引用本文： 李杰, 邢亞斯, 栗占榮, 路小楠, 戴淑真. 六個白化病家系的致病基因篩查及表型分析. 中華眼底病雜志, 2018, 34(6): 536-540. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.06.003 復制
白化病主要分為非綜合征型的眼皮膚白化病（OCA）、僅累及眼部的眼白化病（OA）以及綜合征型白化病三類。目前已鑒別出OCA的7種致病基因OCA1～7、OA致病基因GPR143（OA1）以及Hermansky-Pudlak綜合征（HPS）、先天性白細胞顆粒異常綜合征（CHS）等綜合征型白化病的致病基因HPS1～9型與CHS1型等[1-2]。白化病的致病基因均與體內黑色素合成相關，如編碼黑色素原的關鍵基因TYR、TYRP1，編碼黑色素小體亞細胞結構的基因OCA2、SLC45A2、GPR143以及溶酶體相關細胞器發生復合體（BLOC）基因HPS1、AP3B1、HPS3、HPS4、HPS5、HPS6、DTNBP1、BLOC1S3、BLOC1S6、LYST等[3]。眼部損害是白化病的共有特征，也是功能上影響最嚴重的器官，主要包括虹膜視網膜色素沉積不足、黃斑發育不良及視覺纖維通路異常[4]。由于白化病患兒往往首診于眼科，了解國人白化病的分類情況及臨床特征以幫助眼科醫生更好地認識該病具有重要的臨床意義。本研究收集了河南省白化病6個家系的臨床資料，并對其致病基因進行了分析。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性系列病例研究。本研究獲河南省立眼科醫院的機構審查委員會批準；嚴格遵循赫爾基辛宣言，所有受試者及未成年人受試者監護人均簽署知情同意書。
2017年1月至2018年6月在河南省立眼科醫院小兒遺傳眼病門診就診的白化病先證者6例及其家系成員20名納入本研究。先證者分別來自6個無血緣關系家系；其中，男性4例，女性2例。家系1、5、6為散發病例，家系2～4具有家族史。6例先證者中，5例（家系1～3、5、6）符合OCA的診斷，其皮膚白皙、毛發淡黃、虹膜及視網膜色素沉著不足；1例（家系4）符合OA的診斷，其僅表現為虹膜及視網膜色素沉著不足。6例先證者均存在眼球震顫、視力低下的表現，其中3例光相干斷層掃描（OCT）檢查證實黃斑中心凹變淺或消失。具有家族史的家系2中Ⅱ1、家系3中Ⅱ3以及家系4中Ⅰ1均具有與先證者相似表型。
抽取受試者外周靜脈血并分離白細胞，TIANamp Blood DNA Kit試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取基因組DNA，應用Qubit? 2.0熒光計定量（美國Invitrogen公司）檢測濃度及總量，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測純度及完整性。
由北京全譜醫學檢驗實驗室對受試者行全外顯子組和Sanger測序。家系1、3、5、6選擇家系Trios模式行全外顯子組測序；家系2選擇單人模式行全外顯子組測序，另由Sanger測序法檢測其他家系成員。DNA樣本采用羅氏NimbleGen公司的V2捕獲探針進行捕獲，完成建庫之后按照美國Illumina公司的Hiseq系列平臺標準化流程上機測序，運用Basecall分析軟件BclToFastq得到原始數據。原始數據經過質控后，采用Burrows-Wheeler Aligner比對軟件與參考序列hg19進行比對統計。依次使用Samtools、Picard軟件，生成去重復的bam文件；使用GATK軟件分析出單核苷酸多態（SNP）、插入缺失標記等。根據測序深度，突變質量進行變異過濾（突變深度至少達到10倍，突變率達到30%以上，篩選突變質量值＞20）。