引用本文： 田敏, 吳進川, 何薇, 余曦, 呂紅彬. 叔丁基對苯二酚對高糖培養視網膜Müller細胞核因子E2相關因子2、血紅素氧合酶1和磷脂酰肌醇-3激酶表達的影響. 中華眼底病雜志, 2018, 34(4): 382-387. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.04.015 復制
糖尿病視網膜病變（DR）發病機制包括氧化應激、細胞凋亡等多方面[1]。核因子E2相關因子2（Nrf2）信號通路是迄今為止發現的最為重要的內源性抗氧化應激通路，其可轉入細胞核內與抗氧化反應元件（ARE）結合并啟動血紅素氧合酶1（HO-1）等下游抗氧化因子轉錄，減輕氧化應激損傷[2]。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路在DR中發揮重要作用[3]，是細胞存活途徑的主要調節因子[4]，其激活可以導致抗凋亡成員B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）增加和促凋亡蛋白Bax的水平降低[5-7]。叔丁基對苯二酚（tBHQ）為Ⅱ相酶誘導劑，是Nrf2/ARE信號通路的強誘導劑。并且也有研究發現tBHQ可以刺激PI3K依賴性Akt磷酸化，上調Nrf2介導的抗氧化應答元件的活性[8, 9]。我們前期研究發現，tBHQ能通過激活Nrf2/ARE信號通路，減輕2型糖尿病大鼠模型視網膜氧化應激損傷，減少視網膜血管增生，抑制視網膜細胞凋亡[10-13]。為此，本研究應用tBHQ預處理高糖環境下大鼠視網膜Müller細胞，觀察tBHQ對高糖環境下大鼠視網膜Müller細胞中Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax表達的影響，初步探討Ⅱ相酶誘導劑tBHQ對大鼠視網膜Müller細胞的保護作用及相關機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
Sprague-Dawley大鼠視網膜Müller細胞由武漢生命科技股份有限公司提供。兔抗大鼠谷氨酰胺合成酶（GS）單克隆抗體、兔抗Nrf2多克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（英國Abcam公司）；異硫氰酸熒光素（FITC）偶聯的山羊抗兔二抗、RIPA總蛋白裂解液、BCA蛋白質濃度測定試劑盒、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（武漢阿斯本生物技術有限公司）；兔抗HO-1多克隆抗體（美國Affbiotech公司）；兔抗PI3K多克隆抗體（美國CST公司），兔抗Bax多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司），PrimeScriptTMRT試劑盒（日本TaKaRa公司）；錨定蛋白（Annexin V）-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（天津三箭生物技術有限公司）。
參照文獻[14]的方法培養并鑒定Müller細胞，取第2～4代細胞進行實驗。按照培養液的葡萄糖濃度分為正常糖組（N組，5.5 mmol/L葡萄糖），高糖組（HG組，45.0 mmol/L葡萄糖）及tBHQ干預組（HG+tBHQ組）。參照文獻[15]方法在HG+tBHQ組視網膜Müller細胞培養48 h后，加入tBHQ 20 μmol/L干預處理48 h。
免疫熒光染色法鑒定Müller細胞，GS抗體和DAPI染色觀察Müller細胞形態。采用胰蛋白酶消化第2代對數生長期的Müller細胞，將Müller細胞用4%多聚甲醛固定在蓋玻片上15 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌5 min。室溫下封閉工作流體處理蓋玻片10 min。PBS洗滌5 min，山羊血清室溫下封閉15 min。細胞與GS抗體在4℃溫育過夜。PBS洗滌蓋玻片，與FITC偶聯的山羊抗兔二抗在室溫下孵育50 min。PBS洗滌后，DAPI染色5 min，PBS洗滌3次，滴加適量的抗熒光淬滅劑于Müller細胞上，熒光顯微鏡下觀察。
蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測各組Müller細胞中Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白的表達。胰蛋白酶消化第2代對數生長期的Müller細胞，低速離心收集細胞，裂解液沖洗抽提蛋白，4 ℃ 13 000 g離心5 min，收集上清，每孔40 μg蛋白加上樣緩沖液后煮沸5 min，12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酞胺凝膠電泳，轉至聚偏氟乙烯膜，封閉。加入兔抗鼠Nrf2一抗（1∶1000），HO-1一抗（1∶2000），PI3K一抗（1∶3000），Bcl-2一抗（1∶1000）和Bax一抗（1∶1000）4 ℃孵育過夜，洗滌后加羊抗兔二抗（1∶3000），室溫孵育30 min，洗滌后加入新鮮配制的增強化學發光混合溶液到膜的蛋白面側，暗室中曝光。膠片進行掃描存檔，AlphaEaseFC軟件處理系統分析目標條帶的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。以Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax和GAPDH的比值作為各蛋白的相對表達量。
參照文獻[16]方法，實時熒光定量聚合酶鏈（qRT-PCR）檢測各組Müller細胞中Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax mRNA的表達。Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax、GAPDH引物長度分別為294、290、262、214、148、210堿基對（bp）。72～95 ℃，每上升0.5 ℃取1次熒光值，最后生成溶解曲線，所有的樣本均重復檢測3次，最后計算出Ct值。各因子的表達量采用△△Ct方法進行計算分析，即通過計算目的基因相對于參照因子的倍數來比較mRNA的表達差異，管家基因GAPDH作為內參基因。△△Ct=（待測樣品目的基因的Ct平均值?待測樣本內參基因的Ct平均值）?（對照樣品目的基因的Ct平均值）。目的基因的相對拷貝量F=2?△△Ct。
參照文獻[17]方法，流式細胞儀檢測各組Müller細胞的凋亡率。采用15 mW氬離子激光，激發光波長為488 nm，發射波長530 nm，CEL LQuest軟件自動獲取1×104個細胞樣品。流式細胞儀定量分析，計算Annexin V-FITC及碘化丙啶（PI）雙染陽性細胞百分比含量。
SPSS17.0軟件行統計學處理。結果以均數±標準差（
±s）表示。相同指標多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著差法檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
熒光顯微鏡觀察發現，95%以上Müller細胞GS染色陽性；細胞體大，細胞漿豐富，綠色熒光均勻一致；細胞核DAPI染色呈圓形或卵圓形，邊界清晰，藍色熒光均勻一致（圖1）。
Western blot檢測結果顯示，N組、HG組、HG+tBHQ組Müller細胞中Nrf2（F=73.831）、HO-1（F=148.618）、PI3K（F=83.540）、Bcl-2（F=150.381）、Bax（F=234.459）蛋白表達比較，差異均有統計學意義（P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000）。 HG組Müller細胞中Nrf2（t=4.114）、HO-1（t=9.275）蛋白表達較N組升高，差異有統計學意義（P=0.006、0.000）。HG+tBHQ組Müller細胞中Nrf2（t=7.847）、HO-1（t=7.947）、PI3K（t=5.397）、Bcl-2（t=6.825）蛋白表達較HG組升高，差異有統計學意義（P=0.000、0.000、0.002、0.000）；Bax蛋白表達較HG組降低，差異有統計學意義（t=14.998、P=0.000）（圖2）。
圖2
N組、HG組、HG+tBHQ組Müller細胞中Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白表達情況。2A. 電泳圖；2B. Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白表達結果。* HG組與N組比較，P＜0.05；# HG+tBHQ組與HG組比較，P＜0.05
