滲出型老年性黃斑變性（wAMD）是由于脈絡膜新生毛細血管通過破裂的Bruch膜到達RPE層和光感受器細胞層形成脈絡膜新生血管（CNV），繼而導致新生血管出血、滲漏以及瘢痕形成。鑒于VEGF在CNV發生發展過程中具有重要作用，各種眼內抗VEGF藥物靶向治療是目前wAMD治療的一線選擇。但抗VEGF藥物治療wAMD的療效受多種因素影響，仍有部分患者存在治療無應答、藥物耐受、需要長期反復注射以及嚴重副作用等問題。深入探究wAMD發病的生理病理過程，尋找導致CNV形成的最根本原因，從病因出發探尋更優的治療方案是未來研究的方向。
引用本文： 徐惠娟, 楊正林. 抗血管內皮生長因子藥物治療滲出型老年性黃斑變性的局限性研究現狀. 中華眼底病雜志, 2020, 36(2): 156-161. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2020.02.017 復制
老年性黃斑變性（AMD）分為萎縮型和滲出型兩種。萎縮型AMD以地圖樣萎縮為特征；而脈絡膜新生血管（CNV）是滲出型AMD（wAMD）的主要病理表現，也是導致患者中心視力下降的重要原因。針對CNV發生發展過程中具有重要作用的VEGF, 各種眼內抗VEGF藥物靶向治療是目前wAMD治療的一線選擇[1]。但由于VEGF并不是導致CNV的唯一因素，也不是導致wAMD的根本原因，因此并非所有接受抗VEGF藥物治療的患者都能得到良好的治療效果，一部分患者仍然存在治療無應答、藥物耐受、需要長期反復注射以及嚴重副作用等問題[2]。深入了解抗VEGF藥物治療wAMD的局限性并在此基礎上探索未來更優的治療方案具有重要的臨床意義。為此，現就抗VEGF藥物治療wAMD的局限性研究現狀作一綜述。
1 wAMD臨床特點與病理改變
wAMD是由于脈絡膜新生毛細血管通過破裂的Bruch膜到達RPE層和光感受器細胞層形成CNV，繼而導致新生血管出血、滲漏以及瘢痕形成。早期wAMD中心視力可明顯下降，以密集、大小不一的眼底玻璃膜疣形成為主；病變中期以新生血管滲漏和出血為特征，視力急劇下降；晚期滲漏和出血被瘢痕組織替代，也可能同時伴有新的新生血管形成導致出血和滲漏，視力進一步損害[3]。wAMD除了黃斑區萎縮變性，更重要的是存在血管異常增生，新生血管通透性高，引起視網膜出血、水腫，最終導致視網膜神經變性。
2 VEGF-VEGF受體（VEGFR）信號通路
VEGF是發育中參與血管形成的關鍵因子，VEGF單一位點的缺失可以使胚胎在發育的第11、12天死亡[4]。血管再生和血島形成受到影響并導致發育異常。人類VEGF基因定位于染色體6p21.3。在哺乳動物中，VEGF家族由VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和胎盤生長因子（PlGF）共7個因子組成。VEGF基因含有8個外顯子，由于VEGF mRNA的可變剪切，在人類中可產生VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF206等[5]。其中，VEGF165是最常見的亞型，存在于所有表達VEGF基因的細胞中。
在VEGF家族中，以VEGF-A研究最多、最廣，通常簡稱為VEGF。VEGF-B在心臟和骨骼肌中含量最豐富，主要與VEGFR-1和神經纖毛蛋白-1結合。VEGF-C和VEGF-D是兩種密切相關的細胞因子，并且它們與淋巴管生成有關。兩者均與VEGFR-3結合，幾乎不結合VEGFR-2。Jeltsch等[6]通過雞胚尿囊膜模型實驗研究發現，VEGF-C可以促進淋巴管內皮細胞增生和血管形成。VEGF-C通常又稱為VEGF-2。VEGF-E是羊痘瘡病毒基因組中的一種蛋白產物。被羊痘瘡感染的部位顯示出廣泛的血管增生特征。Ogawa等[7]通過體外實驗證實，VEGF-E結合VEGFR-2，誘導內皮細胞分裂增生，增加血管通透性。
VEGF的生物學效應需要結合其相應的受體實現。VEGFR主要是兩種酪氨酸激酶受體，即VEGFR-1和VEGFR-2。VEGFR是糖基化蛋白，其包含由7個類似環狀結構的免疫球蛋白組成的胞外域、簡單的跨膜部分以及分裂的酪氨酸激酶胞內域。VEGFR-1是一個被截斷的受體，缺失了跨膜部分、酪氨酸激酶域和第7個免疫球蛋白環。其以較高的親和力與VEGF結合，與VEGFR-2形成復合物，形成失活部分，這一效應可以用于抑制VEGF的促分裂效應。然而，VEGF與VEGFR-2的結合可以有效誘導信號轉導，啟動血管新生。在敲除VEGFR-1的純合小鼠中，可以觀察到內皮細胞過度增生，血管通路形成缺失，導致胚胎致死；但如果僅敲除VEGFR-1胞內域酪氨酸激酶部分，小鼠可以正常出生，并且血管發育正常[8]。這說明VEGFR-1可以作為VEGF的誘餌受體[9]。VEGFR-2的基因敲除小鼠在卵黃囊血島形成異常，造血干細胞生成障礙，引起胚胎致死[10]。因此，VEGFR-2在血管生成、造血干細胞發育和新生血管上也發揮著關鍵作用。
3 治療wAMD的抗VEGF藥物
針對阻斷VEGF的不同環節，研究者們設計了不同的藥物阻斷其生物學作用，從而達到抑制新生血管形成的目的。目前使用較多的抗VEGF藥物大致分為阻斷VEGF與血管內皮細胞表面受體VEGFR結合的藥物（如抗VEGF適配體、抗VEGF單克隆抗體、抗體片段）、阻斷VEGF與VEGFR結合后細胞信號轉導下游重要激酶的藥物以及抑制VEGF基因表達的藥物等。
