引用本文： 白周現, 胡爽, 孔祥東. NR2E3基因純合新突變致Goldmann-Favre綜合征一家系. 中華眼底病雜志, 2018, 34(6): 541-545. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.06.004 復制
Goldmann-Favre綜合征是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，以早發的夜盲癥、雙眼視力進行性下降以及進行性色素變性、黃斑水腫、視網膜層分裂等眼底表現為主要特征，常常合并黃斑變性、視網膜劈裂癥及全視野閃光視網膜電圖特征性改變[1-3]。國內目前關于該病僅有少數個案報道[4-5]。我們在臨床中發現了Goldmann-Favre綜合征一家系，為明確其致病基因突變，我們選取了相關遺傳眼病致病基因突變熱點組成的眼科整體方案二代測序檢測包，對該家系進行了基因測序分析。現將結果報道如下。
1 對象和方法
本研究獲鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準；嚴格遵守赫爾辛基宣言，所有受試者均簽署知情同意書。
一回族近親婚配家系2代4名成員（圖1）納入本研究。先證者（Ⅲ3），男，31歲。父母為表兄妹近親婚配。自幼發現有先天性夜盲癥狀，色弱。先證者父親（Ⅱ1），65歲。雙眼視力1.2。先證者母親（Ⅱ2），63歲。先證者姐姐（Ⅲ2），38歲，育有一對龍鳳胎（Ⅳ1、Ⅳ2）。先證者2012年檢查資料顯示右眼視力0.02，左眼視力0.3伴眼球水平震顫。光相干斷層掃描（OCT）檢查，左眼黃斑區神經上皮層層間劈裂，黃斑中心凹未見，視網膜色素上皮（RPE）粗糙；右眼黃斑中心凹不明顯，RPE粗糙，鼻側視網膜可見層間劈裂。熒光素眼底血管造影檢查，雙眼動靜脈熒光充盈時間延長，早期后極部可見不均勻強熒光及遮蔽熒光，周邊部可見強熒光及不均勻透見熒光，晚期周邊部可見不均勻強熒光，未見明顯熒光素滲漏。
圖1
患者家系圖。■：男性患者；□：正常男性；○：正常女性；↑：先證者；
采集先證者（Ⅲ3）及其姐姐（Ⅲ2）、父親（Ⅱ1）、母親（Ⅱ2）外周靜脈血4 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用磁珠法提取試劑盒（Blood DNA Midi Kit D3494，美國Omega bio-tek公司）和自動化DNA提取設備（艾本德中國有限公司）抽提外周血組織基因組DNA。選擇眼科整體方案測序檢測包的混合引物（北京邁基諾基因科技有限責任公司合成），通過本科室測序平臺Ion PGM進行基因測序。人類基因組參考序列版本選擇GRCh37。對二代測序結果注釋篩選分析得到目標致病突變位點。
對該家系的二代測序突變結果進行Sanger測序法驗證。以Goldmann-Favre綜合征家系成員提取的基因組DNA為模板，使用Taq DNA聚合酶（立陶宛Fermentas公司）和特異引物（GeneTool設計）對目標序列進行擴增。引物序列：正向引物5’-GCTGGAAGAGGCGTGGAGTGAA-3’，反向引物5’-GGGGGTAGTGGAGGGAGAGTGA-3’，產物長度318堿基對（bp）。擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環32次；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。將聚合酶鏈反應（PCR）擴增的目的DNA片段純化后，用熒光標記終止物試劑盒dGTP BigDye? Terminator Sequencing Kit（美國ABI公司）測序。測序反應參數：96 ℃預變性1 min；96 ℃10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 4 min，循環25次，4℃保存。采用乙醇/醋酸鈉純化，按BigDyeV3.1操作手冊進行。將純化產物變性后上ABI 3130xl測序儀（美國ABI公司）進行序列分析。