qRT-PCR檢測結果顯示，N組、HG組、HG+tBHQ組Müller細胞中Nrf2（F=340.317）、HO-1（F=1 582.911）、PI3K（F=81.807）、Bcl-2（F=133.630）、Bax（F=283.850）mRNA比較，差異有統計學意義（P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000）。 HG組Müller細胞中Nrf2（t=7.292）、HO-1（t=15.014）較N組升高，差異有統計學意義（P=0.000、0.000）。HG+tBHQ組Müller細胞中Nrf2（t=18.046）、HO-1（t=39.458）、PI3K（t=4.979）、Bcl-2（t=9.535）mRNA較HG組升高，差異有統計學意義（P=0.000、0.000、0.003、0.000）；Bax mRNA較HG組降低，差異有統計學意義（t=16.520、P=0.000）（圖3）。
圖3
N組、HG組、HG+tBHQ組Müller細胞中Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax mRNA表達情況。 * HG組與N組比較，P＜0.05；# HG+tBHQ組與HG組比較，P＜0.05
流式細胞儀檢測結果顯示，N組、HG組、HG+tBHQ組Müller細胞的凋亡率分別為（3.95±0.68）%、（39.77±1.76）%、（20.84±0.23）%。三組Müller細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（F=797.079、P=0.000）。HG組Müller細胞凋亡率較N組增高，差異有統計學意義（t=39.905、P=0.000）；HG+tBHQ組Müller細胞凋亡率較HG組降低，差異均有統計學意義（t=21.083、P=0.000）（圖4）。
圖4
Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞儀檢測N組、HG組、HG+tBHQ組Müller細胞凋亡情況。4A.三組Müller細胞凋亡結果；4B.三組Müller細胞凋亡率比較。* HG組與N組比較，P＜0.05；# HG+tBHQ組與HG組比較，P＜0.05
3 討論
目前已經發現Nrf2在人視網膜Müller細胞中表達[18]，同時也發現DR患者視網膜中Nrf2表達增加[19]。本研究結果發現，N組Müller細胞中Nrf2表達，HG組Nrf2表達增加。Nrf2可調節直接和間接抗氧化，間接酶包括HO-1[20-22]。本研究結果表明，高糖條件下，Müller細胞中Nrf2及其下游抗氧化蛋白HO-1的表達增加，說明此時Müller細胞有助于維持細胞氧化還原狀態并防止氧化。既往部分研究發現，盡管糖尿病環境中Nrf2表達增加，但其在細胞核中的表達水平和DNA結合活性卻低于正常水平[19]。表明雖然在糖尿病環境中細胞產生更多的Nrf2，導致Nrf2產量增加，但是不能到達細胞核以增強轉錄機制。
本研究結果發現，tBHQ干預進一步增加了Nrf2和HO-1在Müller細胞中的表達，與Zhong等[19]結果一致。Zhong等[19]發現，tBHQ在高糖條件下干預牛視網膜內皮細胞，可以激活Nrf2活性。其他一些研究也發現，tBHQ在體內通過促進Nrf2蛋白入細胞核，繼而激活Nrf2-ARE信號通路，啟動HO-1基因的表達[23,24]。上述結果均表明，tBHQ可以通過增加Nrf2和HO-1的活性發揮Müller細胞的抗氧化功能。
PI3K/Akt通路在DR中發揮重要作用，糖尿病大鼠視網膜中PI3K，Akt-1和Akt-3活性喪失[3]。本研究結果也發現高糖環境下，大鼠Müller細胞中PI3K表達降低。PI3K/Akt途徑是細胞存活途徑的主要調節因子[4]。該途徑的激活可以導致Bcl-2家族的抗凋亡成員增加和促凋亡蛋白的水平降低[5-7]。作為Bcl-2家族成員，抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax在線粒體途徑中天生平衡，并且這種平衡可以決定糖尿病刺激后Müller細胞的存活或死亡[25-29]。越來越多的證據表明，高血糖導致Müller細胞死亡是通過細胞凋亡實現[30,31]。