哌加他尼鈉（Pegaptanib，商品名Macugen）為全球首個用于治療wAMD的抗VEGF藥物，是一類小RNA寡聚核苷酸。其具有獨特的三維空間結構，對特定靶向分子有極高的親和力。哌加他尼鈉僅與VEGF的一個異構體VEGF165結合，從而達到抑制血管通透性和新生血管形成的目的。其于2004年獲得美國食品與藥品管理局（FDA）批準用于治療wAMD[11]。為期1年的VISION研究報告了哌加他尼鈉在治療wAMD方面有顯著療效，但同時存在眼內炎（1.3%）、飛蚊癥（33.0%）、玻璃體混濁（18.0%）及前房炎癥反應（14.0%）等明顯副作用，且其療效不如雷珠單抗（ranibizumab，商品名Lucentis）[12]。因此該藥現在已很少用于臨床治療wAMD。
貝伐單抗（bevacizumab, 商品名Avastin）和雷珠單抗是使用最多、應用最廣的兩種治療wAMD的單克隆抗體，兩者都可以與VEGF-A所有異構體結合，從而抑制VEGF的活性。貝伐單抗是VEGF的人源化全長單克隆抗體，最早開發用于治療乳腺癌、肝癌等腫瘤治療，但是后來英國IVAN與美國CATT臨床試驗研究證明了其在眼底疾病治療中的有效性和安全性，因此也被應用于玻璃體腔注射治療wAMD等眼科疾病[13-14]。CATT研究證明，貝伐單抗的療效并不亞于雷珠單抗，且兩者在嚴重系統反應、死亡率和眼部副作用方面沒有明顯差異[14]。雷珠單抗是第二代人源化抗VEGF重組鼠單克隆抗體片段。為期2年的MARINA和為期1年的多中心雙盲ANCHOR 3期臨床試驗證實，雷珠單抗對經典的CNV治療有效，患者視力顯著提高[15-16]。因此，2006年FDA批準了雷珠單抗的使用。后來為期7年的后續跟蹤研究發現，跟基線視力相比，大約1/2的患眼視力趨于穩定，但有1/3的患眼視力下降15個字母及以上；并且，98%的患眼已經出現黃斑萎縮和光感受器細胞受損[17]。長期注射雷珠單抗0.5 mg治療wAMD，6.7%的患者會產生眼內壓增高的副作用。從長期治療效果看來，雷珠單抗的療效并不讓人十分滿意。其在人眼內的半衰期為4.25 d，不良反應主要有眼內炎、葡萄膜炎、眼部血管栓塞和視網膜脫離等。
VEGF誘餌受體是一類能與VEGF結合的蛋白，目前研發中的VEGF誘餌受體有VEGF Trap-Eye和KH-902。VEGF Trap-Eye是VEGFR1和VEGFR2關鍵結合位點的融合蛋白并且連接人Ig和Fc片段，其與阿柏西普（Aflibercept, 商品名Eylea）具有相同的分子結構。阿柏西普除了靶向VEGF-A外，還可以靶向結合VEGF-B和PlGF。藥代動力學研究表明，與貝伐單抗和雷珠單抗相比，阿柏西普與VEGF-A結合的親和力更高，半衰期更長。因此臨床上當使用雷珠單抗與貝伐單抗療效不佳時改用阿柏西普更有治療優勢。美國與加拿大的一項3期臨床試驗研究表明，在治療wAMD方面，阿柏西普不亞于雷珠單抗[18]。一項多中心臨床研究表明，在接受阿柏西普治療52周后視力改善的患者數量較接受治療96周后更多；并且在后續治療的52～96周，接受阿伯西普治療比雷珠單抗所需注射次數更少[19]。后來為期2年的跟蹤研究發現，阿柏西普治療后出現嚴重的不良反應病例數較雷珠單抗更少[19-20]。阿柏西普在人眼內的半衰期為7.13 d，比雷珠單抗更長。這或許說明阿柏西普在治療wAMD方面更有前景。阿柏西普的不良反應主要是眼內炎和眼壓升高。
康柏西普（Conbercept, KH-902，商品名Lumitin）是一種與阿柏西普相似的融合蛋白，包含VEGFR1的第2個Ig結構域，VEGFR2的第3、4個Ig結構域以及人IgG1的Fc片段[21]。其能結合所有VEGF-A亞型、VEGF-B和PlGF。與阿柏西普相比，康柏西普半衰期更長，生物活性更高。有研究表明，康柏西普的療效優于阿柏西普，且對息肉樣脈絡膜血管病變（PCV）有效[22]。2013年被批準用于臨床治療wAMD。常見副作用是注射部位出血、結膜充血和眼內壓升高，無嚴重的系統性不良反應。目前康柏西普已經通過1期（Phase 1）、2期（AURORA）和3期（PHOENIX）臨床試驗，其中3期臨床試驗是在中國9個地區總共114例患者中開展的1年跟蹤研究，治療方案為按照0.5 mg/次的治療劑量，前3個月每月注射1次，之后每3個月注射1次[22-24]。3期臨床試驗結果表明，在最初3個月治療后，視力平均提高9.20個字母，12個月治療期后平均提高9.98個字母[22]。目前所有已開展的臨床試驗均表明康柏西普在治療wAMD方面療效較好，具有良好的耐受性，且無嚴重副反應。但由于其較其他抗VEGF藥物的臨床試驗參與人數偏少，因此還需要更多的安全性和有效性驗證以及5年以上長期的跟蹤數據。
