引用本文： 王鑫, 尚慶麗, 馬景學, 郝玉華, 姚惠娟, 李佳佳. 實驗性脈絡膜新生血管中Rap1、鳥苷三磷酸-Rap1、血管內皮生長因子及β-連環蛋白的表達研究. 中華眼底病雜志, 2018, 34(5): 475-480. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.05.013 復制
脈絡膜新生血管（CNV）的形成離不開脈絡膜毛細血管內皮細胞（CEC）的活化、Bruch膜的破壞與視網膜色素上皮（RPE）層的遷移。因此，RPE-Bruch膜-脈絡膜毛細血管復合體（RBCC）的完整性在CNV的形成發展中起至關重要的作用。研究發現，Ras超家族的小分子G蛋白Rap1，不僅可調節整合素介導的細胞基質黏附及細胞遷移，還對細胞間連接的完整性具有重要作用，Rap1可參與調節上皮細胞和內皮細胞間緊密連接與粘附連接的形成，一定程度上影響屏障功能的完整性[1]。因此，我們推斷Rap1對屏障功能的維持可能具有協調作用。本研究通過觀察激光誘導的CNV中Rap1及相關因子的表達情況，探討Rap1及相關因子與CNV發生發展的相關性。
1 材料和方法
健康雄性棕色挪威大鼠42只，8～10周齡，體重200～220 g，購自北京維通利華試驗動物技術有限公司，于河北醫科大學第二醫院動物實驗中心正常飼養。實驗動物的管理和使用符合國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》，并取得河北醫科大學第二醫院科研倫理委員會許可。大鼠眼部經裂隙燈顯微鏡和檢眼鏡檢查屈光間質清晰，眼底無病變。
隨機數字表法將大鼠分為空白對照組和模型組，分別7、35只大鼠；均雙眼入組。模型組大鼠激光光凝誘導CNV形成，建立動物模型。按體重0.35 ml/100 g的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，鹽酸丙美卡因滴眼液眼表麻醉，1.5 cm×3.0 cm載玻片作為角膜接觸鏡，采用Coherent Novus-Omni氪離子激光機（美國Coherent公司）進行激光光凝。激光參數：波長647 nm，光斑直徑50 μm，功率260 mW，曝光時間0.05 s，距視盤2～3個視盤直徑均勻光凝9～10個點，以氣泡產生或伴有輕度出血為擊破Bruch膜的標志[2]，記為有效光凝斑。空白對照組以及模型組大鼠光凝后3、7、14、21、28 d，隨機數字表法隨機選取2只大鼠行熒光素眼底血管造影（FFA）檢查。5%水合氯醛充分麻醉，復方托吡卡胺滴眼液散瞳，按體重0.5 ml/kg的劑量腹腔注射10%熒光素鈉，注射后立即行FFA檢查，同步動態觀察大鼠模型CNV的形成情況。以出現CNV光凝斑數量與光凝斑總數的比值（百分率）作為該時間段CNV發生率。
光凝后3、7、14、21、28 d，模型組大鼠隨機數字表法隨機選取2只大鼠行脈絡膜鋪片，測量CNV面積。麻醉同前并固定大鼠，經雙側頸總動脈注射異硫氰酸熒光素-右旋糖酐（相對分子質量2×106，美國Sigma公司）磷酸鹽緩沖液（PBS）1 ml。摘除眼球，置于固定液中固定1 h，沖洗后放入PBS，解剖顯微鏡下去除眼前節，仔細剝除視網膜神經層，以視盤為中心，行4～5條放射狀切口，將獲得的RPE-脈絡膜-鞏膜復合體平鋪于蓋玻片上，滴少量甘油封片。激光共聚焦顯微鏡對CNV進行觀察和測量。
蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測CNV中Rap1、鳥苷三磷酸（GTP）-Rap1、VEGF、β-連環蛋白（catenin）蛋白表達。光凝后3、7、14、21、28 d，隨機數字表法隨機選取空白對照組和模型組大鼠2只，摘除眼球，分離RPE-脈絡膜-鞏膜復合體。取CNV病變區域20 mg組織加入200～400 μl裂解液，提取總蛋白，Bradford法測定樣本蛋白含量。制備十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳膠分離蛋白，隨后將蛋白質轉移至甲醇激活的聚偏氟乙烯膜，室溫封閉 1 h，一抗4 ℃反應過夜，1倍洗膜緩沖液（TBST）洗滌3次，10 min/次，將洗滌后的一抗反應膜放入二抗工作液（1:3000）中，室溫避光緩慢搖動作用60 min，1倍TBST洗膜，進行化學發光反應、顯影及定影。以等量β-肌動蛋白（actin）作為對照，將膠片進行掃描。重復4次，Image J軟件分析灰度值。