本研究結果顯示，高糖條件下Müller細胞Bcl-2表達下降，Bax表達增加；表明高糖環境下Müller細胞凋亡程序激活。 PI3K/Akt途徑也調控Nrf2介導的抗氧化功能[32,33]。已經有研究發現，PI3K參與Nrf2的解離和核轉運以影響其下游的氧化應激產物[34]。tBHQ可以刺激PI3k依賴性Akt磷酸化，上調Nrf2介導的抗氧化應答元件的活性[8,9]。本研究結果顯示，tBHQ誘導干預后，PI3K，Nrf2和Bcl- 2表達升高，Bax表達降低；提示tBHQ可能通過激活PI3K-Nrf2途徑抑制Müller細胞的凋亡。既往有研究發現，褪黑激素是一種理想的抗氧化藥物，褪黑激素在DR中通過激活Müller細胞中的PI3K/Akt-Nrf2信號通路，通過誘導HO-1的表達增強細胞抗氧化防御能力[35]。同時，我們的研究也發現，tBHQ干預后，HO-1隨著Nrf2表達的增加而增加；表明tBHQ可能通過激活PI3K-Nrf2途徑誘導HO-1的分泌，從而導致抗氧化應激和抗凋亡。同時有研究發現，tBHQ也可激活Nrf2-AREr3通路，誘導Bcl-2基因轉錄，下調Bax蛋白表達，起到抗氧化和抗凋亡的作用[36]。然而，也有部分研究發現，tBHQ確實能有效阻止肝細胞的死亡并抑制心肌細胞凋亡，但tBHQ的保護作用與Nrf2的激活無關，而與Akt的急性激活有關[37,38]。說明tBHQ的抗凋亡保護作用有可能是通過激活PI3K/Akt信號通路而起作用，而與Nrf2的激活無關。以上這些發現還需要進一步實驗進行驗證。
本研究參照文獻[15]的方法使用濃度為20 μmol/L tBHQ對高糖培養的Müller細胞干預48 h，發現tBHQ可誘導Müller細胞中各因子的變化。然而不同濃度的tBHQ及干預不同時間點可能會誘發各因子不一樣的表達，后期將進行進一步的研究。
本研究結果發現，高糖環境下Müller細胞產生更多的Nrf2和HO-1，雖然其產量增加，但不能到達細胞核以增強轉錄機制。tBHQ不僅能激活Nrf2和HO-1在Müller細胞中的表達以抗氧化反應，而且還通過激活PI3K信號通路來抑制Müller細胞的凋亡。 tBHQ也可能是通過激活PI3K-Nrf2途徑誘導HO-1分泌，從而抗氧化應激，抗凋亡作用。tBHQ在高糖環境下誘導Müller細胞中Nrf2、HO-1及PI3K的表達具有巨大的潛力，以保護Müller細胞免受氧化應激和凋亡的損傷，并且可能對未來治療DR具有重要的作用。
糖尿病視網膜病變（DR）發病機制包括氧化應激、細胞凋亡等多方面[1]。核因子E2相關因子2（Nrf2）信號通路是迄今為止發現的最為重要的內源性抗氧化應激通路，其可轉入細胞核內與抗氧化反應元件（ARE）結合并啟動血紅素氧合酶1（HO-1）等下游抗氧化因子轉錄，減輕氧化應激損傷[2]。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路在DR中發揮重要作用[3]，是細胞存活途徑的主要調節因子[4]，其激活可以導致抗凋亡成員B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）增加和促凋亡蛋白Bax的水平降低[5-7]。叔丁基對苯二酚（tBHQ）為Ⅱ相酶誘導劑，是Nrf2/ARE信號通路的強誘導劑。并且也有研究發現tBHQ可以刺激PI3K依賴性Akt磷酸化，上調Nrf2介導的抗氧化應答元件的活性[8, 9]。我們前期研究發現，tBHQ能通過激活Nrf2/ARE信號通路，減輕2型糖尿病大鼠模型視網膜氧化應激損傷，減少視網膜血管增生，抑制視網膜細胞凋亡[10-13]。為此，本研究應用tBHQ預處理高糖環境下大鼠視網膜Müller細胞，觀察tBHQ對高糖環境下大鼠視網膜Müller細胞中Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax表達的影響，初步探討Ⅱ相酶誘導劑tBHQ對大鼠視網膜Müller細胞的保護作用及相關機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