利用人類基因變異數據庫（HGMD）、單核苷酸多態性數據庫（dbSNP，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）等工具對目標突變位點進行查詢，看是否已被收錄。通過查詢基因組整合數據庫（gnomAD）了解該突變在人群中出現的頻率。通過PubMed數據庫查詢是否有相關論文報道，被學術論文報道過的相關致病變異可確定為致病性突變。采用GERP++軟件和UCSC（http://genome.ucsc.edu/）在線工具對突變位點的氨基酸進行保守性分析。利用PolyPhen2蛋白預測軟件分析錯義突變對蛋白質功能的影響，以判斷其致病性；分值范圍[0，1]，分值越高越有害。使用PredictProtein在線生物信息學工具（https://www.predictprotein.org/）對NR2E3氨基酸序列進行結構、致病性和氨基酸替換影響分析，評估該錯義突變的影響[6]。
2 結果
Ion PGM測序平臺DNA測序發現，先證者NR2E3基因存在c.925C＞T（p.R309W）純合突變，導致NR2E3基因的編碼蛋白核受體轉錄因子的第309位氨基酸由精氨酸（Arg）突變為色氨酸（Trp）。
對該家系二代測序突變結果進行Sanger測序法驗證，先證者NR2E3基因突變結果與二代測序一致。先證者NR2E3基因為c.925C＞T（p.R309W）純合突變型，其正常表型的父母NR2E3基因為c.925C＞T（p.R309W）雜合突變型（圖2），其正常表型的姐姐無NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）突變。先證者NR2E3基因突變經驗證遺傳自其近親結婚的父母。推斷其眼部疾病表型為NR2E3基因，因c.925C＞T（p.R309W）純合突變導致。
圖2
NR2E3基因c.925C＞T （p.R309W）突變位點Sanger測序驗證結果（由于Sanger驗證采用正向測序或反向測序，峰圖顯示的堿基有可能為被檢測堿基的反向互補序列）。2A.先證者；2B.先證者父親；2C.先證者母親；2D.先證者姐姐。先證者NR2E3基因為c.925C＞T（p.R309W）純合突變型（紅箭），先證者父母NR2E3基因為c.925C＞T（p.R309W）雜合突變型（紅箭），先證者姐姐無NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）突變（紅箭）
HGMD數據庫未收錄NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）純合突變。PubMed數據庫中未檢索到有關NR2E3基因為c.925C＞T（p.R309W）突變的致病性報道。該突變位點在dbSNP數據庫中的記錄編號為rs774102273，最小等位基因頻率T=0.000 03/3，該位點不屬于多態性位點，在人群中發生頻率極低。gnomAD數據庫中查詢該突變在人群中的發生頻率，NR2E3基因c.925C＞G（p.R309G）等位基因僅在非芬蘭裔歐洲人中出現1次，總頻率為0.000 004 17；NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）等位基因在非洲人中出現1次、在南亞人中出現1次、在非芬蘭裔歐洲人中出現3次，總頻率為0.000 019 22。
PolyPhen2蛋白預測軟件對該位點的預測值為0.99，預測結果為很可能有害（probably damaging）。PredictProtein工具對NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）突變位點綜合分析結果為具有致病性（圖3A～3C）。NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）突變位點位于α螺旋（helix）結構上且覆蓋在內部，在PredictProtein預測的致病區域上。NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）點突變預測71分（深紅色），c.925C＞G（p.R309G）點突變預測70分（深紅色），為有害突變。NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）突變位點氨基酸序列保守性GERP++估值3.56（大于2表示比較保守），預測為保守區域（conserved）。UCSC物種間序列保守性結果顯示，NR2E3基因p.309位點在人類、恒河猴、小鼠、狗、大象、家雞、非洲爪蟾、斑馬魚、七鰓鰻等脊椎動物中高度保守（圖3D）。越保守位點的錯義突變有害的可能性越大。