實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT- PCR） 檢測CNV中Rap1、GTP-Rap1、VEGF、β-catenin mRNA的表達。處死空白對照組、模型組各剩余大鼠3只，超純RNA提取試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581）提取視網膜、脈絡膜總RNA，5 μl RNA 1%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測RNA完整性。HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒（Cat#CW0744）進行逆轉錄，65 ℃孵育5 min，冰浴2 min，離心。加入5倍逆轉錄緩沖液4 μl、0.1 mol/L二硫蘇糖醇2 μl、10.0 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸1 μl、HiFi-MMLV酶混合物1 μl，混勻，37 ℃孵育50 min，70 ℃保溫10 min，?20 ℃冰箱保存。應用Primer5.0軟件設計引物（表1）。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火60 s。重復40個循環后形成擴增曲線，記錄循環閾值（Ct值），以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。
表1
Rap1、GTP-Rap1、VEGF、β-catenin基因擴增和測序引物
采用SPSS19.0軟件進行統計分析。數據進行正態性和方差齊性檢驗，符合正態分布和方差齊性時采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差法檢驗；方差不齊時，采用非參數軼和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
FFA檢查結果顯示，空白對照組大鼠視網膜血管熒光充盈良好，血管結構清晰（圖1A）。模型組大鼠光凝后3 d，13%（14/109）的光凝斑早期為弱熒光，晚期呈云霧狀強熒光，無明顯熒光素滲漏（圖1B）；7 d，58%（63/109）的光凝斑出現輕度熒光素滲漏（圖1C）；14 d，72%（78/108）的光凝斑出現大片圓盤狀熒光素滲漏（圖1D）；21 d，79%（85/107）的光凝斑熒光素滲漏達最高峰（圖1E）；28 d，75 %（81/108）的光凝斑熒光素滲漏無明顯增加（圖1F）。
圖1
空白對照組和模型組大鼠光凝后不同時間點FFA像。1A. 空白對照組，視網膜血管熒光充盈良好，血管結構清晰；1B. 光凝后3 d，隱約可見光凝部位類圓形熒光素滲漏（黑箭）；1C. 光凝后7 d，可見圓盤狀熒光素滲漏（黑箭），較光凝后3 d強度增加；1D. 光凝后14 d，出現多處圓盤狀熒光素滲漏（黑箭）；1E. 光凝后21 d，有熒光素滲漏的光凝斑（黑箭）較前增多；1F. 光凝后28 d，熒光素滲漏較前穩定，無明顯變化（黑箭）
激光共聚焦顯微鏡觀察發現，光凝后7 d，光凝斑周圍可見CNV生長；14 d時，CNV明顯增加（圖2A）；21 d，可見CNV面積延伸并擴大，如花朵樣從底部向上擴張，呈寬闊的扁平血管網（圖2B）；28 d，形成較穩定的新生血管網。光凝后3、7、14、21、28 d，CNV面積分別為（11.54±4.12）、（26.57±1.82）、（35.47±2.77）、（36.03±4.02）×103 μm2。與光凝后7 d時CNV面積比較，光凝后14、21、28 d時CNV面積增加，差異均有統計學意義（t=3.725、5.532、3.605，P＜0.05）；光凝后14、21、28 d之間CNV面積比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
圖2
模型組大鼠光凝后14、21 d CNV激光共聚集顯微鏡像。2A：光凝后14 d，CNV表現為不規則形態的強熒光微血管網；2B. 光凝后21 d，CNV面積較光凝后14 d顯著增大 ×100
