷導致光感受器細胞退化，將構建好的AAV-rMertk-HITI注射入RCS大鼠的視網膜下腔，在注射后4周觀察到實驗組大鼠ERG b波明顯改善。這證實該轉導系統可成功轉染視網膜細胞，并具有一定療效。另一方面，GUCY2D編碼視網膜鳥苷酸環化酶1（retGC1），其發生突變可造成常染色體顯性遺傳性視錐-視桿細胞營養不良。McCullough等[63]使用AAV轉導CRISPR/Cas9在體內編輯小鼠及獼猴的光感受器細胞，敲除retGC1后視網膜結構和功能發生明顯改變。該結果表明，使用AAV-CRISPR/Cas9可以在靈長類動物中進行體細胞基因編輯。
3 展望
病毒載體的出現大大提高了基因治療的應用潛力，具有傳統療法不可比擬的優勢。如今，病毒載體在基因治療方面已經取得很大進展，但是仍然有許多工作要進行，如開展大量的動物實驗進行多方面、較長期的安全檢測；對治療性基因的表達進行恰當的調節，盡量減少病毒殘留序列帶來的風險等。相信隨著技術的進步，以病毒為載體的基因轉導技術將會很快進入臨床應用，解決更多的眼科疑難問題。
隨著對基因治療的深入研究和分子生物學技術的進步，以病毒為載體攜帶功能基因轉導視網膜的基因治療成為目前國內外研究熱點。病毒載體因具有轉導效率高和自動完成復雜的裝配過程等優勢而得到廣泛應用。目前在眼科常用的病毒載體有腺病毒載體（AdV）、慢病毒載體（LV）、腺相關病毒載體（AAV）等。Kalesnykas等[1]曾將AdV、LV、AAV三種病毒載體分別轉染視網膜細胞，發現其在轉染效率、外源基因維持時間、侵染部位及組織親和力等方面存在顯著差異。這提示在研究眼科某種疾病時，可不局限于使用某種特定載體，而應根據疾病的具體需求，有針對性地對所要使用的病毒載體加以選擇，以期達到最佳的治療效果。現就以病毒為載體的基因轉導技術在眼科研究中的應用作一綜述。
1 眼科研究中常用的病毒載體
1.1 AdV
腺病毒是一種線性雙鏈DNA病毒，在自然界分布廣泛。其利用病毒可感染宿主細胞的特點，簡便有效地將目的基因導入靶細胞，并實現其高效表達[2-3]。腺病毒的基因包裝容量較大，可插入的大片段外源基因最多可達35 kb。腺病毒可轉染不同類型的人組織細胞，但其進入細胞內并不整合到宿主細胞基因組，僅瞬間表達，因而具有較高的安全性。目前共有三代AdV，第一代可能誘發宿主體內細胞免疫和體液免疫反應而導致組織損傷，第二代和第三代在容量和安全性方面有所改良[4]。但目前應用最廣泛的仍為第一代AdV。其在眼前節及眼后節均表現出較高的轉導效率[5-9]。
1.2 LV
慢病毒屬逆轉錄病毒科，是一種正鏈RNA病毒。其載體具有高效穩定的轉移效率、低細胞毒性和低免疫應答性。LV是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒為基礎發展起來的基因治療載體。它較AdV的免疫反應小，可重復應用[10]。慢病毒可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，并隨細胞基因組分裂而分裂，從而達到持續穩定表達的目的。在體外實驗及體內實驗的研究中，慢病毒己經成為表達外源基因常用的載體形式之一，并廣泛應用于角膜病、新生血管疾病和青光眼等多種眼科疾病建模及治療[11-14]。
1.3 AAV
腺相關病毒是非致病的微小病毒家族成員，包裹著大約4.7 kb的線性單鏈DNA基因組，其只有依賴輔助病毒才可以增生。目前在人體中發現的AAV血清型有12種，其衣殼蛋白各不相同，并因此導致各種血清型的病毒載體對不同的組織和細胞有不同的轉染效率。作為基因療法載體的重組腺相關病毒攜帶的蛋白衣殼與野生型腺相關病毒幾乎相同，但重組腺相關病毒衣殼內攜帶治療型轉基因，野生型攜帶病毒組基因。一方面可以最大化AAV攜帶轉基因的容量，另一方面減小體內遞送轉基因時產生的免疫原性和細胞毒性。因此，AAV具有免疫原性低、毒性小的特點，并且提供長期的轉基因表達，單次給藥后可以持續長達6年[15]。在過去的十年中，研究者們已逐漸證實，不同血清型來源的AAV可以成功轉染光感受器細胞、RPE細胞、Müller細胞和人角膜上皮細胞等[16-19]。AAV已經成為眼科領域應用最廣泛的病毒載體之一。
