引用本文： 紀鵬, 雷寧玉, 宋斌, 王麗君, 侯亞南. 缺氧狀態下人視網膜色素上皮細胞中音猥因子與血管內皮生長因子表達的關系. 中華眼底病雜志, 2018, 34(2): 168-171. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.02.014 復制
糖尿病視網膜病變、早產兒視網膜病變等缺氧性視網膜病變是引起視力下降的常見病變。血管內皮生長因子（VEGF）在正常人組織和血漿滲出液中呈低水平表達，但在缺氧狀態下的視網膜組織中表達升高[1]。缺氧可誘導VEGF表達，進而引起血視網膜屏障破環，促進新生血管形成[2-6]。音猥因子（Shh）是Hedgehog家族的成員之一，在脊椎動物視網膜分層、視網膜色素上皮（RPE）分化、視莖發育和引導軸突發育等過程中有著重要的調控作用[7]。最近研究表明，Shh是促進缺血、缺氧組織中新生血管生長的重要因子，且其調控機制與VEGF的產生有關[8-11]。但關于在缺氧性視網膜病變的發生發展中，Shh信號通路與VEGF表達是否有關目前尚不清楚。為此，我們初步探討了缺氧狀態下人RPE（hRPE）細胞中Shh與VEGF表達的關系。現將結果報道如下。
1 材料和方法
ARPE-19細胞株（中山大學眼科實驗中心）；Dulbecco改良Eagle（DMEM）培養基、青鏈霉素、胰蛋白酶[中科邁晨（北京）科技有限公司]；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；環巴明、CoCL2（美國Sigma公司）；Trizol試劑、逆轉錄（RT）試劑盒、熒光定量聚合鏈反應（RT-PCR）試劑盒（大連寶生物工程技術服務有限公司）；人VEGF酶鏈免疫吸附測定試驗（ELISA）試劑盒（上海依科賽生物技術公司）；人Shh ELISA試劑盒（上海依科賽生物技術公司）。
ARPE-19細胞株接種于含10%胎牛血清、100×103 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養液中，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養，每3～4 d換液傳代。取對數生長期3～6代細胞用于實驗。以細胞密度1×104、10×105、5×105個/孔分別接種于6、24孔板中，培養24 h后棄掉上清液，每孔加入無血清DMEM培養液饑餓24 h。將細胞分為正常對照組、缺氧實驗組及環巴明抑制組。缺氧實驗組加入100 μmol/L CoCl2，環巴明抑制組于制作缺氧狀態前1 h加入20 μmol/L的環巴明進行預處理。3組細胞培養4、8、12、24 h。
采用RT-PCR檢測3組細胞中Shh、VEGF mRNA的表達。取培養4、8、12、24 h的6孔板，分別提取各組細胞總RNA，逆轉錄成cDNA后進行擴增。紫外分光光度計測定RNA濃度為3.5～5.0 ng/μl，吸光度[A，舊稱光密度(OD)]260/A280為1.8～2.0。按照RT-PCR試劑盒說明書操作，反應體系為10 μl。Shh、VEGF引物序列由大連寶生物工程技術服務有限公司合成。Shh：正向引物5′-TGTCTGCTGCTAGTCCTCGTCTC-3′，反向引物5-TTTTGGGGTGCCTCCTCTT-3′，擴增片段長度為94堿基對（bp）；VEGF：正向引物5′-CTGGAGTGTGTGCCCACTGA-3′，反向引物5′-CATTCACATTTGTTGTGCTGTAGGA-3′，擴增片段長度為116 bp；β-肌動蛋白（β-actin）：正向引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，反向引物5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，擴增片段長度為186 bp。擴增條件：94 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，65 ℃退火30 s，39個循環；65 ℃延伸10 s。按照2-△△Ct計算各組Shh、VEGF mRNA相對表達量。實驗重復3次，取平均值。