酪氨酸激酶是VEGF與其受體結合后細胞信號轉導下游的重要激酶，阻斷其活性可以阻止VEGF的生理活性。目前針對酪氨酸激酶的抑制劑有瓦他拉尼堿、帕唑帕尼、凡德他尼等。Vorolanib （CM082，X-82）是一種多靶點的酪氨酸酶抑制劑，可以通過抑制VEGF、血小板衍生生長因子（PDGF）、C-kit及Flt3酪氨酸激酶受體，從而抑制新生血管形成。Vorolanib是被開發應用于治療wAMD以及實體腫瘤的口服藥品[25]。2016年危清泉等[26]報道口服X-82對大鼠CNV有抑制作用。目前該藥已在美國開展1期臨床試驗（共納入35例患者），其中29%的患者因為副作用沒有完成試驗，15例患者在未使用任何抗VEGF藥物的情況下于治療24周后視力提高了5.3個字母[27]。該結果證明了其安全性和初期療效，但預期效果不如其他抗VEGF注射藥物。主要不良反應有腹瀉、惡心、轉氨酶升高、疲乏、干眼癥、瞼板腺功能障礙、視網膜瘢痕和玻璃體漂浮物等。該1期臨床試驗推薦最佳劑量每天200 mg，此劑量沒有明顯不良反應且在無抗VEGF藥物治療情況下能獲得較好視力和OCT反應。考慮到X-82半衰期較短（小于9 h），每天2次100 mg可能更適合。目前有更多受試者（157例）參與的2期臨床試驗（NCT02348359）已經開展。
此外，還有針對VEGF基因或使其表達量減少或修飾表達后的VEGF，使其成為活性物質，如用于治療wAMD的小分子干擾RNA。貝伐西尼的安全性和療效尚可，但對已經存在的VEGF無效[28]。PTC299是針對轉錄水平設計的一種藥物，可對VEGF mRNA非翻譯區進行修飾，造成翻譯失敗，阻斷VEGF所有異構體的生成[29]。
4 抗VEGF藥物治療wAMD的局限性與治療耐受
CNV的形成是多種因子參與，多種因素作用的結果。盡管VEGF是參與新生血管形成的關鍵因子，但并不是唯一因素；所以，抗VEGF藥物治療并不能從病因角度對CNV進行有效控制，不能阻止CNV的病灶發生瘢痕纖維化。這導致部分患者經抗VEGF藥物治療后出現治療抵抗，或者多次注射后不應答或無效的情況。并且，由于出現抗VEGF藥物治療抵抗后的眼底持續滲出，需要更多頻率的注射次數[30]。
近年來，有多篇文獻報道了抗VEGF藥物治療出現無應答或者快速抗藥反應等情況。Keane等[31]于2008年首次報道了雷珠單抗治療后出現快速抗藥反應。其他研究者也相繼發現早在僅兩次注射治療后就產生快速抗藥反應，且增加劑量依然無效[32-33]。在2012年也有學者報道，在976例接受雷珠單抗治療的患者中，有2%的患者出現了快速抗藥反應[34]。盡管雷珠單抗被證明治療經典CNV型wAMD和PCV有效，但是在長期跟蹤研究中也發現長期治療后出現嚴重的視網膜脫離、視網膜水腫和地圖樣萎縮等問題。Rofagha等[17]開展的多中心隊列研究以評估雷珠單抗治療wAMD后7～8年的長期療效，隨訪期間1/3的患者取得良好視力效果；而1/3的患者療效很差，視力下降至少15個字母。這表明有較大部分wAMD患者經治療后視力提高但未能長期維持，或者治療后視力不提高甚至下降。最近美國的一項研究發現，63例接受雷珠單抗或者阿柏西普治療后出現無應答或治療耐受的wAMD患者中，22.2%的患者出現治療后無應答，其中12.7%的患者出現快速抗藥反應，而且此現象在使用阿柏西普后更常見[35]。而嚴重的RPE脫離、基礎視力、OCT情況均與治療后產生無應答相關。2018年10月在第72屆日本臨床眼科會議上也報道一項回顧性研究，該研究納入313例跟蹤12個月以上的wAMD患者，8.9%患者出現快速抗藥反應（快速抗藥反應定義為1個月或兩次以上重復每月注射阿柏西普，無任何改善甚至惡化，并且滲出仍然存在），并且隱匿性不典型的wAMD和PCV更容易出現治療無應答和治療耐受[36]。該報道還指出，使用阿柏西普出現快速抗藥反應注射次數為（10.5±7.8）次，平均間隔時間為（20.9 ±14.0）個月[36]。這提示長期多次注射阿柏西普更容易出現治療無應答或治療抵抗。此外，2019年加拿大ARVO眼科會議上一項為期2年的跟蹤研究也發現，高頻、高劑量的阿柏西普治療wAMD后出現治療抵抗的問題[37]。一項長達96周的跟蹤研究表明，wAMD患者在接受阿柏西普治療96周時的視力改善情況（6.6～7.9個字母）不如52周時的視力改善情況（8.3～9.3個字母）[19]。這說明從長期治療結果看來，抗VEGF藥物治療wAMD的療效沒有短期作用明顯，容易復發和產生無應答情況且需要反復治療，增加副作用風險。目前對康柏西普快速耐藥反應的報道較少，這可能與該藥上市時間較短，缺少長期觀察研究且使用范圍比較局限（目前僅在中國臨床使用較多）有關。
對于酪氨酸抑制劑，目前臨床試驗表明其存在一些明顯不良反應，如腹瀉、惡心、視網膜瘢痕等，且治療效果不如其他抗VEGF藥物。由于處于新藥開發階段，臨床試驗受試者不足，還需要后續研究驗證。但是相比于其他抗VEGF藥物，該藥是口服制劑，可避免玻璃體腔注射引起的眼內炎、視網膜出血等問題，具有一定的應用前景，未來可以考慮聯合用藥的相關研究。
抗VEGF藥物治療除了存在療效不佳的問題外，還可能會引起嚴重的眼內炎等其他副作用，進而引起嚴重的視力喪失[38]。Nuzzi和Tridico[39]針對玻璃體腔注射抗VEGF藥物治療眼科相關疾病后發生不良反應的5年跟蹤研究表明，1173只患眼中，部分患眼（12.86%貝伐單抗、15.97%雷珠單抗、20.69%哌加他尼鈉）出現了持續眼內壓升高、感染性葡萄膜炎、視網膜脫離、視網膜下出血等眼部并發癥以及頭暈惡心、胸痛伴急性視力喪失和急性高血壓等系統性并發癥。