然后采用PROVEAN（http://provean.jcvi.org/seq_submit.php）、SIFT（http://sift.jcvi.org/）、Polyphen2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、MT（http://www.mutationtaster.org/）及MaxEntScan（http://genes.mit.edu/burgelab/maxent/Xmaxentscan_scoreseq.html）等進行變異注釋及危害預測。MT及Polyphen2：數值越接近1，致病性越高；SIFT：數值越接近0，致病性越高。二次過濾去除最小等位基因頻率（MAF）5%以上的多態性突變，同義突變，內含子區域的突變。依據2015年發布的美國醫學遺傳學及基因組學會（ACMG）標準及指南[5]對突變進行致病性分級：1級，與疾病相關性較高；2級，與疾病可能相關；3級，與疾病相關性未知。最后根據家系共分離進一步分析篩選。家系4先證者選擇Sanger測序法檢測GPR143編碼區及其鄰近區域，并驗證其他家系成員。
2 結果
全外顯子組測序目標捕獲區的平均測序深度均大于80倍、覆蓋度均大于99%。排除在dbSNP144、千人基因組（1000 G）、Esp6500、HapMap Project等數據庫中存在的突變位點，家系1～3、5、6剩余意義未知的突變數目分別為1672、1863、1613、1570、1930個。
優先分析已知白化病相關基因突變位點，結合生物信息學分析和家系共分離情況后，于4個家系中發現6個高致病突變，包括家系1、2的常染色體隱性復雜合突變[TYR（c.1037-7T＞A，c.925_c.926insC）、OCA2（c.2359G＞A，c.587T＞C）]和家系3、4的X染色體雜合突變[GPR143（c.11C＞G）、GPR143（c.333 G＞A）]（圖1）。參照國際白化病中心數據庫（http://www.ifpcs.org/albinism/index.html），6個突變中5個是新發現的（表1）。所有突變均由Sanger測序證實（圖2），分別代表了OCA1型、OCA2型以及OA1型3種亞型。
圖1
家系1～4家系圖。1A～1D.家系1～4。□：正常男性；○：正常女性；■：患病男性；●：患病女性；↗：先證者；＋：野生型；0：男性無另一條X染色體
表1
突變陽性患者的基因突變及致病性分析
圖2
家系1～4先證者Sanger測序圖。2A.家系1先證者，TYR基因存在c.925_c.926insC與c.1037-7T＞A的復雜合突變（黑箭）；2B.家系2先證者，OCA2基因存在c.2359G＞A與c.587T＞C的復雜合突變（黑箭）；2C.家系3先證者，GPR143基因存在c.11C＞G錯義突變（黑箭）；2D.家系4先證者，GPR143基因存在c.333G＞A無義突變（黑箭）
家系1先證者的兩個變異分別來源于正常表型的父親Ⅰ1和母親Ⅰ2。驗證家系2先證者的患病姐姐Ⅱ1及正常表型的侄子Ⅲ1后，證實兩個變異分別位于不同染色體上。家系3先證者的母親Ⅱ1是致病變異的雜合體；其父親Ⅱ2基因型正常，但具有皮膚白皙、發質淡黃、虹膜淡黃的表現及家族史。家系4先證者存在GPR143（c.333G＞A）變異，其患病外公Ⅰ1具有相同基因型及臨床表型；其母親Ⅱ1及姨母Ⅱ3為雜合體，具有虹膜及眼底色素沉著不足等表現，眼底自身熒光檢查可見泥漿潑濺樣熒光改變（圖3）。家系5先證者于OCA2基因發現雜合高致病變異（c.1079C＞T），但該基因未發現其他致病變異，故未能支持遺傳學診斷。
圖3
家系4先證者母親（攜帶者）眼底自身熒光像。3A.右眼后極部；3B.左眼后極部；3C.右眼上方；3D.左眼顳側。自身熒光不均勻，呈泥漿潑濺樣改變
3 討論