采用ELISA檢測正常對照組、缺氧實驗組細胞培養上清液中Shh、VEGF蛋白含量。培養4、8、12、24 h的24孔板，每組設3個副孔。取細胞培養上清液，以離心半徑4.5 cm、轉速6000 r/min離心5 min。采用雙抗體夾心ELISA法，按照人Shh及VEGF ELISA試劑盒說明書進行操作。酶標儀450 nm波長讀取A值，待測樣本的A值在標準曲線上查出該樣本的Shh及VEGF水平蛋白對應值。實驗重復3次，取平均值。
采用SPSS19.0統計軟件進行統計學分析。多組間數據比較應用單因素方差分析。方差齊，應用兩兩比較最小顯著差法檢驗；方差不齊，應用Dunnett檢驗。Shh與VEGF表達之間的關系采用Pearson相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
正常對照組可見少量Shh、VEGF mRNA及蛋白表達。缺氧實驗組Shh、VEGF mRNA及蛋白表達隨缺氧時間延長而增加。缺氧實驗組Shh、VEGF mRNA及蛋白表達較正常對照組明顯增多，差異有統計學意義（F=178.364、183.732、77.456、91.572，P＜0.01）。環巴明抑制組Shh、VEGF mRNA表達較缺氧實驗組明顯降低，差異有統計學意義（F=68.745、121.834，P＜0.01）（圖1，2）。
圖1
3組Shh、VEGF mRNA表達比較。1A.Shh mRNA表達；1B.VEGF mRNA表達
圖2
正常對照組及缺氧實驗組Shh、VEGF蛋白表達比較。2A. Shh蛋白表達；2B. VEGF蛋白表達
相關性分析結果顯示，缺氧實驗組hRPE細胞中VEGF蛋白表達與Shh蛋白表達呈正相關（r=0.942，P＜0.05）（圖3）；VEGF mRNA表達與Shh mRNA表達呈正相關（r=0.970，P＜0.01）（圖4）。環巴明抑制組hRPE細胞中VEGF mRNA表達與Shh mRNA表達無相關性（r=0.915，P＞0.05）。
圖3
缺氧實驗組Shh蛋白表達與VEGF蛋白表達相關性分析圖
圖4
缺氧實驗組Shh mRNA表達與VEGF mRNA表達相關性分析圖
3 討論
缺氧性視網膜病變發病機制復雜，涉及諸多細胞因子及多種復雜信號轉導通路。細胞因子的表達異常，血視網膜屏障的破壞等誘導新生血管生成，從而導致疾病的發生。而高糖毒性等導致的缺氧狀態被認為是導致視網膜血管新生的重要原因[12]。VEGF是一種內皮細胞特異性絲裂原，可刺激內皮細胞的增生和分化，參與生理性和病理性新生血管的形成及微血管的通透性[13, 14]。在缺氧、高糖等異常因素下，Shh信號通路可與VEGF共同參與新生血管的形成[15]。已有多項研究發現，VEGF是Shh信號調控血管新生的下游靶基因之一，Shh信號通路調控血管新生的機制與缺氧誘導因子-1α-VEGF信號通路有關[16-19]。作為該通路的特異性抑制劑環巴明能夠直接作用于Shh信號通路中的Smoothened，抑制Shh信號通路的活性，進而減少VEGF的生成[10, 20]。本研究結果顯示，細胞培養24 h后即可見hRPE細胞有少量Shh的表達。正常對照組中Shh、VEGF mRNA和蛋白呈低水平表達，而缺氧實驗組中Shh、VEGF mRNA和蛋白表達量增加，且兩者含量隨缺氧時間的延長而增加。當加入抑制劑環巴明時，相應的Shh mRNA表達明顯降低。由此推斷，缺氧刺激下hRPE細胞可增加Shh及VEGF的生成，且Shh信號通路可能參與了hRPE細胞中VEGF的生成。提示臨床應用特異性Shh信號通路抑制劑阻斷相關基因位點，進而減少VEGF表達，可為防治新生血管性疾病提供新的思路。
缺氧性視網膜病變發病機制復雜，Shh、VEGF參與了缺氧狀態下視網膜血管新生的發生、發展，與視網膜血管病理性發生與發展密切相關。隨著分子生物學及各種前沿檢測技術的發展，分子基礎研究已成為視網膜缺氧缺血疾病發病機制及治療方法的焦點。相信通過尋找可以抑制或者阻斷細胞因子表達及功能的時機或藥物，如抑制Shh信號通路等，從而達到治療和預防視網膜新生血管性疾病的目的，從而為缺血缺氧性視網膜病變及新生血管性疾病的研究指引新的研究方向、提供新的思路，進而可以為臨床治療提供更科學、合理、有效的方法。