患者在使用抗VEGF藥物治療期間，對藥物的敏感性會隨著治療時間的延長和藥物注射的次數增多而下降，主要表現為療效變差或者藥物維持作用時間縮短。有研究發現，影響抗VEGF藥物療效的因素包括患者個體的基因表型、基線特征、CNV病灶特征、黃斑區視網膜與玻璃體交界面異常等[40]。關于耐藥反應產生的機制目前還不明確，但我們分析可能與以下幾個方面有關。（1）VEGF與其他細胞因子、生長因子的功能冗余。（2）替代性促血管發生途徑的增強和PDGF、肝細胞生長因子（HGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）、TNFα、IL-1、IL-6、IL-8和血管生成素等促進免疫反應的因子增強，這兩種原因導致的wAMD可不依賴于VEGF。針對這種難治性wAMD應該考慮調整VEGF抗體劑量以及聯合使用其他因子抑制劑。研究表明，接受聯合使用雷珠單抗和PDGF拮抗劑治療者較單獨雷珠單抗治療者視力預后更好[41]。（3）VEGF抗體的使用可致血漿中VEGF補償性增高。（4）機體免疫系統針對抗VEGF藥物產生中和抗體也是抗VEGF藥物快速脫敏的機制之一。（5）補體系統的持續激活和炎癥應答。在wAMD的發病機制中，除了血管新生，補體系統的激活和炎癥反應同樣存在。抗VEGF藥物治療只能阻斷VEGF誘導形成的新生血管，而補體系統的持續激活和炎癥反應對抗VEGF藥物不敏感。因此，由于wAMD復雜的病理機制，需要制定聯合運用多靶點的治療方案。（6）與患者遺傳因素有關。wAMD患者接受雷珠單抗的治療效果與患者具體的補體因子H（CFH）基因型有關。Lee等[42]發現，攜帶CFH Y402H純合子基因型的患者需要額外的雷珠單抗治療的可能性更高。（7）快速抗藥反應。
針對出現抗VEGF藥物治療抵抗或者無應答的情況，有多項研究嘗試增加注射頻率、增加注射次數、更換抗VEGF藥物以及聯合光動力療法等手段來改善治療效果。這些方法或許能在短時間內改善視力，但長期來看，患者視力仍然會回到基線水平甚至下降。由于這部分患者為維持視力不得不接受更頻繁的抗VEGF藥物注射，也因此可能加快地圖樣萎縮的進程[30]。在英國開展的一項多中心研究中，11 000余例wAMD患者共接受93 000次抗VEGF藥物注射，2年治療期間，患者視力提高到56個字母（基線水平是55個字母）；3年后平均視力下降到53個字母[43]。該結果說明，對于這部分患者而言，抗VEGF藥物治療的長期效果不容樂觀。
5 未來治療手段展望
5.1 VEGF基因編輯與干細胞治療
雖然目前的抗VEGF藥物可以靶向作用于RPE細胞，但卻不能實現長久治愈的效果。由于RPE細胞會持續過量地表達VEGF，患者需要定期注射藥物來維持正常的VEGF水平。隨著成簇規律間隔的短回文重復序列及其相關蛋白9（CRISPR/CAS9）第三代基因編輯技術的研究深入，研究者已經將基因編輯技術用于臨床治療領域，并取得令人滿意的效果[44]。現已有研究成功地將CRISPR/Cas9復合物注射到wAMD模型小鼠眼中，對VEGF基因進行局部修飾；該研究發現運送預組裝的CRISPR/Cas9復合物要比利用質粒運送相同的組分更加高效，且這種復合物在注射僅72 h后就會消失；其通過評估這些小鼠的整個基因組，發現這種CRISPR/Cas9復合物不僅修飾VEGF基因，而且不影響其他基因；并且，小鼠的CNV區域下降了58%[44]。這說明，通過對VEGF基因進行編輯，能夠實現更為長期的治愈。Huang等[45]利用腺相關病毒介導的CRISPR/Cas9靶向修飾VEGFR2基因，在小鼠模型中表現其治療新生血管疾病的潛能。
針對進展型地圖樣萎縮的AMD患者，干細胞治療也為這類患者帶來了希望，其有望更新和恢復已死亡或受損的光感受器細胞[46]。盡管基因和干細胞治療為難治性AMD帶來了曙光，但是毫無疑問，這些新興治療方式也會帶來更大的經濟負擔。
5.2 靶向其他新生血管相關通路
由于近年來抗VEGF藥物治療新生血管疾病出現了耐藥和延遲應答的現象，研究者們開始尋找其他可能導致新生血管的信號和相關因子，通過多種途徑深入探討治療新生血管的更有效方式。DLL4-Notch信號轉導通路能促進血管成熟，抑制新生血管分支形成，抑制血管過度增生。DLL4信號通路調節VEGF下游通路，抑制血管發出新的分支，抑制新生血管形成。研究證實，抑制DLL4能促進無功能新血管的生成，增加新生血管的數量，然而這些新生的血管輸送血氧能力較弱[47]。因此這種方法可以用于治療腫瘤新生血管，使腫瘤內供血供氧不足，生長受到抑制。對于抗VEGF-A治療耐受的腫瘤可以使用新靶點抗DLL4治療。而在視網膜新生血管中也有研究證實，DLL4可以抑制新生血管的發生[48]。現有研究已證實，Notch信號通路參與CNV生成[49]。Dou等[50]采用敲除Notch信號通路的關鍵分子RBP-J的條件性基因小鼠建立激光誘導的CNV模型并應用FFA和組織學分析發現，Notch信號的缺失使血管內皮細胞上VEGFR2表達上調，而VEGFR1表達下降，同時CNV程度加重。研究發現，內皮細胞中DLL4-Notch信號通路激活會導致VEGFR1表達量上調，使VEGFR2與VEGF的結合相對減少，VEGF信號通路作用減弱，新生血管形成減少[51]。Notch信號通路可能是通過對VEGFR的調控把血管內皮細胞對VEGF的反應控制在一個合適的程度，使新生血管的生長發育受到控制。
5.3 遺傳和環境