OCA是一類具有相似臨床表型的疾病，均表現為眼部、皮膚及毛發的色素減少，同時伴隨眼球震顫、視力低下等。其遺傳基因異質性顯著，根據基因型目前已有7種分型（OCA1～OCA7）[6]；此外，還包括HPS與CHS等隱匿合并其他臟器或系統病變的綜合征，臨床上僅根據表型很難確定其亞型[7]。全外顯子組測序技術可以高效的發現突變，提供了便捷的分型及防治方法。本研究共收集6例白化病先證者，5例表現為OCA，1例表現為OA。OCA采用了全外顯子組測序的方式，OA采用了Sanger直接測序的方式，發現4例攜帶可疑致病突變，豐富了國人白化病疾病的分布及臨床表型特征。
國人白化病中OCA1是最常見類型，占56%；OCA2次之，占32%；OCA4占12%[8]。本研究家系1、2分別攜帶TYR和OCA2的復雜合突變，屬于OCA1型和2型。其中家系1攜帶TYR基因未曾報道的插入突變（c.925_926insC），致使編碼提前終止（p.T309Tfs*9），屬于無義突變，具有高致病性；另外攜帶剪切突變c.1037-7T＞A引起編碼體剪切方式改變，既往數次報道已予以證實[9-10]。上述無義突變和剪切突變的復雜合基因型可能保留了部分蛋白功能，因此家系1先證者展現了OCA1B的表型[11]。即隨著年齡增長，出現了色素的沉積。家系2攜帶OCA2基因未曾報道的錯義突變（C.587T＞C, p.L196P），位于外顯子的重要功能域（clinvar數據庫中該區域無良性變異），生物信息學預測變異對基因產物有影響，正常對照人群數據庫中均未發現，屬于低頻高致病變異；另外攜帶的c.2359G＞A也屬于新堿基變異，但其氨基酸改變p.A787T既往曾報道，屬于已證實的突變類型[12]。此外，家系2先證者的患病姐姐攜帶以上兩個變異，而其姐姐正常表型的兒子僅攜帶c.2359（exon23）G＞A。證明了兩個變異位于不同染色單體上，屬于復雜合突變。
家系3先證者呈典型的OCA表型，該患兒皮膚明顯白皙，發質淡黃且并發眼部白化病表型；其父親也具有皮膚白皙、發質淡黃、虹膜淡黃表現，但無眼球震顫與視力低下，父親自述存在皮膚白皙，發質淡黃的家族史。我們首先采取了全外顯子組測序的方法發現先證者GPR143基因攜帶高致病性突變（c.11C＞G, p.P4R），該突變為新發現突變。綜合生物信息學分析及正常對照數據庫信息后，ACMG預測可能致病；鑒于GPR143缺失變異可占1/3以上，而全外顯子組測序不能有效發現，后續我們又應用了Sanger測序篩查，排除了其他缺失重復等變異。OA1型可以伴發輕度皮膚色素減退[13]。既往報道國人OA極少皮膚受累[14]。據此我們分析認為，先證者皮膚表型也可能遺傳其父親其他影響色素表達的因子，而其病因仍然屬于母方遺傳的OA可能性大，遺傳分子學上的診斷與臨床表型學上的診斷相符。
OA1型又稱先天性眼球震顫6型，與先天性運動性眼球震顫的臨床特征均為先天性眼球震顫、視靈敏度降低，且均常見于X染色體隱性遺傳；而國人眼部色素缺失較之高加索人可能并不明顯，容易混淆和誤診[15-16]。家系4先證者的表型為眼球水平震顫、視力低下、虹膜色素沉著不足及眼底色素缺乏，無皮膚或毛發色淡的表現；其外祖父有相似表型，OCT檢查可見黃斑區無正常凹性結構，并符合X染色體隱性遺傳特征，懷疑為單純OA。我們采用Sanger測序法篩查了GPR143基因，發現新的高致病性突變（c.333G＞A, p.W111X, 294），屬于無義突變，導致蛋白編碼的提前終止，嚴重損害其功能；檢查其正常表型的攜帶者母親及姨母，發現也存在虹膜及眼底色素沉著不足表現，眼底自身熒光可見典型的泥漿潑濺樣熒光改變，展現了不完全表型的特征。這符合既往關于OA1攜帶者會出現部分體征的認識[17]。
本研究在國人6個白化病家系中發現了4個家系具有基因突變，分別代表了OCA1、OCA2、OA1三種亞型，6個突變位點中5個是新位點；所有患者均存在黃斑中心凹發育不全的表現，皮膚、毛發、虹膜及眼底顏色具有較大的可變性。該結果揭示了國人白化病的基因型及表型特征，擴展了突變頻譜。但由于家系樣本采集不全，其結論尚需進一步研究給予驗證。