Western blot檢測結果顯示，與空白對照組比較，光凝后3、7、14、21、28 d，CNV中Rap1蛋白相對表達量差異均無統計學意義（P=0.645）；GTP-Rap1蛋白相對表達量顯著降低，差異有統計學意義（P=0.000），且不同時間點呈下降趨勢；VEGF蛋白相對表達量顯著升高，差異有統計學意義（P=0.000），且于光凝后7、14 d明顯升高，21 d達到峰值，28 d無顯著變化；β-catenin蛋白相對表達量明顯增高，差異有統計學意義（P=0.000）（圖3）。
圖3
空白對照組和模型組大鼠光凝后不同時間CNV中Rap1、GTP-Rap1、VEGF、β-catenin蛋白表達情況。3A.電泳圖；3B.分別為CNV中Rap1、GTP-Rap1、VEGF、β-catenin蛋白表達結果。1.空白對照組；2～6. 分別為模型組大鼠光凝后3、7、14、21、28 d。*P＜0.05
RT-PCR檢測結果顯示，與空白對照組比較，光凝后3、7、14、21、28 d，CNV中Rap1 mRNA相對表達量差異無統計學意義（P=0.156）；β-catenin mRNA相對表達量差異均有統計學意義（P=0.000）。7、14、21、28 d，GTP-Rap1、VEGF mRNA相對表達量差異均有統計學意義（P=0.000）；3 d，差異無統計學意義（P=0.000）（圖4）。
圖4
空白對照組和模型組大鼠光凝后不同時間點CNV中Rap1、GTP-Rap1、VEGF、β-catenin mRNA表達結果。1.空白對照組；2～6.分別為模型組光凝后3、7、14、21、28 d。*P＜0.05
3 討論
CNV是因新生血管管壁結構異常，導致血管滲漏、出血而引起的繼發性病理改變[3, 4]。CNV形成是老年性黃斑變性（AMD）的主要病理特征。研究發現，AMD、糖尿病視網膜病變等均可導致RPE損傷及失代償[5]。RPE細胞間的緊密連接與粘附連接，使RPE有效阻止了視網膜與脈絡膜之間某些物質的自由轉換，起到分子“開關”的作用。增強RPE屏障完整性，可降低血管通透性，抑制脈絡膜內皮細胞遷移[6]。但在CNV發病機制研究中，如何增強RPE屏障完整性的報道甚少。
研究發現，屬于Ras超家族的小分子G蛋白Rap1，對細胞運動和連接形成具有重要調節作用，可參與調節上皮細胞間和內皮細胞間緊密連接與粘附連接形成，從而影響屏障功能的完整性[1]。小分子G蛋白能在與GTP結合的活化形式和與鳥苷二磷酸結合的非活化形式之間快速轉變，影響Actin細胞骨架重塑，參與調節細胞連接，進而對屏障功能的完整性起到快速微調作用[7, 8]，即Rap1參與調節上皮細胞和內皮細胞緊密連接與粘附連接的形成，并對屏障功能的維持具有一定作用。
RBCC的完整性在CNV的形成發展中起到重要作用，并且Rap1對屏障功能的完整性具有干預作用，Rap1與CNV的發生發展的相關性研究尚少。本研究結果顯示，光凝后不同時間點模型組大鼠CNV中Rap1表達與空白對照組比較，差異均無統計學意義；而GTP-Rap1表達較空白對照組減少，VEGF表達增多。結果說明，Rap1的活性與RPE屏障完整性、VEGF表達以及CNV形成之間密切相關。同時，Rap1在CNV發生發展過程中具體的作用機制仍需進一步深入研究。
RPE細胞間的粘附連接決定RPE屏障的變化，屬于上皮細胞的粘附連接[9-12]。RPE屏障完整性發生破壞時，粘附連接受損，相應的抑制束縛瓦解，使得β-catenin成為游離分子后被其他的復合體磷酸化，最終在細胞核表達[13]。因此，隨著CNV的發生發展，β-catenin的表達量呈上升趨勢。
β-catenin作為Wnt/β-catenin信號通路的關鍵分子，其核轉位必然影響Wnt信號通路。β-catenin信號通路在細胞的增生、分化、凋亡、遷移中發揮重要調控作用，參與炎癥、血管新生、纖維化及癌癥等多種生理及病理過程[14-18]。本研究結果顯示，光凝后不同時間，模型組大鼠CNV中β-catenin的表達水平均較空白對照組明顯升高。激光誘導的CNV使Bruch破裂進而RPE屏障功能破壞，細胞間粘附連接隨之受損，繼而引起E-cadherin的表達缺失，β-catenin被釋放，表達含量增多。同時，實驗性CNV中RPE細胞的Wnt/β-catenin信號通路呈現出異常激活的狀態，β-catenin的表達必然增多，上調炎癥、氧化應激因子以及促血管因子的表達，誘導CNV的發生[19]。