AMD的發病與遺傳因素密切相關。HTRA1、CFH基因是AMD的主效基因，與wAMD的CNV和PCV均相關；FGD6基因是PCV的特異性位點[52-54]。環境因素氧化低密度脂蛋白（oxLDL）可以與CFH、FGD6相互作用調節氧化應激、炎癥和異常血管新生[55]。因此，從AMD的主效基因HTRA1、CFH、FGD6和環境因素oxLDL等角度探尋治療wAMD的根本措施，實現個性化治療也許是未來可以努力的方向。
老年性黃斑變性（AMD）分為萎縮型和滲出型兩種。萎縮型AMD以地圖樣萎縮為特征；而脈絡膜新生血管（CNV）是滲出型AMD（wAMD）的主要病理表現，也是導致患者中心視力下降的重要原因。針對CNV發生發展過程中具有重要作用的VEGF, 各種眼內抗VEGF藥物靶向治療是目前wAMD治療的一線選擇[1]。但由于VEGF并不是導致CNV的唯一因素，也不是導致wAMD的根本原因，因此并非所有接受抗VEGF藥物治療的患者都能得到良好的治療效果，一部分患者仍然存在治療無應答、藥物耐受、需要長期反復注射以及嚴重副作用等問題[2]。深入了解抗VEGF藥物治療wAMD的局限性并在此基礎上探索未來更優的治療方案具有重要的臨床意義。為此，現就抗VEGF藥物治療wAMD的局限性研究現狀作一綜述。
1 wAMD臨床特點與病理改變
wAMD是由于脈絡膜新生毛細血管通過破裂的Bruch膜到達RPE層和光感受器細胞層形成CNV，繼而導致新生血管出血、滲漏以及瘢痕形成。早期wAMD中心視力可明顯下降，以密集、大小不一的眼底玻璃膜疣形成為主；病變中期以新生血管滲漏和出血為特征，視力急劇下降；晚期滲漏和出血被瘢痕組織替代，也可能同時伴有新的新生血管形成導致出血和滲漏，視力進一步損害[3]。wAMD除了黃斑區萎縮變性，更重要的是存在血管異常增生，新生血管通透性高，引起視網膜出血、水腫，最終導致視網膜神經變性。
2 VEGF-VEGF受體（VEGFR）信號通路
VEGF是發育中參與血管形成的關鍵因子，VEGF單一位點的缺失可以使胚胎在發育的第11、12天死亡[4]。血管再生和血島形成受到影響并導致發育異常。人類VEGF基因定位于染色體6p21.3。在哺乳動物中，VEGF家族由VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和胎盤生長因子（PlGF）共7個因子組成。VEGF基因含有8個外顯子，由于VEGF mRNA的可變剪切，在人類中可產生VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF206等[5]。其中，VEGF165是最常見的亞型，存在于所有表達VEGF基因的細胞中。
在VEGF家族中，以VEGF-A研究最多、最廣，通常簡稱為VEGF。VEGF-B在心臟和骨骼肌中含量最豐富，主要與VEGFR-1和神經纖毛蛋白-1結合。VEGF-C和VEGF-D是兩種密切相關的細胞因子，并且它們與淋巴管生成有關。兩者均與VEGFR-3結合，幾乎不結合VEGFR-2。Jeltsch等[6]通過雞胚尿囊膜模型實驗研究發現，VEGF-C可以促進淋巴管內皮細胞增生和血管形成。VEGF-C通常又稱為VEGF-2。VEGF-E是羊痘瘡病毒基因組中的一種蛋白產物。被羊痘瘡感染的部位顯示出廣泛的血管增生特征。Ogawa等[7]通過體外實驗證實，VEGF-E結合VEGFR-2，誘導內皮細胞分裂增生，增加血管通透性。
VEGF的生物學效應需要結合其相應的受體實現。VEGFR主要是兩種酪氨酸激酶受體，即VEGFR-1和VEGFR-2。VEGFR是糖基化蛋白，其包含由7個類似環狀結構的免疫球蛋白組成的胞外域、簡單的跨膜部分以及分裂的酪氨酸激酶胞內域。VEGFR-1是一個被截斷的受體，缺失了跨膜部分、酪氨酸激酶域和第7個免疫球蛋白環。其以較高的親和力與VEGF結合，與VEGFR-2形成復合物，形成失活部分，這一效應可以用于抑制VEGF的促分裂效應。然而，VEGF與VEGFR-2的結合可以有效誘導信號轉導，啟動血管新生。在敲除VEGFR-1的純合小鼠中，可以觀察到內皮細胞過度增生，血管通路形成缺失，導致胚胎致死；但如果僅敲除VEGFR-1胞內域酪氨酸激酶部分，小鼠可以正常出生，并且血管發育正常[8]。這說明VEGFR-1可以作為VEGF的誘餌受體[9]。VEGFR-2的基因敲除小鼠在卵黃囊血島形成異常，造血干細胞生成障礙，引起胚胎致死[10]。因此，VEGFR-2在血管生成、造血干細胞發育和新生血管上也發揮著關鍵作用。
3 治療wAMD的抗VEGF藥物
針對阻斷VEGF的不同環節，研究者們設計了不同的藥物阻斷其生物學作用，從而達到抑制新生血管形成的目的。目前使用較多的抗VEGF藥物大致分為阻斷VEGF與血管內皮細胞表面受體VEGFR結合的藥物（如抗VEGF適配體、抗VEGF單克隆抗體、抗體片段）、阻斷VEGF與VEGFR結合后細胞信號轉導下游重要激酶的藥物以及抑制VEGF基因表達的藥物等。