白化病主要分為非綜合征型的眼皮膚白化病（OCA）、僅累及眼部的眼白化病（OA）以及綜合征型白化病三類。目前已鑒別出OCA的7種致病基因OCA1～7、OA致病基因GPR143（OA1）以及Hermansky-Pudlak綜合征（HPS）、先天性白細胞顆粒異常綜合征（CHS）等綜合征型白化病的致病基因HPS1～9型與CHS1型等[1-2]。白化病的致病基因均與體內黑色素合成相關，如編碼黑色素原的關鍵基因TYR、TYRP1，編碼黑色素小體亞細胞結構的基因OCA2、SLC45A2、GPR143以及溶酶體相關細胞器發生復合體（BLOC）基因HPS1、AP3B1、HPS3、HPS4、HPS5、HPS6、DTNBP1、BLOC1S3、BLOC1S6、LYST等[3]。眼部損害是白化病的共有特征，也是功能上影響最嚴重的器官，主要包括虹膜視網膜色素沉積不足、黃斑發育不良及視覺纖維通路異常[4]。由于白化病患兒往往首診于眼科，了解國人白化病的分類情況及臨床特征以幫助眼科醫生更好地認識該病具有重要的臨床意義。本研究收集了河南省白化病6個家系的臨床資料，并對其致病基因進行了分析。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性系列病例研究。本研究獲河南省立眼科醫院的機構審查委員會批準；嚴格遵循赫爾基辛宣言，所有受試者及未成年人受試者監護人均簽署知情同意書。
2017年1月至2018年6月在河南省立眼科醫院小兒遺傳眼病門診就診的白化病先證者6例及其家系成員20名納入本研究。先證者分別來自6個無血緣關系家系；其中，男性4例，女性2例。家系1、5、6為散發病例，家系2～4具有家族史。6例先證者中，5例（家系1～3、5、6）符合OCA的診斷，其皮膚白皙、毛發淡黃、虹膜及視網膜色素沉著不足；1例（家系4）符合OA的診斷，其僅表現為虹膜及視網膜色素沉著不足。6例先證者均存在眼球震顫、視力低下的表現，其中3例光相干斷層掃描（OCT）檢查證實黃斑中心凹變淺或消失。具有家族史的家系2中Ⅱ1、家系3中Ⅱ3以及家系4中Ⅰ1均具有與先證者相似表型。
抽取受試者外周靜脈血并分離白細胞，TIANamp Blood DNA Kit試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取基因組DNA，應用Qubit? 2.0熒光計定量（美國Invitrogen公司）檢測濃度及總量，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測純度及完整性。
由北京全譜醫學檢驗實驗室對受試者行全外顯子組和Sanger測序。家系1、3、5、6選擇家系Trios模式行全外顯子組測序；家系2選擇單人模式行全外顯子組測序，另由Sanger測序法檢測其他家系成員。DNA樣本采用羅氏NimbleGen公司的V2捕獲探針進行捕獲，完成建庫之后按照美國Illumina公司的Hiseq系列平臺標準化流程上機測序，運用Basecall分析軟件BclToFastq得到原始數據。原始數據經過質控后，采用Burrows-Wheeler Aligner比對軟件與參考序列hg19進行比對統計。依次使用Samtools、Picard軟件，生成去重復的bam文件；使用GATK軟件分析出單核苷酸多態（SNP）、插入缺失標記等。根據測序深度，突變質量進行變異過濾（突變深度至少達到10倍，突變率達到30%以上，篩選突變質量值＞20）。