糖尿病視網膜病變、早產兒視網膜病變等缺氧性視網膜病變是引起視力下降的常見病變。血管內皮生長因子（VEGF）在正常人組織和血漿滲出液中呈低水平表達，但在缺氧狀態下的視網膜組織中表達升高[1]。缺氧可誘導VEGF表達，進而引起血視網膜屏障破環，促進新生血管形成[2-6]。音猥因子（Shh）是Hedgehog家族的成員之一，在脊椎動物視網膜分層、視網膜色素上皮（RPE）分化、視莖發育和引導軸突發育等過程中有著重要的調控作用[7]。最近研究表明，Shh是促進缺血、缺氧組織中新生血管生長的重要因子，且其調控機制與VEGF的產生有關[8-11]。但關于在缺氧性視網膜病變的發生發展中，Shh信號通路與VEGF表達是否有關目前尚不清楚。為此，我們初步探討了缺氧狀態下人RPE（hRPE）細胞中Shh與VEGF表達的關系。現將結果報道如下。
1 材料和方法
ARPE-19細胞株（中山大學眼科實驗中心）；Dulbecco改良Eagle（DMEM）培養基、青鏈霉素、胰蛋白酶[中科邁晨（北京）科技有限公司]；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；環巴明、CoCL2（美國Sigma公司）；Trizol試劑、逆轉錄（RT）試劑盒、熒光定量聚合鏈反應（RT-PCR）試劑盒（大連寶生物工程技術服務有限公司）；人VEGF酶鏈免疫吸附測定試驗（ELISA）試劑盒（上海依科賽生物技術公司）；人Shh ELISA試劑盒（上海依科賽生物技術公司）。
ARPE-19細胞株接種于含10%胎牛血清、100×103 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養液中，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養，每3～4 d換液傳代。取對數生長期3～6代細胞用于實驗。以細胞密度1×104、10×105、5×105個/孔分別接種于6、24孔板中，培養24 h后棄掉上清液，每孔加入無血清DMEM培養液饑餓24 h。將細胞分為正常對照組、缺氧實驗組及環巴明抑制組。缺氧實驗組加入100 μmol/L CoCl2，環巴明抑制組于制作缺氧狀態前1 h加入20 μmol/L的環巴明進行預處理。3組細胞培養4、8、12、24 h。
采用RT-PCR檢測3組細胞中Shh、VEGF mRNA的表達。取培養4、8、12、24 h的6孔板，分別提取各組細胞總RNA，逆轉錄成cDNA后進行擴增。紫外分光光度計測定RNA濃度為3.5～5.0 ng/μl，吸光度[A，舊稱光密度(OD)]260/A280為1.8～2.0。按照RT-PCR試劑盒說明書操作，反應體系為10 μl。Shh、VEGF引物序列由大連寶生物工程技術服務有限公司合成。Shh：正向引物5′-TGTCTGCTGCTAGTCCTCGTCTC-3′，反向引物5-TTTTGGGGTGCCTCCTCTT-3′，擴增片段長度為94堿基對（bp）；VEGF：正向引物5′-CTGGAGTGTGTGCCCACTGA-3′，反向引物5′-CATTCACATTTGTTGTGCTGTAGGA-3′，擴增片段長度為116 bp；β-肌動蛋白（β-actin）：正向引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，反向引物5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，擴增片段長度為186 bp。擴增條件：94 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，65 ℃退火30 s，39個循環；65 ℃延伸10 s。按照2-△△Ct計算各組Shh、VEGF mRNA相對表達量。實驗重復3次，取平均值。