哌加他尼鈉（Pegaptanib，商品名Macugen）為全球首個用于治療wAMD的抗VEGF藥物，是一類小RNA寡聚核苷酸。其具有獨特的三維空間結構，對特定靶向分子有極高的親和力。哌加他尼鈉僅與VEGF的一個異構體VEGF165結合，從而達到抑制血管通透性和新生血管形成的目的。其于2004年獲得美國食品與藥品管理局（FDA）批準用于治療wAMD[11]。為期1年的VISION研究報告了哌加他尼鈉在治療wAMD方面有顯著療效，但同時存在眼內炎（1.3%）、飛蚊癥（33.0%）、玻璃體混濁（18.0%）及前房炎癥反應（14.0%）等明顯副作用，且其療效不如雷珠單抗（ranibizumab，商品名Lucentis）[12]。因此該藥現在已很少用于臨床治療wAMD。
貝伐單抗（bevacizumab, 商品名Avastin）和雷珠單抗是使用最多、應用最廣的兩種治療wAMD的單克隆抗體，兩者都可以與VEGF-A所有異構體結合，從而抑制VEGF的活性。貝伐單抗是VEGF的人源化全長單克隆抗體，最早開發用于治療乳腺癌、肝癌等腫瘤治療，但是后來英國IVAN與美國CATT臨床試驗研究證明了其在眼底疾病治療中的有效性和安全性，因此也被應用于玻璃體腔注射治療wAMD等眼科疾病[13-14]。CATT研究證明，貝伐單抗的療效并不亞于雷珠單抗，且兩者在嚴重系統反應、死亡率和眼部副作用方面沒有明顯差異[14]。雷珠單抗是第二代人源化抗VEGF重組鼠單克隆抗體片段。為期2年的MARINA和為期1年的多中心雙盲ANCHOR 3期臨床試驗證實，雷珠單抗對經典的CNV治療有效，患者視力顯著提高[15-16]。因此，2006年FDA批準了雷珠單抗的使用。后來為期7年的后續跟蹤研究發現，跟基線視力相比，大約1/2的患眼視力趨于穩定，但有1/3的患眼視力下降15個字母及以上；并且，98%的患眼已經出現黃斑萎縮和光感受器細胞受損[17]。長期注射雷珠單抗0.5 mg治療wAMD，6.7%的患者會產生眼內壓增高的副作用。從長期治療效果看來，雷珠單抗的療效并不讓人十分滿意。其在人眼內的半衰期為4.25 d，不良反應主要有眼內炎、葡萄膜炎、眼部血管栓塞和視網膜脫離等。
VEGF誘餌受體是一類能與VEGF結合的蛋白，目前研發中的VEGF誘餌受體有VEGF Trap-Eye和KH-902。VEGF Trap-Eye是VEGFR1和VEGFR2關鍵結合位點的融合蛋白并且連接人Ig和Fc片段，其與阿柏西普（Aflibercept, 商品名Eylea）具有相同的分子結構。阿柏西普除了靶向VEGF-A外，還可以靶向結合VEGF-B和PlGF。藥代動力學研究表明，與貝伐單抗和雷珠單抗相比，阿柏西普與VEGF-A結合的親和力更高，半衰期更長。因此臨床上當使用雷珠單抗與貝伐單抗療效不佳時改用阿柏西普更有治療優勢。美國與加拿大的一項3期臨床試驗研究表明，在治療wAMD方面，阿柏西普不亞于雷珠單抗[18]。一項多中心臨床研究表明，在接受阿柏西普治療52周后視力改善的患者數量較接受治療96周后更多；并且在后續治療的52～96周，接受阿伯西普治療比雷珠單抗所需注射次數更少[19]。后來為期2年的跟蹤研究發現，阿柏西普治療后出現嚴重的不良反應病例數較雷珠單抗更少[19-20]。阿柏西普在人眼內的半衰期為7.13 d，比雷珠單抗更長。這或許說明阿柏西普在治療wAMD方面更有前景。阿柏西普的不良反應主要是眼內炎和眼壓升高。
康柏西普（Conbercept, KH-902，商品名Lumitin）是一種與阿柏西普相似的融合蛋白，包含VEGFR1的第2個Ig結構域，VEGFR2的第3、4個Ig結構域以及人IgG1的Fc片段[21]。其能結合所有VEGF-A亞型、VEGF-B和PlGF。與阿柏西普相比，康柏西普半衰期更長，生物活性更高。有研究表明，康柏西普的療效優于阿柏西普，且對息肉樣脈絡膜血管病變（PCV）有效[22]。2013年被批準用于臨床治療wAMD。常見副作用是注射部位出血、結膜充血和眼內壓升高，無嚴重的系統性不良反應。目前康柏西普已經通過1期（Phase 1）、2期（AURORA）和3期（PHOENIX）臨床試驗，其中3期臨床試驗是在中國9個地區總共114例患者中開展的1年跟蹤研究，治療方案為按照0.5 mg/次的治療劑量，前3個月每月注射1次，之后每3個月注射1次[22-24]。3期臨床試驗結果表明，在最初3個月治療后，視力平均提高9.20個字母，12個月治療期后平均提高9.98個字母[22]。目前所有已開展的臨床試驗均表明康柏西普在治療wAMD方面療效較好，具有良好的耐受性，且無嚴重副反應。但由于其較其他抗VEGF藥物的臨床試驗參與人數偏少，因此還需要更多的安全性和有效性驗證以及5年以上長期的跟蹤數據。
酪氨酸激酶是VEGF與其受體結合后細胞信號轉導下游的重要激酶，阻斷其活性可以阻止VEGF的生理活性。目前針對酪氨酸激酶的抑制劑有瓦他拉尼堿、帕唑帕尼、凡德他尼等。Vorolanib （CM082，X-82）是一種多靶點的酪氨酸酶抑制劑，可以通過抑制VEGF、血小板衍生生長因子（PDGF）、C-kit及Flt3酪氨酸激酶受體，從而抑制新生血管形成。Vorolanib是被開發應用于治療wAMD以及實體腫瘤的口服藥品[25]。2016年危清泉等[26]報道口服X-82對大鼠CNV有抑制作用。目前該藥已在美國開展1期臨床試驗（共納入35例患者），其中29%的患者因為副作用沒有完成試驗，15例患者在未使用任何抗VEGF藥物的情況下于治療24周后視力提高了5.3個字母[27]。該結果證明了其安全性和初期療效，但預期效果不如其他抗VEGF注射藥物。主要不良反應有腹瀉、惡心、轉氨酶升高、疲乏、干眼癥、瞼板腺功能障礙、視網膜瘢痕和玻璃體漂浮物等。該1期臨床試驗推薦最佳劑量每天200 mg，此劑量沒有明顯不良反應且在無抗VEGF藥物治療情況下能獲得較好視力和OCT反應。考慮到X-82半衰期較短（小于9 h），每天2次100 mg可能更適合。目前有更多受試者（157例）參與的2期臨床試驗（NCT02348359）已經開展。