1.4 AAV與CRISPR/Cas9基因編輯
由成簇規律間隔的短回文重復序列（CRISPR）/CRISPR相關蛋白9（Cas9）系統改造的第三代人工核酸內切酶可以在短時間內或低水平表達的靶向DNA編輯。其中Cas9 DNA核酸內切酶在基因組中的目標位置產生雙鏈DNA斷裂，激活內源性DNA修復機制[20]。其具有簡單快捷、突變效率高、成本低廉、適用范圍廣等優點，CRISPR/Cas9已經成為體外基因組編輯的最流行系統。在體內實驗中，基因編輯受到Cas9的導入問題的限制，需要借助載體；而AAV由于安全性較高，已被廣泛應用于CRISPR/Cas9系統的遞送[21]。并且，AAV介導的CRISPR/Cas9系統可以在體內成功轉導人視網膜細胞，具有很大的應用前景[22-23]。
2 病毒載體在眼科研究中的應用
2.1 AdV
AdV因其良好的轉染效率和較高的安全性已被廣泛應用在基因治療抑制新生血管的研究中。在氧誘導視網膜病變（OIR）模型研究中，AdV通過轉染S100A4-RNA干擾可降低環磷酸腺苷反應元件結合蛋白的表達，并且通過調節Bcl-2的抗細胞凋亡作用減少OIR視網膜新生血管的發生[24]。另一方面，Li等[25]通過腺病毒介導的siRNA沉默視網膜還原型輔酶Ⅱ氧化酶4的表達，觀察到其可以顯著降低OIR中細胞外調節蛋白激酶的激活，并減少視網膜新生血管的形成。Han和Li[26]發現，Ad-p21在OIR小鼠模型中也有抑制視網膜新生血管的作用。
以腺病毒為載體的基因療法在抑制角膜移植免疫排斥方面取得了一些進展。Wang等[27]使用含IL-10基因的重組AdV體外轉染大鼠骨髓來源的樹突狀細胞（DC），抑制DC的成熟，且IL-10基因修飾的未成熟DC能減少角膜移植排斥反應，促進免疫耐受的形成，從而延長角膜植片的存活時間。Kaufmann等[28]使用AdV介導IL-10細胞因子轉染同種異體角膜移植物，結果表明該方法可以延長大鼠模型中角膜緣同種異體移植物的存活時間。李漢林等[29]在高危角膜新生血管兔的角膜下注射重組AdV介導的血管抑制素，結果顯示實驗組的炎癥反應減輕。這表明重組AdV介導的血管抑制素可抑制角膜新生血管的生成，降低角膜移植手術的風險。在AdV的種類方面，Serratrice等[30]比較了犬腺病毒2型（CAV-2）載體在小鼠和非人靈長類動物體內轉導角膜細胞，以及在狗和人角膜外植體體外轉導的功效，結果提示依賴于輔助病毒的CAV-2可以作為基因治療的有效載體。
2.2 LV
原發性開角型青光眼（POAG）是世界范圍內導致不可逆盲的原因之一。小梁網、Schlemm管、集合管、鞏膜靜脈等房水流出通道發生病變阻礙房水流出是POAG中眼壓升高的主要機制。經LV對小梁網細胞進行的靶向基因治療是近期研究的熱點。Loewen等[31]將兩種LV或另一種逆轉錄病毒載體注入到人類供體眼的房水循環中，結果表明LV可以成功轉染小梁網細胞。這提示LV可以有效對人小梁網細胞進行遺傳修飾。另一方面，Aktas等[32]發現，MG132蛋白酶體抑制劑提高了LV在人小梁網細胞中的轉導效率，可作為LV向小梁網細胞傳遞治療基因的輔助手段。近幾年，研究者發現抑制RGC凋亡可以有效控制青光眼的進展。Sun等[33]通過LV轉染RGC-5s使母系表達基因3（MEG3）過表達或敲除，可上調MEG3，通過促進RGC凋亡參與青光眼的發病過程。Song等[34]向眼內注射Atoh7表達載體PGC-FU-Atoh7-GFP慢病毒和空的PGC-FU-GFP慢病毒，發現Atoh7在青光眼大鼠模型中促進Müller細胞來源的干細胞向RGC分化，使RGC軸突生長缺陷，從而導致信號轉導受阻。