Sprague-Dawley大鼠視網膜Müller細胞由武漢生命科技股份有限公司提供。兔抗大鼠谷氨酰胺合成酶（GS）單克隆抗體、兔抗Nrf2多克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（英國Abcam公司）；異硫氰酸熒光素（FITC）偶聯的山羊抗兔二抗、RIPA總蛋白裂解液、BCA蛋白質濃度測定試劑盒、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（武漢阿斯本生物技術有限公司）；兔抗HO-1多克隆抗體（美國Affbiotech公司）；兔抗PI3K多克隆抗體（美國CST公司），兔抗Bax多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司），PrimeScriptTMRT試劑盒（日本TaKaRa公司）；錨定蛋白（Annexin V）-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（天津三箭生物技術有限公司）。
參照文獻[14]的方法培養并鑒定Müller細胞，取第2～4代細胞進行實驗。按照培養液的葡萄糖濃度分為正常糖組（N組，5.5 mmol/L葡萄糖），高糖組（HG組，45.0 mmol/L葡萄糖）及tBHQ干預組（HG+tBHQ組）。參照文獻[15]方法在HG+tBHQ組視網膜Müller細胞培養48 h后，加入tBHQ 20 μmol/L干預處理48 h。
免疫熒光染色法鑒定Müller細胞，GS抗體和DAPI染色觀察Müller細胞形態。采用胰蛋白酶消化第2代對數生長期的Müller細胞，將Müller細胞用4%多聚甲醛固定在蓋玻片上15 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌5 min。室溫下封閉工作流體處理蓋玻片10 min。PBS洗滌5 min，山羊血清室溫下封閉15 min。細胞與GS抗體在4℃溫育過夜。PBS洗滌蓋玻片，與FITC偶聯的山羊抗兔二抗在室溫下孵育50 min。PBS洗滌后，DAPI染色5 min，PBS洗滌3次，滴加適量的抗熒光淬滅劑于Müller細胞上，熒光顯微鏡下觀察。
蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測各組Müller細胞中Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白的表達。胰蛋白酶消化第2代對數生長期的Müller細胞，低速離心收集細胞，裂解液沖洗抽提蛋白，4 ℃ 13 000 g離心5 min，收集上清，每孔40 μg蛋白加上樣緩沖液后煮沸5 min，12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酞胺凝膠電泳，轉至聚偏氟乙烯膜，封閉。加入兔抗鼠Nrf2一抗（1∶1000），HO-1一抗（1∶2000），PI3K一抗（1∶3000），Bcl-2一抗（1∶1000）和Bax一抗（1∶1000）4 ℃孵育過夜，洗滌后加羊抗兔二抗（1∶3000），室溫孵育30 min，洗滌后加入新鮮配制的增強化學發光混合溶液到膜的蛋白面側，暗室中曝光。膠片進行掃描存檔，AlphaEaseFC軟件處理系統分析目標條帶的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。以Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax和GAPDH的比值作為各蛋白的相對表達量。
參照文獻[16]方法，實時熒光定量聚合酶鏈（qRT-PCR）檢測各組Müller細胞中Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax mRNA的表達。Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax、GAPDH引物長度分別為294、290、262、214、148、210堿基對（bp）。72～95 ℃，每上升0.5 ℃取1次熒光值，最后生成溶解曲線，所有的樣本均重復檢測3次，最后計算出Ct值。各因子的表達量采用△△Ct方法進行計算分析，即通過計算目的基因相對于參照因子的倍數來比較mRNA的表達差異，管家基因GAPDH作為內參基因。△△Ct=（待測樣品目的基因的Ct平均值?待測樣本內參基因的Ct平均值）?（對照樣品目的基因的Ct平均值）。目的基因的相對拷貝量F=2?△△Ct。
參照文獻[17]方法，流式細胞儀檢測各組Müller細胞的凋亡率。采用15 mW氬離子激光，激發光波長為488 nm，發射波長530 nm，CEL LQuest軟件自動獲取1×104個細胞樣品。流式細胞儀定量分析，計算Annexin V-FITC及碘化丙啶（PI）雙染陽性細胞百分比含量。