此外，還有針對VEGF基因或使其表達量減少或修飾表達后的VEGF，使其成為活性物質，如用于治療wAMD的小分子干擾RNA。貝伐西尼的安全性和療效尚可，但對已經存在的VEGF無效[28]。PTC299是針對轉錄水平設計的一種藥物，可對VEGF mRNA非翻譯區進行修飾，造成翻譯失敗，阻斷VEGF所有異構體的生成[29]。
4 抗VEGF藥物治療wAMD的局限性與治療耐受
CNV的形成是多種因子參與，多種因素作用的結果。盡管VEGF是參與新生血管形成的關鍵因子，但并不是唯一因素；所以，抗VEGF藥物治療并不能從病因角度對CNV進行有效控制，不能阻止CNV的病灶發生瘢痕纖維化。這導致部分患者經抗VEGF藥物治療后出現治療抵抗，或者多次注射后不應答或無效的情況。并且，由于出現抗VEGF藥物治療抵抗后的眼底持續滲出，需要更多頻率的注射次數[30]。
近年來，有多篇文獻報道了抗VEGF藥物治療出現無應答或者快速抗藥反應等情況。Keane等[31]于2008年首次報道了雷珠單抗治療后出現快速抗藥反應。其他研究者也相繼發現早在僅兩次注射治療后就產生快速抗藥反應，且增加劑量依然無效[32-33]。在2012年也有學者報道，在976例接受雷珠單抗治療的患者中，有2%的患者出現了快速抗藥反應[34]。盡管雷珠單抗被證明治療經典CNV型wAMD和PCV有效，但是在長期跟蹤研究中也發現長期治療后出現嚴重的視網膜脫離、視網膜水腫和地圖樣萎縮等問題。Rofagha等[17]開展的多中心隊列研究以評估雷珠單抗治療wAMD后7～8年的長期療效，隨訪期間1/3的患者取得良好視力效果；而1/3的患者療效很差，視力下降至少15個字母。這表明有較大部分wAMD患者經治療后視力提高但未能長期維持，或者治療后視力不提高甚至下降。最近美國的一項研究發現，63例接受雷珠單抗或者阿柏西普治療后出現無應答或治療耐受的wAMD患者中，22.2%的患者出現治療后無應答，其中12.7%的患者出現快速抗藥反應，而且此現象在使用阿柏西普后更常見[35]。而嚴重的RPE脫離、基礎視力、OCT情況均與治療后產生無應答相關。2018年10月在第72屆日本臨床眼科會議上也報道一項回顧性研究，該研究納入313例跟蹤12個月以上的wAMD患者，8.9%患者出現快速抗藥反應（快速抗藥反應定義為1個月或兩次以上重復每月注射阿柏西普，無任何改善甚至惡化，并且滲出仍然存在），并且隱匿性不典型的wAMD和PCV更容易出現治療無應答和治療耐受[36]。該報道還指出，使用阿柏西普出現快速抗藥反應注射次數為（10.5±7.8）次，平均間隔時間為（20.9 ±14.0）個月[36]。這提示長期多次注射阿柏西普更容易出現治療無應答或治療抵抗。此外，2019年加拿大ARVO眼科會議上一項為期2年的跟蹤研究也發現，高頻、高劑量的阿柏西普治療wAMD后出現治療抵抗的問題[37]。一項長達96周的跟蹤研究表明，wAMD患者在接受阿柏西普治療96周時的視力改善情況（6.6～7.9個字母）不如52周時的視力改善情況（8.3～9.3個字母）[19]。這說明從長期治療結果看來，抗VEGF藥物治療wAMD的療效沒有短期作用明顯，容易復發和產生無應答情況且需要反復治療，增加副作用風險。目前對康柏西普快速耐藥反應的報道較少，這可能與該藥上市時間較短，缺少長期觀察研究且使用范圍比較局限（目前僅在中國臨床使用較多）有關。
對于酪氨酸抑制劑，目前臨床試驗表明其存在一些明顯不良反應，如腹瀉、惡心、視網膜瘢痕等，且治療效果不如其他抗VEGF藥物。由于處于新藥開發階段，臨床試驗受試者不足，還需要后續研究驗證。但是相比于其他抗VEGF藥物，該藥是口服制劑，可避免玻璃體腔注射引起的眼內炎、視網膜出血等問題，具有一定的應用前景，未來可以考慮聯合用藥的相關研究。
抗VEGF藥物治療除了存在療效不佳的問題外，還可能會引起嚴重的眼內炎等其他副作用，進而引起嚴重的視力喪失[38]。Nuzzi和Tridico[39]針對玻璃體腔注射抗VEGF藥物治療眼科相關疾病后發生不良反應的5年跟蹤研究表明，1173只患眼中，部分患眼（12.86%貝伐單抗、15.97%雷珠單抗、20.69%哌加他尼鈉）出現了持續眼內壓升高、感染性葡萄膜炎、視網膜脫離、視網膜下出血等眼部并發癥以及頭暈惡心、胸痛伴急性視力喪失和急性高血壓等系統性并發癥。