Rap1具有兩種亞型Rap1A和Rap1B，兩者具有90%的同源性，雖然分別位于不同的染色體上，卻只有9個氨基酸組成不同[20]。本研究觀察到活化的Rap1與CNV形成密切相關，但是Rap1兩種亞型的具體作用并不清楚。體外研究利用短發夾RNA分別使RPE細胞的Rap1A和Rap1B基因沉默，發現與Rap1B沉默相比，抑制Rap1A更能使RPE單層細胞間隙增寬，說明Rap1A亞型對于保持穩定狀態下細胞間連接及屏障功能的完整性更為重要[4]。Adijanto等[21]運用鈣開關實驗誘導屏障的動態變化，發現Rap1B主要負責動態應答，對細胞連接的瓦解后重組具有更重要的作用，可以推測在RPE屏障受損時，Rap1B在CEC穿過RPE層入侵到視網膜神經感覺層中發揮關鍵的調控作用。另外，Wang等[22]發現在體外培養RPE細胞中，通過不同機制激活各個亞型有助于維持RPE屏障完整性。Rap1A限制了RPE細胞連接的分解，而Rap1B促進了RPE細胞連接的重組。Rap1A可破壞RPE細胞附著的連接復合體，并與還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶亞基P22phox相互作用阻止NADPH氧化酶的活化，從而減少活性氧的產生。總之，在激光誘導的CNV模型中RPE屏障受到損害，靶向恢復RPE屏障的完整性治療CNV需要促進RPE細胞間連接重組。而活化的Rap1抑制實驗性CNV形成過程中是否主要依賴于Rap1B起主要作用，并且RAP1A跟Rap1B的效應機制如何，仍需后續研究進一步深入探究。
血管生成抑制劑包括阻斷VEGF活性是治療CNV的有效方法。但VEGF同時也是神經保護劑和內皮細胞的存活因子，在抑制CNV形成的同時，也會影響其有利作用的發揮。本研究觀察了Rap1、GTP-Rap1、VEGF和β-catenin在實驗性CNV中的表達，發現GTP-Rap1與CNV發生發展密切相關。為今后以Rap1為靶向鞏固RPE屏障的完整性提供研究基礎，為CNV臨床治療提供新思路。但GTP-Rap1抑制CNV發生發展的作用機制以及聯合VEGF抑制劑作用于實驗性CNV，是否可以起到事半功倍的效果，需要在后續的工作中研究闡述。
脈絡膜新生血管（CNV）的形成離不開脈絡膜毛細血管內皮細胞（CEC）的活化、Bruch膜的破壞與視網膜色素上皮（RPE）層的遷移。因此，RPE-Bruch膜-脈絡膜毛細血管復合體（RBCC）的完整性在CNV的形成發展中起至關重要的作用。研究發現，Ras超家族的小分子G蛋白Rap1，不僅可調節整合素介導的細胞基質黏附及細胞遷移，還對細胞間連接的完整性具有重要作用，Rap1可參與調節上皮細胞和內皮細胞間緊密連接與粘附連接的形成，一定程度上影響屏障功能的完整性[1]。因此，我們推斷Rap1對屏障功能的維持可能具有協調作用。本研究通過觀察激光誘導的CNV中Rap1及相關因子的表達情況，探討Rap1及相關因子與CNV發生發展的相關性。
1 材料和方法
健康雄性棕色挪威大鼠42只，8～10周齡，體重200～220 g，購自北京維通利華試驗動物技術有限公司，于河北醫科大學第二醫院動物實驗中心正常飼養。實驗動物的管理和使用符合國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》，并取得河北醫科大學第二醫院科研倫理委員會許可。大鼠眼部經裂隙燈顯微鏡和檢眼鏡檢查屈光間質清晰，眼底無病變。
隨機數字表法將大鼠分為空白對照組和模型組，分別7、35只大鼠；均雙眼入組。模型組大鼠激光光凝誘導CNV形成，建立動物模型。按體重0.35 ml/100 g的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，鹽酸丙美卡因滴眼液眼表麻醉，1.5 cm×3.0 cm載玻片作為角膜接觸鏡，采用Coherent Novus-Omni氪離子激光機（美國Coherent公司）進行激光光凝。激光參數：波長647 nm，光斑直徑50 μm，功率260 mW，曝光時間0.05 s，距視盤2～3個視盤直徑均勻光凝9～10個點，以氣泡產生或伴有輕度出血為擊破Bruch膜的標志[2]，記為有效光凝斑。空白對照組以及模型組大鼠光凝后3、7、14、21、28 d，隨機數字表法隨機選取2只大鼠行熒光素眼底血管造影（FFA）檢查。5%水合氯醛充分麻醉，復方托吡卡胺滴眼液散瞳，按體重0.5 ml/kg的劑量腹腔注射10%熒光素鈉，注射后立即行FFA檢查，同步動態觀察大鼠模型CNV的形成情況。以出現CNV光凝斑數量與光凝斑總數的比值（百分率）作為該時間段CNV發生率。