SPSS17.0軟件行統計學處理。結果以均數±標準差（
±s）表示。相同指標多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著差法檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
熒光顯微鏡觀察發現，95%以上Müller細胞GS染色陽性；細胞體大，細胞漿豐富，綠色熒光均勻一致；細胞核DAPI染色呈圓形或卵圓形，邊界清晰，藍色熒光均勻一致（圖1）。
Western blot檢測結果顯示，N組、HG組、HG+tBHQ組Müller細胞中Nrf2（F=73.831）、HO-1（F=148.618）、PI3K（F=83.540）、Bcl-2（F=150.381）、Bax（F=234.459）蛋白表達比較，差異均有統計學意義（P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000）。 HG組Müller細胞中Nrf2（t=4.114）、HO-1（t=9.275）蛋白表達較N組升高，差異有統計學意義（P=0.006、0.000）。HG+tBHQ組Müller細胞中Nrf2（t=7.847）、HO-1（t=7.947）、PI3K（t=5.397）、Bcl-2（t=6.825）蛋白表達較HG組升高，差異有統計學意義（P=0.000、0.000、0.002、0.000）；Bax蛋白表達較HG組降低，差異有統計學意義（t=14.998、P=0.000）（圖2）。
圖2
N組、HG組、HG+tBHQ組Müller細胞中Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白表達情況。2A. 電泳圖；2B. Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白表達結果。* HG組與N組比較，P＜0.05；# HG+tBHQ組與HG組比較，P＜0.05
qRT-PCR檢測結果顯示，N組、HG組、HG+tBHQ組Müller細胞中Nrf2（F=340.317）、HO-1（F=1 582.911）、PI3K（F=81.807）、Bcl-2（F=133.630）、Bax（F=283.850）mRNA比較，差異有統計學意義（P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000）。 HG組Müller細胞中Nrf2（t=7.292）、HO-1（t=15.014）較N組升高，差異有統計學意義（P=0.000、0.000）。HG+tBHQ組Müller細胞中Nrf2（t=18.046）、HO-1（t=39.458）、PI3K（t=4.979）、Bcl-2（t=9.535）mRNA較HG組升高，差異有統計學意義（P=0.000、0.000、0.003、0.000）；Bax mRNA較HG組降低，差異有統計學意義（t=16.520、P=0.000）（圖3）。
圖3
N組、HG組、HG+tBHQ組Müller細胞中Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax mRNA表達情況。 * HG組與N組比較，P＜0.05；# HG+tBHQ組與HG組比較，P＜0.05
流式細胞儀檢測結果顯示，N組、HG組、HG+tBHQ組Müller細胞的凋亡率分別為（3.95±0.68）%、（39.77±1.76）%、（20.84±0.23）%。三組Müller細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（F=797.079、P=0.000）。HG組Müller細胞凋亡率較N組增高，差異有統計學意義（t=39.905、P=0.000）；HG+tBHQ組Müller細胞凋亡率較HG組降低，差異均有統計學意義（t=21.083、P=0.000）（圖4）。
圖4
Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞儀檢測N組、HG組、HG+tBHQ組Müller細胞凋亡情況。4A.三組Müller細胞凋亡結果；4B.三組Müller細胞凋亡率比較。* HG組與N組比較，P＜0.05；# HG+tBHQ組與HG組比較，P＜0.05