圖3
NR2E3基因c.925突變位點（紅框處）的生物信息學分析。3A.結構預測。第一行RePROF算法，藍色代表鏈狀（strand），暗紅色代表螺旋；第二行PROF算法，藍色代表鏈狀，暗紅色代表螺旋；第三行PROF算法，黃色表示覆蓋在內部，藍色表示暴露在外部。3B.致病預測。色塊區域代表致病；第一行PROFbval算法，第二行Ucon算法，第三行NORSnet算法，第四行MD算法。3C.點突變效應。橫軸代表NR2E3基因正常氨基酸序列，縱軸代表氨基酸替換，深紅色表示有害，綠色表示中性或無效應，黑色表示野生型。3D.突變位點的氨基酸序列在物種間的保守性
3 討論
本家系先證者表現為早發型夜盲、色弱、黃斑變性、黃斑水腫、RPE變性、視網膜劈裂癥以及雙眼視力進行性下降。這些臨床表型符合Goldmann-Favre綜合征的特征。研究者認為，大多數的Goldmann-Favre綜合征屬于NR2E3突變引起的單基因遺傳病[6-8]。根據孟德爾遺傳定律，本家系屬于常染色體隱性遺傳。為明確其致病基因突變，我們選取了相關遺傳眼病致病基因突變熱點組成的眼科整體方案二代測序檢測包對該家系進行了基因測序分析，結果顯示先證者發生了NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）純合突變，其父母表型正常且都攜帶此雜合變異。該新發突變相同位置的不同堿基突變（c.925C＞G）有致病性研究報道[9]。但本研究發現的NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）純合突變國內外尚未報道過。通過本研究臨床表型結合遺傳分析，我們認為該純合突變導致了本家系先證者Goldmann-Favre綜合征的發生。
NR2E3基因位于15q23，由8個外顯子組成，該基因編碼的蛋白為涉及信號通路的核受體轉錄因子大家族的一部分。核受體參與調控胚胎發育以及維持成人細胞的適當功能，其家族成員是不同DNA和配體結合的結構域。NR2E3基因編碼視網膜核受體，該核受體是配體依賴的轉錄因子。NR2E3基因缺陷能夠引起Goldmann-Favre綜合征。本研究中NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）純合突變導致其編碼蛋白的位于螺旋結構上第309位氨基酸由無特異性二級結構趨勢、極性帶正電脂肪族的精氨酸替換為色氨酸，色氨酸為非極性雜環族氨基酸有利于形成β折疊。該氨基酸替代很可能影響了視網膜核受體蛋白的內部結構，進而影響其維持正常的視網膜細胞的功能。
Enhanced S-cone綜合征的基因定位與Goldmann-Favre綜合征相同，均由NR2E3基因突變引起，同為常染色體隱性遺傳。臨床需要將兩者進行鑒別。Enhanced S-cone綜合征主要表現為S型視錐細胞大量增多、視桿細胞功能缺失以及對短波光敏感性增強、對長波光敏感性降低，在臨床表現上具有異質性[10-11]。有學者認為，Enhanced S-cone綜合征的嚴重型即為Goldmann-Favre綜合征[12]。Enhanced S-cone綜合征患者眼底也可出現類似的黃斑病變，會出現夜盲癥狀和視力下降，病變相對靜止。然而Goldmann-Favre綜合征患者視力會進行性下降，眼部病灶進行性惡化；OCT檢查可見黃斑囊樣病變、視網膜劈裂，眼部病變重于Enhanced S-cone綜合征[13]。本家系先證者自首診以來雙眼視力持續下降且視網膜病變繼續加重，其臨床特征及NR2E3基因突變等方面均符合Goldmann-Favre綜合征的診斷。
本研究從遺傳學角度闡明了1例Goldmann-Favre綜合征患者的致病原因，分析了NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）純合突變的致病性，該突變是導致Goldmann-Favre綜合征的新發突變。本研究的發現拓展了常染色體隱性遺傳Goldmann-Favre綜合征致病基因變異譜，為理解該病的分子病理機制提供了有用信息；本研究中純合NR2E3基因新致病突變的發現為Goldmann-Favre綜合征的檢查確診、遺傳咨詢和產前診斷提供了理論依據。