然后采用PROVEAN（http://provean.jcvi.org/seq_submit.php）、SIFT（http://sift.jcvi.org/）、Polyphen2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、MT（http://www.mutationtaster.org/）及MaxEntScan（http://genes.mit.edu/burgelab/maxent/Xmaxentscan_scoreseq.html）等進行變異注釋及危害預測。MT及Polyphen2：數值越接近1，致病性越高；SIFT：數值越接近0，致病性越高。二次過濾去除最小等位基因頻率（MAF）5%以上的多態性突變，同義突變，內含子區域的突變。依據2015年發布的美國醫學遺傳學及基因組學會（ACMG）標準及指南[5]對突變進行致病性分級：1級，與疾病相關性較高；2級，與疾病可能相關；3級，與疾病相關性未知。最后根據家系共分離進一步分析篩選。家系4先證者選擇Sanger測序法檢測GPR143編碼區及其鄰近區域，并驗證其他家系成員。
2 結果
全外顯子組測序目標捕獲區的平均測序深度均大于80倍、覆蓋度均大于99%。排除在dbSNP144、千人基因組（1000 G）、Esp6500、HapMap Project等數據庫中存在的突變位點，家系1～3、5、6剩余意義未知的突變數目分別為1672、1863、1613、1570、1930個。
優先分析已知白化病相關基因突變位點，結合生物信息學分析和家系共分離情況后，于4個家系中發現6個高致病突變，包括家系1、2的常染色體隱性復雜合突變[TYR（c.1037-7T＞A，c.925_c.926insC）、OCA2（c.2359G＞A，c.587T＞C）]和家系3、4的X染色體雜合突變[GPR143（c.11C＞G）、GPR143（c.333 G＞A）]（圖1）。參照國際白化病中心數據庫（http://www.ifpcs.org/albinism/index.html），6個突變中5個是新發現的（表1）。所有突變均由Sanger測序證實（圖2），分別代表了OCA1型、OCA2型以及OA1型3種亞型。
圖1
家系1～4家系圖。1A～1D.家系1～4。□：正常男性；○：正常女性；■：患病男性；●：患病女性；↗：先證者；＋：野生型；0：男性無另一條X染色體
表1
突變陽性患者的基因突變及致病性分析
圖2
家系1～4先證者Sanger測序圖。2A.家系1先證者，TYR基因存在c.925_c.926insC與c.1037-7T＞A的復雜合突變（黑箭）；2B.家系2先證者，OCA2基因存在c.2359G＞A與c.587T＞C的復雜合突變（黑箭）；2C.家系3先證者，GPR143基因存在c.11C＞G錯義突變（黑箭）；2D.家系4先證者，GPR143基因存在c.333G＞A無義突變（黑箭）
家系1先證者的兩個變異分別來源于正常表型的父親Ⅰ1和母親Ⅰ2。驗證家系2先證者的患病姐姐Ⅱ1及正常表型的侄子Ⅲ1后，證實兩個變異分別位于不同染色體上。家系3先證者的母親Ⅱ1是致病變異的雜合體；其父親Ⅱ2基因型正常，但具有皮膚白皙、發質淡黃、虹膜淡黃的表現及家族史。家系4先證者存在GPR143（c.333G＞A）變異，其患病外公Ⅰ1具有相同基因型及臨床表型；其母親Ⅱ1及姨母Ⅱ3為雜合體，具有虹膜及眼底色素沉著不足等表現，眼底自身熒光檢查可見泥漿潑濺樣熒光改變（圖3）。家系5先證者于OCA2基因發現雜合高致病變異（c.1079C＞T），但該基因未發現其他致病變異，故未能支持遺傳學診斷。
圖3
家系4先證者母親（攜帶者）眼底自身熒光像。3A.右眼后極部；3B.左眼后極部；3C.右眼上方；3D.左眼顳側。自身熒光不均勻，呈泥漿潑濺樣改變
3 討論