光凝后3、7、14、21、28 d，模型組大鼠隨機數字表法隨機選取2只大鼠行脈絡膜鋪片，測量CNV面積。麻醉同前并固定大鼠，經雙側頸總動脈注射異硫氰酸熒光素-右旋糖酐（相對分子質量2×106，美國Sigma公司）磷酸鹽緩沖液（PBS）1 ml。摘除眼球，置于固定液中固定1 h，沖洗后放入PBS，解剖顯微鏡下去除眼前節，仔細剝除視網膜神經層，以視盤為中心，行4～5條放射狀切口，將獲得的RPE-脈絡膜-鞏膜復合體平鋪于蓋玻片上，滴少量甘油封片。激光共聚焦顯微鏡對CNV進行觀察和測量。
蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測CNV中Rap1、鳥苷三磷酸（GTP）-Rap1、VEGF、β-連環蛋白（catenin）蛋白表達。光凝后3、7、14、21、28 d，隨機數字表法隨機選取空白對照組和模型組大鼠2只，摘除眼球，分離RPE-脈絡膜-鞏膜復合體。取CNV病變區域20 mg組織加入200～400 μl裂解液，提取總蛋白，Bradford法測定樣本蛋白含量。制備十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳膠分離蛋白，隨后將蛋白質轉移至甲醇激活的聚偏氟乙烯膜，室溫封閉 1 h，一抗4 ℃反應過夜，1倍洗膜緩沖液（TBST）洗滌3次，10 min/次，將洗滌后的一抗反應膜放入二抗工作液（1:3000）中，室溫避光緩慢搖動作用60 min，1倍TBST洗膜，進行化學發光反應、顯影及定影。以等量β-肌動蛋白（actin）作為對照，將膠片進行掃描。重復4次，Image J軟件分析灰度值。
實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT- PCR） 檢測CNV中Rap1、GTP-Rap1、VEGF、β-catenin mRNA的表達。處死空白對照組、模型組各剩余大鼠3只，超純RNA提取試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581）提取視網膜、脈絡膜總RNA，5 μl RNA 1%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測RNA完整性。HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒（Cat#CW0744）進行逆轉錄，65 ℃孵育5 min，冰浴2 min，離心。加入5倍逆轉錄緩沖液4 μl、0.1 mol/L二硫蘇糖醇2 μl、10.0 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸1 μl、HiFi-MMLV酶混合物1 μl，混勻，37 ℃孵育50 min，70 ℃保溫10 min，?20 ℃冰箱保存。應用Primer5.0軟件設計引物（表1）。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火60 s。重復40個循環后形成擴增曲線，記錄循環閾值（Ct值），以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。
表1
Rap1、GTP-Rap1、VEGF、β-catenin基因擴增和測序引物
采用SPSS19.0軟件進行統計分析。數據進行正態性和方差齊性檢驗，符合正態分布和方差齊性時采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差法檢驗；方差不齊時，采用非參數軼和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