Goldmann-Favre綜合征是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，以早發的夜盲癥、雙眼視力進行性下降以及進行性色素變性、黃斑水腫、視網膜層分裂等眼底表現為主要特征，常常合并黃斑變性、視網膜劈裂癥及全視野閃光視網膜電圖特征性改變[1-3]。國內目前關于該病僅有少數個案報道[4-5]。我們在臨床中發現了Goldmann-Favre綜合征一家系，為明確其致病基因突變，我們選取了相關遺傳眼病致病基因突變熱點組成的眼科整體方案二代測序檢測包，對該家系進行了基因測序分析。現將結果報道如下。
1 對象和方法
本研究獲鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準；嚴格遵守赫爾辛基宣言，所有受試者均簽署知情同意書。
一回族近親婚配家系2代4名成員（圖1）納入本研究。先證者（Ⅲ3），男，31歲。父母為表兄妹近親婚配。自幼發現有先天性夜盲癥狀，色弱。先證者父親（Ⅱ1），65歲。雙眼視力1.2。先證者母親（Ⅱ2），63歲。先證者姐姐（Ⅲ2），38歲，育有一對龍鳳胎（Ⅳ1、Ⅳ2）。先證者2012年檢查資料顯示右眼視力0.02，左眼視力0.3伴眼球水平震顫。光相干斷層掃描（OCT）檢查，左眼黃斑區神經上皮層層間劈裂，黃斑中心凹未見，視網膜色素上皮（RPE）粗糙；右眼黃斑中心凹不明顯，RPE粗糙，鼻側視網膜可見層間劈裂。熒光素眼底血管造影檢查，雙眼動靜脈熒光充盈時間延長，早期后極部可見不均勻強熒光及遮蔽熒光，周邊部可見強熒光及不均勻透見熒光，晚期周邊部可見不均勻強熒光，未見明顯熒光素滲漏。
圖1
患者家系圖。■：男性患者；□：正常男性；○：正常女性；↑：先證者；
采集先證者（Ⅲ3）及其姐姐（Ⅲ2）、父親（Ⅱ1）、母親（Ⅱ2）外周靜脈血4 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用磁珠法提取試劑盒（Blood DNA Midi Kit D3494，美國Omega bio-tek公司）和自動化DNA提取設備（艾本德中國有限公司）抽提外周血組織基因組DNA。選擇眼科整體方案測序檢測包的混合引物（北京邁基諾基因科技有限責任公司合成），通過本科室測序平臺Ion PGM進行基因測序。人類基因組參考序列版本選擇GRCh37。對二代測序結果注釋篩選分析得到目標致病突變位點。
對該家系的二代測序突變結果進行Sanger測序法驗證。以Goldmann-Favre綜合征家系成員提取的基因組DNA為模板，使用Taq DNA聚合酶（立陶宛Fermentas公司）和特異引物（GeneTool設計）對目標序列進行擴增。引物序列：正向引物5’-GCTGGAAGAGGCGTGGAGTGAA-3’，反向引物5’-GGGGGTAGTGGAGGGAGAGTGA-3’，產物長度318堿基對（bp）。擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環32次；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。將聚合酶鏈反應（PCR）擴增的目的DNA片段純化后，用熒光標記終止物試劑盒dGTP BigDye? Terminator Sequencing Kit（美國ABI公司）測序。測序反應參數：96 ℃預變性1 min；96 ℃10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 4 min，循環25次，4℃保存。采用乙醇/醋酸鈉純化，按BigDyeV3.1操作手冊進行。將純化產物變性后上ABI 3130xl測序儀（美國ABI公司）進行序列分析。