針對這一現象，He等[35]通過PGC-FU-Atoh7-GFP慢病毒將miR-124或anti-miR-124轉染到Müller細胞來源的干細胞中，結果顯示LV介導的miR-124具有治療青光眼的潛力。目前青光眼患者需長期用藥，給生理和生活帶來不便。慢病毒可以感染分裂后的細胞，具有持續表達目標基因的能力。Tan等[36]使用LV攜帶C3轉移酶基因轉染猴眼前節，可以達到長期降低眼內壓的效果。這說明LV可以更長效地作用于靶組織，其介導的藥物可以減少患者局部用藥的頻次。LV具有穩定高效的特點，是揭示青光眼發病機制和研發新藥物的有效工具。
白內障囊外摘除手術或晶狀體遭受外傷后，殘留的皮質和脫落在晶狀體后囊上的上皮細胞增生，在瞳孔區形成半透明的膜稱為后發性白內障。Krüppel樣因子6對于晶狀體上皮細胞（LECs）整合轉化的研究表明，LECs的存活、增生和分化作用顯著[37-38]。轉錄因子4和衰老標記蛋白30已被證實可以抑制LECs增生，同時可以減緩細胞增生，延長細胞周期[39-40]。不僅如此，慢病毒介導的小RNA感染可參與新生血管的調控作用[41]。這表明構建LV轉染宿主細胞可作為長期穩定抑制靶基因的有效方法。
2.3 AAV
Leber先天性黑矇（LCA）是一種常染色體隱性遺傳疾病，發病早，常導致嬰幼兒先天性盲。大約6%的LCA患者存在RPE65的突變。RPE65是一種相對分子質量為65×103的膜相關光轉導蛋白，負責將RPE中的全反式視黃酯轉變為11-順式視黃醇。RPE65突變可導致全反式視黃酯堆積和光感受器功能障礙。在具有RPE65突變的Rd12小鼠中，AAV2/5介導的RPE65基因轉導可恢復視桿細胞及光感受器功能，維持視網膜形態穩定達7個月[42]。在RPE65缺陷犬模型中，Acland等[43]證實AAV-RPE65恢復了視錐細胞及視桿細胞的功能并且具有較高的安全性。隨后在針對LCA患者開展的臨床試驗中觀察到，在視網膜下注射不同劑量的AAV均可改善患者視力，并且具有良好的耐受性[44-45]。對初次注射的對側眼進行AAV轉導治療，同樣具有較好的安全性和有效性[46]。基于AAV轉導RPE65的高效性及安全性并經過大量臨床試驗，2017年美國食品與藥物管理局批準Voretigene neparvovec-rzyl（VN）用于治療RPE65突變相關性視網膜營養不良。VN是第一個針對特定基因突變引起疾病的基因療法。Maguire等[47]對接受VN治療的患者進行隨訪觀察，發現該療法可以改善患者視力并且無不良免疫反應發生，在注射30 d后改善視力的效果達到最佳，目前觀測到該療效可持續4年。
滲出型老年性黃斑變性（AMD）常伴有脈絡膜新生血管（CNV），而VEGF在新生血管形成中起重要作用。可溶性VEGF受體-1（sFlt-1）是一種有效的天然抗VEGF蛋白。Lai等[48]使用AAV轉導和表達sFlt-1，結果顯示該基因在小鼠和猴中持續表達8個月和17個月。Rakoczy等[49]將AAV轉導的sFlt-1應用到人供體眼中，結果顯示滲出型AMD患眼對視網膜下注射AAV-sFlt-1有良好的耐受性，并且單次給藥具有較長的時效性。隨后Heier等[50]構建了AAV-sFlt-1并且注入到受試者玻璃體液中，近一年的追蹤發現并無不良反應，并且出現了視網膜下積液減少等現象。這表明玻璃體內注射AAV-sFlt-1安全性較好，可作為臨床藥物進行治療。另一方面，補體激活在AMD發病機制中起關鍵作用[51]。Schnabolk等[52]通過AAV5介導的基因替代方法，經視網膜下注射向RPE或脈絡膜提供相似水平的補體受體2片段，結果證實CNV減少。AAV介導的基因替代方法的成功應用說明了補體旁路途徑在CNV發展中的重要性及其在AMD治療中的潛在作用。AAV是一種高效的基因治療工具，為研究AMD發病及轉化機制和藥物開發開辟了新的途徑。