患者在使用抗VEGF藥物治療期間，對藥物的敏感性會隨著治療時間的延長和藥物注射的次數增多而下降，主要表現為療效變差或者藥物維持作用時間縮短。有研究發現，影響抗VEGF藥物療效的因素包括患者個體的基因表型、基線特征、CNV病灶特征、黃斑區視網膜與玻璃體交界面異常等[40]。關于耐藥反應產生的機制目前還不明確，但我們分析可能與以下幾個方面有關。（1）VEGF與其他細胞因子、生長因子的功能冗余。（2）替代性促血管發生途徑的增強和PDGF、肝細胞生長因子（HGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）、TNFα、IL-1、IL-6、IL-8和血管生成素等促進免疫反應的因子增強，這兩種原因導致的wAMD可不依賴于VEGF。針對這種難治性wAMD應該考慮調整VEGF抗體劑量以及聯合使用其他因子抑制劑。研究表明，接受聯合使用雷珠單抗和PDGF拮抗劑治療者較單獨雷珠單抗治療者視力預后更好[41]。（3）VEGF抗體的使用可致血漿中VEGF補償性增高。（4）機體免疫系統針對抗VEGF藥物產生中和抗體也是抗VEGF藥物快速脫敏的機制之一。（5）補體系統的持續激活和炎癥應答。在wAMD的發病機制中，除了血管新生，補體系統的激活和炎癥反應同樣存在。抗VEGF藥物治療只能阻斷VEGF誘導形成的新生血管，而補體系統的持續激活和炎癥反應對抗VEGF藥物不敏感。因此，由于wAMD復雜的病理機制，需要制定聯合運用多靶點的治療方案。（6）與患者遺傳因素有關。wAMD患者接受雷珠單抗的治療效果與患者具體的補體因子H（CFH）基因型有關。Lee等[42]發現，攜帶CFH Y402H純合子基因型的患者需要額外的雷珠單抗治療的可能性更高。（7）快速抗藥反應。
針對出現抗VEGF藥物治療抵抗或者無應答的情況，有多項研究嘗試增加注射頻率、增加注射次數、更換抗VEGF藥物以及聯合光動力療法等手段來改善治療效果。這些方法或許能在短時間內改善視力，但長期來看，患者視力仍然會回到基線水平甚至下降。由于這部分患者為維持視力不得不接受更頻繁的抗VEGF藥物注射，也因此可能加快地圖樣萎縮的進程[30]。在英國開展的一項多中心研究中，11 000余例wAMD患者共接受93 000次抗VEGF藥物注射，2年治療期間，患者視力提高到56個字母（基線水平是55個字母）；3年后平均視力下降到53個字母[43]。該結果說明，對于這部分患者而言，抗VEGF藥物治療的長期效果不容樂觀。
5 未來治療手段展望
5.1 VEGF基因編輯與干細胞治療
雖然目前的抗VEGF藥物可以靶向作用于RPE細胞，但卻不能實現長久治愈的效果。由于RPE細胞會持續過量地表達VEGF，患者需要定期注射藥物來維持正常的VEGF水平。隨著成簇規律間隔的短回文重復序列及其相關蛋白9（CRISPR/CAS9）第三代基因編輯技術的研究深入，研究者已經將基因編輯技術用于臨床治療領域，并取得令人滿意的效果[44]。現已有研究成功地將CRISPR/Cas9復合物注射到wAMD模型小鼠眼中，對VEGF基因進行局部修飾；該研究發現運送預組裝的CRISPR/Cas9復合物要比利用質粒運送相同的組分更加高效，且這種復合物在注射僅72 h后就會消失；其通過評估這些小鼠的整個基因組，發現這種CRISPR/Cas9復合物不僅修飾VEGF基因，而且不影響其他基因；并且，小鼠的CNV區域下降了58%[44]。這說明，通過對VEGF基因進行編輯，能夠實現更為長期的治愈。Huang等[45]利用腺相關病毒介導的CRISPR/Cas9靶向修飾VEGFR2基因，在小鼠模型中表現其治療新生血管疾病的潛能。
針對進展型地圖樣萎縮的AMD患者，干細胞治療也為這類患者帶來了希望，其有望更新和恢復已死亡或受損的光感受器細胞[46]。盡管基因和干細胞治療為難治性AMD帶來了曙光，但是毫無疑問，這些新興治療方式也會帶來更大的經濟負擔。
5.2 靶向其他新生血管相關通路
由于近年來抗VEGF藥物治療新生血管疾病出現了耐藥和延遲應答的現象，研究者們開始尋找其他可能導致新生血管的信號和相關因子，通過多種途徑深入探討治療新生血管的更有效方式。DLL4-Notch信號轉導通路能促進血管成熟，抑制新生血管分支形成，抑制血管過度增生。DLL4信號通路調節VEGF下游通路，抑制血管發出新的分支，抑制新生血管形成。研究證實，抑制DLL4能促進無功能新血管的生成，增加新生血管的數量，然而這些新生的血管輸送血氧能力較弱[47]。因此這種方法可以用于治療腫瘤新生血管，使腫瘤內供血供氧不足，生長受到抑制。對于抗VEGF-A治療耐受的腫瘤可以使用新靶點抗DLL4治療。而在視網膜新生血管中也有研究證實，DLL4可以抑制新生血管的發生[48]。現有研究已證實，Notch信號通路參與CNV生成[49]。Dou等[50]采用敲除Notch信號通路的關鍵分子RBP-J的條件性基因小鼠建立激光誘導的CNV模型并應用FFA和組織學分析發現，Notch信號的缺失使血管內皮細胞上VEGFR2表達上調，而VEGFR1表達下降，同時CNV程度加重。研究發現，內皮細胞中DLL4-Notch信號通路激活會導致VEGFR1表達量上調，使VEGFR2與VEGF的結合相對減少，VEGF信號通路作用減弱，新生血管形成減少[51]。Notch信號通路可能是通過對VEGFR的調控把血管內皮細胞對VEGF的反應控制在一個合適的程度，使新生血管的生長發育受到控制。
5.3 遺傳和環境
AMD的發病與遺傳因素密切相關。HTRA1、CFH基因是AMD的主效基因，與wAMD的CNV和PCV均相關；FGD6基因是PCV的特異性位點[52-54]。環境因素氧化低密度脂蛋白（oxLDL）可以與CFH、FGD6相互作用調節氧化應激、炎癥和異常血管新生[55]。因此，從AMD的主效基因HTRA1、CFH、FGD6和環境因素oxLDL等角度探尋治療wAMD的根本措施，實現個性化治療也許是未來可以努力的方向。