利用人類基因變異數據庫（HGMD）、單核苷酸多態性數據庫（dbSNP，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）等工具對目標突變位點進行查詢，看是否已被收錄。通過查詢基因組整合數據庫（gnomAD）了解該突變在人群中出現的頻率。通過PubMed數據庫查詢是否有相關論文報道，被學術論文報道過的相關致病變異可確定為致病性突變。采用GERP++軟件和UCSC（http://genome.ucsc.edu/）在線工具對突變位點的氨基酸進行保守性分析。利用PolyPhen2蛋白預測軟件分析錯義突變對蛋白質功能的影響，以判斷其致病性；分值范圍[0，1]，分值越高越有害。使用PredictProtein在線生物信息學工具（https://www.predictprotein.org/）對NR2E3氨基酸序列進行結構、致病性和氨基酸替換影響分析，評估該錯義突變的影響[6]。
2 結果
Ion PGM測序平臺DNA測序發現，先證者NR2E3基因存在c.925C＞T（p.R309W）純合突變，導致NR2E3基因的編碼蛋白核受體轉錄因子的第309位氨基酸由精氨酸（Arg）突變為色氨酸（Trp）。
對該家系二代測序突變結果進行Sanger測序法驗證，先證者NR2E3基因突變結果與二代測序一致。先證者NR2E3基因為c.925C＞T（p.R309W）純合突變型，其正常表型的父母NR2E3基因為c.925C＞T（p.R309W）雜合突變型（圖2），其正常表型的姐姐無NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）突變。先證者NR2E3基因突變經驗證遺傳自其近親結婚的父母。推斷其眼部疾病表型為NR2E3基因，因c.925C＞T（p.R309W）純合突變導致。
圖2
NR2E3基因c.925C＞T （p.R309W）突變位點Sanger測序驗證結果（由于Sanger驗證采用正向測序或反向測序，峰圖顯示的堿基有可能為被檢測堿基的反向互補序列）。2A.先證者；2B.先證者父親；2C.先證者母親；2D.先證者姐姐。先證者NR2E3基因為c.925C＞T（p.R309W）純合突變型（紅箭），先證者父母NR2E3基因為c.925C＞T（p.R309W）雜合突變型（紅箭），先證者姐姐無NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）突變（紅箭）
HGMD數據庫未收錄NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）純合突變。PubMed數據庫中未檢索到有關NR2E3基因為c.925C＞T（p.R309W）突變的致病性報道。該突變位點在dbSNP數據庫中的記錄編號為rs774102273，最小等位基因頻率T=0.000 03/3，該位點不屬于多態性位點，在人群中發生頻率極低。gnomAD數據庫中查詢該突變在人群中的發生頻率，NR2E3基因c.925C＞G（p.R309G）等位基因僅在非芬蘭裔歐洲人中出現1次，總頻率為0.000 004 17；NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）等位基因在非洲人中出現1次、在南亞人中出現1次、在非芬蘭裔歐洲人中出現3次，總頻率為0.000 019 22。
PolyPhen2蛋白預測軟件對該位點的預測值為0.99，預測結果為很可能有害（probably damaging）。PredictProtein工具對NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）突變位點綜合分析結果為具有致病性（圖3A～3C）。NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）突變位點位于α螺旋（helix）結構上且覆蓋在內部，在PredictProtein預測的致病區域上。NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）點突變預測71分（深紅色），c.925C＞G（p.R309G）點突變預測70分（深紅色），為有害突變。NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）突變位點氨基酸序列保守性GERP++估值3.56（大于2表示比較保守），預測為保守區域（conserved）。UCSC物種間序列保守性結果顯示，NR2E3基因p.309位點在人類、恒河猴、小鼠、狗、大象、家雞、非洲爪蟾、斑馬魚、七鰓鰻等脊椎動物中高度保守（圖3D）。越保守位點的錯義突變有害的可能性越大。