RGC凋亡及丟失導致青光眼患者視神經發生損害，造成視力下降。近幾年來，研究者試圖通過基因療法保護RGC功能。Kwong等[53]在小鼠玻璃體腔內注射AAV2-熱休克蛋白70（HSP70），發現成功轉染的細胞中75%為RGC，且上調HSP70的表達對受損的RGC有保護作用。 已有研究證明，病毒載體可能通過形成雙鏈AAV（scAAV）而有效轉導體外培養的人小梁網細胞[54]。隨后Buie等[55]發現，scAAV在大鼠和猴小梁網中提供了長時間的安全轉導。Bogner等[56]發現，與scAAV8相比，scAAV2轉導角膜內皮細胞、纖毛非上皮細胞、虹膜和小梁網更有效，表面暴露的酪氨酸殘基的誘變大大提高了scAAV2在這些組織中的轉導效率。近期Wang等[57]也證實了scAAV可以轉染小鼠小梁網細胞，甚至可以高效的在眼前節進行表達。該載體的穩定表達和安全特性促進了小梁網基因療法的開發。另一方面，O'Callaghan等[58]發現，通過輔助使用滴眼劑進行周期性誘導可以使AAV介導的MMP-3基因表達，并且將蛋白質分泌到房水中，有促使眼壓降低的效果。這為常規降眼壓藥物不敏感的青光眼患者帶來了新的治療方法。
2.4 AAV與CRISPR/Cas9基因編輯
CRISPR/Cas9由于具有特異而高效的編輯靶基因組以及同時靶向多個基因的能力，其與AAV聯合應用可以在體內對基因組進行編輯，在眼科遺傳性疾病的研究中應用廣泛[59]。視網膜色素變性（RP）是常見的致盲性眼病，發病機制為RPE或光感受器細胞基因突變或基因表達紊亂。常規醫療手段幾乎不可治愈，基因治療是近幾年的研究熱門。
RP的基因突變主要影響視桿細胞，在造成這些細胞退化和失去功能之后，還會進一步影響到視錐細胞，導致視力精確度下降。神經視網膜亮氨酸拉鏈（Nrl）是一種視網膜轉錄因子，Nrl與它下游的轉錄因子Nr2e3能促進視桿細胞的分化與形成。Zhu等[60]針對兩種不同的RP小鼠模型中的Nrl或Nr2e3，使用兩個單獨的AAV進行Cas9轉導，Nrl及Nr2e3的表達被成功抑制；部分視桿細胞被重編程為視錐細胞，且維持了視網膜中應有的正常細胞結構；ERG檢測結果進一步表明，小鼠的電生理功能和視力得到了明顯改善。同時，Yu等[61]通過AAV介導Cas9靶向Nrl治療RP，在3種RP小鼠模型中觀察到視桿細胞存活率顯著提高。在臨床治療應用方面，精確的靶向基因組編輯至關重要。Suzuki等[62]設計了一種不依賴同源性的靶向整合（HITI）策略進行CRISPR/Cas9基因編輯，使其在體內實驗中更加精準高效。該研究選取遺傳性RP皇家外科學院（RCS）大鼠模型，該大鼠由于Mertk基因缺陷導致光感受器細胞退化，將構建好的AAV-rMertk-HITI注射入RCS大鼠的視網膜下腔，在注射后4周觀察到實驗組大鼠ERG b波明顯改善。這證實該轉導系統可成功轉染視網膜細胞，并具有一定療效。另一方面，GUCY2D編碼視網膜鳥苷酸環化酶1（retGC1），其發生突變可造成常染色體顯性遺傳性視錐-視桿細胞營養不良。McCullough等[63]使用AAV轉導CRISPR/Cas9在體內編輯小鼠及獼猴的光感受器細胞，敲除retGC1后視網膜結構和功能發生明顯改變。該結果表明，使用AAV-CRISPR/Cas9可以在靈長類動物中進行體細胞基因編輯。
3 展望
病毒載體的出現大大提高了基因治療的應用潛力，具有傳統療法不可比擬的優勢。如今，病毒載體在基因治療方面已經取得很大進展，但是仍然有許多工作要進行，如開展大量的動物實驗進行多方面、較長期的安全檢測；對治療性基因的表達進行恰當的調節，盡量減少病毒殘留序列帶來的風險等。相信隨著技術的進步，以病毒為載體的基因轉導技術將會很快進入臨床應用，解決更多的眼科疑難問題。