FFA檢查結果顯示，空白對照組大鼠視網膜血管熒光充盈良好，血管結構清晰（圖1A）。模型組大鼠光凝后3 d，13%（14/109）的光凝斑早期為弱熒光，晚期呈云霧狀強熒光，無明顯熒光素滲漏（圖1B）；7 d，58%（63/109）的光凝斑出現輕度熒光素滲漏（圖1C）；14 d，72%（78/108）的光凝斑出現大片圓盤狀熒光素滲漏（圖1D）；21 d，79%（85/107）的光凝斑熒光素滲漏達最高峰（圖1E）；28 d，75 %（81/108）的光凝斑熒光素滲漏無明顯增加（圖1F）。
圖1
空白對照組和模型組大鼠光凝后不同時間點FFA像。1A. 空白對照組，視網膜血管熒光充盈良好，血管結構清晰；1B. 光凝后3 d，隱約可見光凝部位類圓形熒光素滲漏（黑箭）；1C. 光凝后7 d，可見圓盤狀熒光素滲漏（黑箭），較光凝后3 d強度增加；1D. 光凝后14 d，出現多處圓盤狀熒光素滲漏（黑箭）；1E. 光凝后21 d，有熒光素滲漏的光凝斑（黑箭）較前增多；1F. 光凝后28 d，熒光素滲漏較前穩定，無明顯變化（黑箭）
激光共聚焦顯微鏡觀察發現，光凝后7 d，光凝斑周圍可見CNV生長；14 d時，CNV明顯增加（圖2A）；21 d，可見CNV面積延伸并擴大，如花朵樣從底部向上擴張，呈寬闊的扁平血管網（圖2B）；28 d，形成較穩定的新生血管網。光凝后3、7、14、21、28 d，CNV面積分別為（11.54±4.12）、（26.57±1.82）、（35.47±2.77）、（36.03±4.02）×103 μm2。與光凝后7 d時CNV面積比較，光凝后14、21、28 d時CNV面積增加，差異均有統計學意義（t=3.725、5.532、3.605，P＜0.05）；光凝后14、21、28 d之間CNV面積比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。
圖2
模型組大鼠光凝后14、21 d CNV激光共聚集顯微鏡像。2A：光凝后14 d，CNV表現為不規則形態的強熒光微血管網；2B. 光凝后21 d，CNV面積較光凝后14 d顯著增大 ×100
Western blot檢測結果顯示，與空白對照組比較，光凝后3、7、14、21、28 d，CNV中Rap1蛋白相對表達量差異均無統計學意義（P=0.645）；GTP-Rap1蛋白相對表達量顯著降低，差異有統計學意義（P=0.000），且不同時間點呈下降趨勢；VEGF蛋白相對表達量顯著升高，差異有統計學意義（P=0.000），且于光凝后7、14 d明顯升高，21 d達到峰值，28 d無顯著變化；β-catenin蛋白相對表達量明顯增高，差異有統計學意義（P=0.000）（圖3）。
圖3
空白對照組和模型組大鼠光凝后不同時間CNV中Rap1、GTP-Rap1、VEGF、β-catenin蛋白表達情況。3A.電泳圖；3B.分別為CNV中Rap1、GTP-Rap1、VEGF、β-catenin蛋白表達結果。1.空白對照組；2～6. 分別為模型組大鼠光凝后3、7、14、21、28 d。*P＜0.05
RT-PCR檢測結果顯示，與空白對照組比較，光凝后3、7、14、21、28 d，CNV中Rap1 mRNA相對表達量差異無統計學意義（P=0.156）；β-catenin mRNA相對表達量差異均有統計學意義（P=0.000）。7、14、21、28 d，GTP-Rap1、VEGF mRNA相對表達量差異均有統計學意義（P=0.000）；3 d，差異無統計學意義（P=0.000）（圖4）。
圖4
空白對照組和模型組大鼠光凝后不同時間點CNV中Rap1、GTP-Rap1、VEGF、β-catenin mRNA表達結果。1.空白對照組；2～6.分別為模型組光凝后3、7、14、21、28 d。*P＜0.05
3 討論
CNV是因新生血管管壁結構異常，導致血管滲漏、出血而引起的繼發性病理改變[3, 4]。CNV形成是老年性黃斑變性（AMD）的主要病理特征。研究發現，AMD、糖尿病視網膜病變等均可導致RPE損傷及失代償[5]。RPE細胞間的緊密連接與粘附連接，使RPE有效阻止了視網膜與脈絡膜之間某些物質的自由轉換，起到分子“開關”的作用。增強RPE屏障完整性，可降低血管通透性，抑制脈絡膜內皮細胞遷移[6]。但在CNV發病機制研究中，如何增強RPE屏障完整性的報道甚少。