OCA是一類具有相似臨床表型的疾病，均表現為眼部、皮膚及毛發的色素減少，同時伴隨眼球震顫、視力低下等。其遺傳基因異質性顯著，根據基因型目前已有7種分型（OCA1～OCA7）[6]；此外，還包括HPS與CHS等隱匿合并其他臟器或系統病變的綜合征，臨床上僅根據表型很難確定其亞型[7]。全外顯子組測序技術可以高效的發現突變，提供了便捷的分型及防治方法。本研究共收集6例白化病先證者，5例表現為OCA，1例表現為OA。OCA采用了全外顯子組測序的方式，OA采用了Sanger直接測序的方式，發現4例攜帶可疑致病突變，豐富了國人白化病疾病的分布及臨床表型特征。
國人白化病中OCA1是最常見類型，占56%；OCA2次之，占32%；OCA4占12%[8]。本研究家系1、2分別攜帶TYR和OCA2的復雜合突變，屬于OCA1型和2型。其中家系1攜帶TYR基因未曾報道的插入突變（c.925_926insC），致使編碼提前終止（p.T309Tfs*9），屬于無義突變，具有高致病性；另外攜帶剪切突變c.1037-7T＞A引起編碼體剪切方式改變，既往數次報道已予以證實[9-10]。上述無義突變和剪切突變的復雜合基因型可能保留了部分蛋白功能，因此家系1先證者展現了OCA1B的表型[11]。即隨著年齡增長，出現了色素的沉積。家系2攜帶OCA2基因未曾報道的錯義突變（C.587T＞C, p.L196P），位于外顯子的重要功能域（clinvar數據庫中該區域無良性變異），生物信息學預測變異對基因產物有影響，正常對照人群數據庫中均未發現，屬于低頻高致病變異；另外攜帶的c.2359G＞A也屬于新堿基變異，但其氨基酸改變p.A787T既往曾報道，屬于已證實的突變類型[12]。此外，家系2先證者的患病姐姐攜帶以上兩個變異，而其姐姐正常表型的兒子僅攜帶c.2359（exon23）G＞A。證明了兩個變異位于不同染色單體上，屬于復雜合突變。
家系3先證者呈典型的OCA表型，該患兒皮膚明顯白皙，發質淡黃且并發眼部白化病表型；其父親也具有皮膚白皙、發質淡黃、虹膜淡黃表現，但無眼球震顫與視力低下，父親自述存在皮膚白皙，發質淡黃的家族史。我們首先采取了全外顯子組測序的方法發現先證者GPR143基因攜帶高致病性突變（c.11C＞G, p.P4R），該突變為新發現突變。綜合生物信息學分析及正常對照數據庫信息后，ACMG預測可能致病；鑒于GPR143缺失變異可占1/3以上，而全外顯子組測序不能有效發現，后續我們又應用了Sanger測序篩查，排除了其他缺失重復等變異。OA1型可以伴發輕度皮膚色素減退[13]。既往報道國人OA極少皮膚受累[14]。據此我們分析認為，先證者皮膚表型也可能遺傳其父親其他影響色素表達的因子，而其病因仍然屬于母方遺傳的OA可能性大，遺傳分子學上的診斷與臨床表型學上的診斷相符。
OA1型又稱先天性眼球震顫6型，與先天性運動性眼球震顫的臨床特征均為先天性眼球震顫、視靈敏度降低，且均常見于X染色體隱性遺傳；而國人眼部色素缺失較之高加索人可能并不明顯，容易混淆和誤診[15-16]。家系4先證者的表型為眼球水平震顫、視力低下、虹膜色素沉著不足及眼底色素缺乏，無皮膚或毛發色淡的表現；其外祖父有相似表型，OCT檢查可見黃斑區無正常凹性結構，并符合X染色體隱性遺傳特征，懷疑為單純OA。我們采用Sanger測序法篩查了GPR143基因，發現新的高致病性突變（c.333G＞A, p.W111X, 294），屬于無義突變，導致蛋白編碼的提前終止，嚴重損害其功能；檢查其正常表型的攜帶者母親及姨母，發現也存在虹膜及眼底色素沉著不足表現，眼底自身熒光可見典型的泥漿潑濺樣熒光改變，展現了不完全表型的特征。這符合既往關于OA1攜帶者會出現部分體征的認識[17]。
本研究在國人6個白化病家系中發現了4個家系具有基因突變，分別代表了OCA1、OCA2、OA1三種亞型，6個突變位點中5個是新位點；所有患者均存在黃斑中心凹發育不全的表現，皮膚、毛發、虹膜及眼底顏色具有較大的可變性。該結果揭示了國人白化病的基因型及表型特征，擴展了突變頻譜。但由于家系樣本采集不全，其結論尚需進一步研究給予驗證。