采用ELISA檢測正常對照組、缺氧實驗組細胞培養上清液中Shh、VEGF蛋白含量。培養4、8、12、24 h的24孔板，每組設3個副孔。取細胞培養上清液，以離心半徑4.5 cm、轉速6000 r/min離心5 min。采用雙抗體夾心ELISA法，按照人Shh及VEGF ELISA試劑盒說明書進行操作。酶標儀450 nm波長讀取A值，待測樣本的A值在標準曲線上查出該樣本的Shh及VEGF水平蛋白對應值。實驗重復3次，取平均值。
采用SPSS19.0統計軟件進行統計學分析。多組間數據比較應用單因素方差分析。方差齊，應用兩兩比較最小顯著差法檢驗；方差不齊，應用Dunnett檢驗。Shh與VEGF表達之間的關系采用Pearson相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
正常對照組可見少量Shh、VEGF mRNA及蛋白表達。缺氧實驗組Shh、VEGF mRNA及蛋白表達隨缺氧時間延長而增加。缺氧實驗組Shh、VEGF mRNA及蛋白表達較正常對照組明顯增多，差異有統計學意義（F=178.364、183.732、77.456、91.572，P＜0.01）。環巴明抑制組Shh、VEGF mRNA表達較缺氧實驗組明顯降低，差異有統計學意義（F=68.745、121.834，P＜0.01）（圖1，2）。
圖1
3組Shh、VEGF mRNA表達比較。1A.Shh mRNA表達；1B.VEGF mRNA表達
圖2
正常對照組及缺氧實驗組Shh、VEGF蛋白表達比較。2A. Shh蛋白表達；2B. VEGF蛋白表達
相關性分析結果顯示，缺氧實驗組hRPE細胞中VEGF蛋白表達與Shh蛋白表達呈正相關（r=0.942，P＜0.05）（圖3）；VEGF mRNA表達與Shh mRNA表達呈正相關（r=0.970，P＜0.01）（圖4）。環巴明抑制組hRPE細胞中VEGF mRNA表達與Shh mRNA表達無相關性（r=0.915，P＞0.05）。
圖3
缺氧實驗組Shh蛋白表達與VEGF蛋白表達相關性分析圖
圖4
缺氧實驗組Shh mRNA表達與VEGF mRNA表達相關性分析圖
3 討論
缺氧性視網膜病變發病機制復雜，涉及諸多細胞因子及多種復雜信號轉導通路。細胞因子的表達異常，血視網膜屏障的破壞等誘導新生血管生成，從而導致疾病的發生。而高糖毒性等導致的缺氧狀態被認為是導致視網膜血管新生的重要原因[12]。VEGF是一種內皮細胞特異性絲裂原，可刺激內皮細胞的增生和分化，參與生理性和病理性新生血管的形成及微血管的通透性[13, 14]。在缺氧、高糖等異常因素下，Shh信號通路可與VEGF共同參與新生血管的形成[15]。已有多項研究發現，VEGF是Shh信號調控血管新生的下游靶基因之一，Shh信號通路調控血管新生的機制與缺氧誘導因子-1α-VEGF信號通路有關[16-19]。作為該通路的特異性抑制劑環巴明能夠直接作用于Shh信號通路中的Smoothened，抑制Shh信號通路的活性，進而減少VEGF的生成[10, 20]。本研究結果顯示，細胞培養24 h后即可見hRPE細胞有少量Shh的表達。正常對照組中Shh、VEGF mRNA和蛋白呈低水平表達，而缺氧實驗組中Shh、VEGF mRNA和蛋白表達量增加，且兩者含量隨缺氧時間的延長而增加。當加入抑制劑環巴明時，相應的Shh mRNA表達明顯降低。由此推斷，缺氧刺激下hRPE細胞可增加Shh及VEGF的生成，且Shh信號通路可能參與了hRPE細胞中VEGF的生成。提示臨床應用特異性Shh信號通路抑制劑阻斷相關基因位點，進而減少VEGF表達，可為防治新生血管性疾病提供新的思路。
缺氧性視網膜病變發病機制復雜，Shh、VEGF參與了缺氧狀態下視網膜血管新生的發生、發展，與視網膜血管病理性發生與發展密切相關。隨著分子生物學及各種前沿檢測技術的發展，分子基礎研究已成為視網膜缺氧缺血疾病發病機制及治療方法的焦點。相信通過尋找可以抑制或者阻斷細胞因子表達及功能的時機或藥物，如抑制Shh信號通路等，從而達到治療和預防視網膜新生血管性疾病的目的，從而為缺血缺氧性視網膜病變及新生血管性疾病的研究指引新的研究方向、提供新的思路，進而可以為臨床治療提供更科學、合理、有效的方法。