研究發現，屬于Ras超家族的小分子G蛋白Rap1，對細胞運動和連接形成具有重要調節作用，可參與調節上皮細胞間和內皮細胞間緊密連接與粘附連接形成，從而影響屏障功能的完整性[1]。小分子G蛋白能在與GTP結合的活化形式和與鳥苷二磷酸結合的非活化形式之間快速轉變，影響Actin細胞骨架重塑，參與調節細胞連接，進而對屏障功能的完整性起到快速微調作用[7, 8]，即Rap1參與調節上皮細胞和內皮細胞緊密連接與粘附連接的形成，并對屏障功能的維持具有一定作用。
RBCC的完整性在CNV的形成發展中起到重要作用，并且Rap1對屏障功能的完整性具有干預作用，Rap1與CNV的發生發展的相關性研究尚少。本研究結果顯示，光凝后不同時間點模型組大鼠CNV中Rap1表達與空白對照組比較，差異均無統計學意義；而GTP-Rap1表達較空白對照組減少，VEGF表達增多。結果說明，Rap1的活性與RPE屏障完整性、VEGF表達以及CNV形成之間密切相關。同時，Rap1在CNV發生發展過程中具體的作用機制仍需進一步深入研究。
RPE細胞間的粘附連接決定RPE屏障的變化，屬于上皮細胞的粘附連接[9-12]。RPE屏障完整性發生破壞時，粘附連接受損，相應的抑制束縛瓦解，使得β-catenin成為游離分子后被其他的復合體磷酸化，最終在細胞核表達[13]。因此，隨著CNV的發生發展，β-catenin的表達量呈上升趨勢。
β-catenin作為Wnt/β-catenin信號通路的關鍵分子，其核轉位必然影響Wnt信號通路。β-catenin信號通路在細胞的增生、分化、凋亡、遷移中發揮重要調控作用，參與炎癥、血管新生、纖維化及癌癥等多種生理及病理過程[14-18]。本研究結果顯示，光凝后不同時間，模型組大鼠CNV中β-catenin的表達水平均較空白對照組明顯升高。激光誘導的CNV使Bruch破裂進而RPE屏障功能破壞，細胞間粘附連接隨之受損，繼而引起E-cadherin的表達缺失，β-catenin被釋放，表達含量增多。同時，實驗性CNV中RPE細胞的Wnt/β-catenin信號通路呈現出異常激活的狀態，β-catenin的表達必然增多，上調炎癥、氧化應激因子以及促血管因子的表達，誘導CNV的發生[19]。
Rap1具有兩種亞型Rap1A和Rap1B，兩者具有90%的同源性，雖然分別位于不同的染色體上，卻只有9個氨基酸組成不同[20]。本研究觀察到活化的Rap1與CNV形成密切相關，但是Rap1兩種亞型的具體作用并不清楚。體外研究利用短發夾RNA分別使RPE細胞的Rap1A和Rap1B基因沉默，發現與Rap1B沉默相比，抑制Rap1A更能使RPE單層細胞間隙增寬，說明Rap1A亞型對于保持穩定狀態下細胞間連接及屏障功能的完整性更為重要[4]。Adijanto等[21]運用鈣開關實驗誘導屏障的動態變化，發現Rap1B主要負責動態應答，對細胞連接的瓦解后重組具有更重要的作用，可以推測在RPE屏障受損時，Rap1B在CEC穿過RPE層入侵到視網膜神經感覺層中發揮關鍵的調控作用。另外，Wang等[22]發現在體外培養RPE細胞中，通過不同機制激活各個亞型有助于維持RPE屏障完整性。Rap1A限制了RPE細胞連接的分解，而Rap1B促進了RPE細胞連接的重組。Rap1A可破壞RPE細胞附著的連接復合體，并與還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶亞基P22phox相互作用阻止NADPH氧化酶的活化，從而減少活性氧的產生。總之，在激光誘導的CNV模型中RPE屏障受到損害，靶向恢復RPE屏障的完整性治療CNV需要促進RPE細胞間連接重組。而活化的Rap1抑制實驗性CNV形成過程中是否主要依賴于Rap1B起主要作用，并且RAP1A跟Rap1B的效應機制如何，仍需后續研究進一步深入探究。
血管生成抑制劑包括阻斷VEGF活性是治療CNV的有效方法。但VEGF同時也是神經保護劑和內皮細胞的存活因子，在抑制CNV形成的同時，也會影響其有利作用的發揮。本研究觀察了Rap1、GTP-Rap1、VEGF和β-catenin在實驗性CNV中的表達，發現GTP-Rap1與CNV發生發展密切相關。為今后以Rap1為靶向鞏固RPE屏障的完整性提供研究基礎，為CNV臨床治療提供新思路。但GTP-Rap1抑制CNV發生發展的作用機制以及聯合VEGF抑制劑作用于實驗性CNV，是否可以起到事半功倍的效果，需要在后續的工作中研究闡述。