圖3
NR2E3基因c.925突變位點（紅框處）的生物信息學分析。3A.結構預測。第一行RePROF算法，藍色代表鏈狀（strand），暗紅色代表螺旋；第二行PROF算法，藍色代表鏈狀，暗紅色代表螺旋；第三行PROF算法，黃色表示覆蓋在內部，藍色表示暴露在外部。3B.致病預測。色塊區域代表致病；第一行PROFbval算法，第二行Ucon算法，第三行NORSnet算法，第四行MD算法。3C.點突變效應。橫軸代表NR2E3基因正常氨基酸序列，縱軸代表氨基酸替換，深紅色表示有害，綠色表示中性或無效應，黑色表示野生型。3D.突變位點的氨基酸序列在物種間的保守性
3 討論
本家系先證者表現為早發型夜盲、色弱、黃斑變性、黃斑水腫、RPE變性、視網膜劈裂癥以及雙眼視力進行性下降。這些臨床表型符合Goldmann-Favre綜合征的特征。研究者認為，大多數的Goldmann-Favre綜合征屬于NR2E3突變引起的單基因遺傳病[6-8]。根據孟德爾遺傳定律，本家系屬于常染色體隱性遺傳。為明確其致病基因突變，我們選取了相關遺傳眼病致病基因突變熱點組成的眼科整體方案二代測序檢測包對該家系進行了基因測序分析，結果顯示先證者發生了NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）純合突變，其父母表型正常且都攜帶此雜合變異。該新發突變相同位置的不同堿基突變（c.925C＞G）有致病性研究報道[9]。但本研究發現的NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）純合突變國內外尚未報道過。通過本研究臨床表型結合遺傳分析，我們認為該純合突變導致了本家系先證者Goldmann-Favre綜合征的發生。
NR2E3基因位于15q23，由8個外顯子組成，該基因編碼的蛋白為涉及信號通路的核受體轉錄因子大家族的一部分。核受體參與調控胚胎發育以及維持成人細胞的適當功能，其家族成員是不同DNA和配體結合的結構域。NR2E3基因編碼視網膜核受體，該核受體是配體依賴的轉錄因子。NR2E3基因缺陷能夠引起Goldmann-Favre綜合征。本研究中NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）純合突變導致其編碼蛋白的位于螺旋結構上第309位氨基酸由無特異性二級結構趨勢、極性帶正電脂肪族的精氨酸替換為色氨酸，色氨酸為非極性雜環族氨基酸有利于形成β折疊。該氨基酸替代很可能影響了視網膜核受體蛋白的內部結構，進而影響其維持正常的視網膜細胞的功能。
Enhanced S-cone綜合征的基因定位與Goldmann-Favre綜合征相同，均由NR2E3基因突變引起，同為常染色體隱性遺傳。臨床需要將兩者進行鑒別。Enhanced S-cone綜合征主要表現為S型視錐細胞大量增多、視桿細胞功能缺失以及對短波光敏感性增強、對長波光敏感性降低，在臨床表現上具有異質性[10-11]。有學者認為，Enhanced S-cone綜合征的嚴重型即為Goldmann-Favre綜合征[12]。Enhanced S-cone綜合征患者眼底也可出現類似的黃斑病變，會出現夜盲癥狀和視力下降，病變相對靜止。然而Goldmann-Favre綜合征患者視力會進行性下降，眼部病灶進行性惡化；OCT檢查可見黃斑囊樣病變、視網膜劈裂，眼部病變重于Enhanced S-cone綜合征[13]。本家系先證者自首診以來雙眼視力持續下降且視網膜病變繼續加重，其臨床特征及NR2E3基因突變等方面均符合Goldmann-Favre綜合征的診斷。
本研究從遺傳學角度闡明了1例Goldmann-Favre綜合征患者的致病原因，分析了NR2E3基因c.925C＞T（p.R309W）純合突變的致病性，該突變是導致Goldmann-Favre綜合征的新發突變。本研究的發現拓展了常染色體隱性遺傳Goldmann-Favre綜合征致病基因變異譜，為理解該病的分子病理機制提供了有用信息；本研究中純合NR2E3基因新致病突變的發現為Goldmann-Favre綜合征的檢查確診、遺傳咨詢和產前診斷提供了理論依據。