3 討論
目前已經發現Nrf2在人視網膜Müller細胞中表達[18]，同時也發現DR患者視網膜中Nrf2表達增加[19]。本研究結果發現，N組Müller細胞中Nrf2表達，HG組Nrf2表達增加。Nrf2可調節直接和間接抗氧化，間接酶包括HO-1[20-22]。本研究結果表明，高糖條件下，Müller細胞中Nrf2及其下游抗氧化蛋白HO-1的表達增加，說明此時Müller細胞有助于維持細胞氧化還原狀態并防止氧化。既往部分研究發現，盡管糖尿病環境中Nrf2表達增加，但其在細胞核中的表達水平和DNA結合活性卻低于正常水平[19]。表明雖然在糖尿病環境中細胞產生更多的Nrf2，導致Nrf2產量增加，但是不能到達細胞核以增強轉錄機制。
本研究結果發現，tBHQ干預進一步增加了Nrf2和HO-1在Müller細胞中的表達，與Zhong等[19]結果一致。Zhong等[19]發現，tBHQ在高糖條件下干預牛視網膜內皮細胞，可以激活Nrf2活性。其他一些研究也發現，tBHQ在體內通過促進Nrf2蛋白入細胞核，繼而激活Nrf2-ARE信號通路，啟動HO-1基因的表達[23,24]。上述結果均表明，tBHQ可以通過增加Nrf2和HO-1的活性發揮Müller細胞的抗氧化功能。
PI3K/Akt通路在DR中發揮重要作用，糖尿病大鼠視網膜中PI3K，Akt-1和Akt-3活性喪失[3]。本研究結果也發現高糖環境下，大鼠Müller細胞中PI3K表達降低。PI3K/Akt途徑是細胞存活途徑的主要調節因子[4]。該途徑的激活可以導致Bcl-2家族的抗凋亡成員增加和促凋亡蛋白的水平降低[5-7]。作為Bcl-2家族成員，抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax在線粒體途徑中天生平衡，并且這種平衡可以決定糖尿病刺激后Müller細胞的存活或死亡[25-29]。越來越多的證據表明，高血糖導致Müller細胞死亡是通過細胞凋亡實現[30,31]。本研究結果顯示，高糖條件下Müller細胞Bcl-2表達下降，Bax表達增加；表明高糖環境下Müller細胞凋亡程序激活。 PI3K/Akt途徑也調控Nrf2介導的抗氧化功能[32,33]。已經有研究發現，PI3K參與Nrf2的解離和核轉運以影響其下游的氧化應激產物[34]。tBHQ可以刺激PI3k依賴性Akt磷酸化，上調Nrf2介導的抗氧化應答元件的活性[8,9]。本研究結果顯示，tBHQ誘導干預后，PI3K，Nrf2和Bcl- 2表達升高，Bax表達降低；提示tBHQ可能通過激活PI3K-Nrf2途徑抑制Müller細胞的凋亡。既往有研究發現，褪黑激素是一種理想的抗氧化藥物，褪黑激素在DR中通過激活Müller細胞中的PI3K/Akt-Nrf2信號通路，通過誘導HO-1的表達增強細胞抗氧化防御能力[35]。同時，我們的研究也發現，tBHQ干預后，HO-1隨著Nrf2表達的增加而增加；表明tBHQ可能通過激活PI3K-Nrf2途徑誘導HO-1的分泌，從而導致抗氧化應激和抗凋亡。同時有研究發現，tBHQ也可激活Nrf2-AREr3通路，誘導Bcl-2基因轉錄，下調Bax蛋白表達，起到抗氧化和抗凋亡的作用[36]。然而，也有部分研究發現，tBHQ確實能有效阻止肝細胞的死亡并抑制心肌細胞凋亡，但tBHQ的保護作用與Nrf2的激活無關，而與Akt的急性激活有關[37,38]。說明tBHQ的抗凋亡保護作用有可能是通過激活PI3K/Akt信號通路而起作用，而與Nrf2的激活無關。以上這些發現還需要進一步實驗進行驗證。
本研究參照文獻[15]的方法使用濃度為20 μmol/L tBHQ對高糖培養的Müller細胞干預48 h，發現tBHQ可誘導Müller細胞中各因子的變化。然而不同濃度的tBHQ及干預不同時間點可能會誘發各因子不一樣的表達，后期將進行進一步的研究。
本研究結果發現，高糖環境下Müller細胞產生更多的Nrf2和HO-1，雖然其產量增加，但不能到達細胞核以增強轉錄機制。tBHQ不僅能激活Nrf2和HO-1在Müller細胞中的表達以抗氧化反應，而且還通過激活PI3K信號通路來抑制Müller細胞的凋亡。 tBHQ也可能是通過激活PI3K-Nrf2途徑誘導HO-1分泌，從而抗氧化應激，抗凋亡作用。tBHQ在高糖環境下誘導Müller細胞中Nrf2、HO-1及PI3K的表達具有巨大的潛力，以保護Müller細胞免受氧化應激和凋亡的損傷，并且可能對未來治療DR具有重要的作用。
