引用本文： 李光祖, 王曉莉, 李振, 張婷婷, 劉萍, 張帥, 趙巖松. 褪黑素對視網膜缺血再灌注損傷大鼠視網膜細胞凋亡的影響及機制探討. 中華眼底病雜志, 2018, 34(1): 55-59. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.01.014 復制
褪黑素是松果體分泌的神經內分泌激素，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用[1, 2]。近期研究發現，褪黑素可有效減輕細胞凋亡，提高視網膜神經節細胞（RGC）存活率，發揮對視網膜缺血再灌注損傷（RIRI）的保護作用，但具體機制尚不明確[3]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3是細胞凋亡過程中的死亡蛋白，活化的Caspase-3是凋亡信號啟動的重要標志。核轉錄因子E2相關因子2（Nrf2）-抗氧化反應元件（ARE）信號通路是機體對抗氧化應激的關鍵，Nrf2活化后，可與細胞核內的ARE啟動子部位結合，啟動Nrf2下游靶基因血紅素氧合酶（HO）-1的表達，進而表現出抗氧化、抗炎和抗凋亡的保護作用[4]。研究表明，腸缺血處理后Nrf2-ARE信號通路的激活可顯著改善腸缺血再灌注引起的肺損傷和全身炎癥反應[5]；褪黑素可通過激活Nrf2-ARE信號通路，減輕肝臟缺血再灌注損傷及氧化應激[6]。但目前關于褪黑素對RIRI中Nrf2-ARE信號通路的影響尚不清楚。為此，本研究通過觀察褪黑素對RIRI大鼠視網膜細胞活性Caspase-3蛋白表達的影響，并從Nrf2-ARE信號通路探討褪黑素減輕視網膜細胞凋亡的機制，以期為臨床上采用褪黑素治療RIRI提供科學的理論依據。現將結果報道如下。
1 材料和方法
健康無眼疾雄性Sprague-Dawley大鼠54只，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。褪黑素（美國Sigma公司），兔抗活性Caspase-3（美國Cell Signaling Technology公司），兔抗Nrf2、兔抗HO-1（武漢博士德生物工程有限公司）。兔抗二步法試劑盒（PV-9001）、二氨基聯苯胺（DAB）顯色劑試劑盒（ZLI-9018）（北京中杉金橋生物技術有限公司），正置熒光顯微鏡（BX-51，日本Olympus公司），石蠟切片機（Shandon Finesse325，美國Thermo公司），電子分析天平（AL-204，美國Mettler Toledo公司）。
采用隨機數字表法將大鼠隨機分為正常對照組、RIRI組及褪黑素組，分別為6、24、24只。RIRI組及褪黑素組大鼠采用線栓法建立RIRI模型[7-9]。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，頸部正中切口，分離右側頸總、頸內外動脈并結扎右側頸總動脈近心段、頸外動脈近分叉處。于頸總動脈插入直徑0.2 mm的線栓，當線栓頭進入頸內動脈且距頸總動脈與頸內動脈分叉處18 mm時停止進線，結扎固定，縫合組織皮膚。此時可見大鼠右側眼球蒼白，眼底血流中斷，與左眼形成對比。缺血2 h后，在麻醉狀態下完全拔出線栓。可見大鼠右側眼球蒼白消失，血流恢復。造模成功30 min后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉褪黑素組大鼠，解開頸部正中切口縫線，分離右側頸總、頸內、頸外動脈；靜脈留置針經頸內動脈按1.25 ml/kg劑量注射4 mg/ml褪黑素。RIRI組大鼠注射等量的生理鹽水。建模后6、24 h及3、7 d，RIRI組及褪黑素組分別取6只大鼠用于實驗。
腹腔麻醉各組大鼠，常規心臟灌注取右側眼球，置于4%多聚甲醛后固定過夜，去晶狀體，常規石蠟包埋，以視神經矢狀軸為平面進行切片，制成4 μm石蠟切片，蘇木精伊紅（HE）染色行非連續切片。連續取3張切片分別行Caspase-3、Nrf2、HO-1免疫組織化學染色；每隔4～5張，行3張連續切片。組織切片脫蠟至水，蘇木精染色，雙蒸水沖洗2次，體積分數1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，自來水沖洗，體積分數70%酒精、80%酒精脫水；伊紅染色30 s，體積分數95%酒精分色；無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，置于光學顯微鏡下觀察。采用Cellsens 1.6圖像分析軟件測量視網膜內層厚度，并計數RGC。于視盤外200 μm處100 μm長度內，隨機取4點測量視網膜內界膜到外網狀層內層內緣的距離，取平均值。計數距視盤邊緣100 μm處RGC層100 μm長度內單位面積RGC數。
石蠟切片脫蠟至水，熱修復抗原，3% H2O2消除內源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉后，分別加入兔抗活性Caspase-3（1:100）、兔抗Nrf2（1:100）、兔抗HO-1（1:150）一抗，4 ℃冰箱中過夜；次日，復溫后 0.01 mol/L PBS沖洗，加兔抗大鼠二抗試劑盒，DAB顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。置于光學顯微鏡下觀察，計數活性Caspase-3及Nrf2、HO-1 陽性細胞數量。
采用SPSS 16.0 統計軟件進行統計學分析，所有計量資料均以均數±標準差（
）表示。方差齊性資料采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。采用一般線性回歸分析法分析建模后不同時間點褪黑素組與RIRI組活性Caspase-3陽性細胞數差值與Nrf2、HO-1陽性細胞數差值的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
光學顯微鏡觀察發現，正常對照組大鼠視網膜各層結構清晰完整，細胞排列整齊規則（圖1A）。RIRI組大鼠建模后6 h視網膜水腫明顯，視網膜內層變厚；建模后24 h視網膜內層變薄、細胞數目減少（圖1B）；建模后3、7 d視網膜內層變薄、細胞數目減少明顯。褪黑素組大鼠建模后6 h視網膜細胞水腫；建模后24 h及3、7 d，大鼠視網膜各層細胞排列較整齊，形態較規則（圖1C）。建模后6、24 h及3、7 d，與RIRI組比較，褪黑素組大鼠視網膜內層厚度增厚（F=16.710、62.303、68.389、57.132，P＜0.01），RGC數量增加（F=24.250、11.624、14.155、32.442，P＜0.05），差異均有統計學意義（圖2，3）。
圖2
各組大鼠視網膜內層厚度比較
圖3
各組大鼠RGC數量比較
正常對照組大鼠視網膜各層偶見少量活性Caspase-3及Nrf2、HO-1陽性細胞。建模后6 h，RIRI組大鼠視網膜可見較多活性Caspase-3陽性細胞，少量Nrf2、HO-1陽性細胞，主要分布于視網膜內核層、RGC層；褪黑素組大鼠視網膜可見較少量活性Caspase-3陽性細胞，較多量Nrf2、HO-1陽性細胞，主要分布于視網膜內核層、RGC層。建模后24 h，RIRI組、褪黑素組大鼠視網膜活性Caspase-3及Nrf2、HO-1陽性細胞數量明顯增加（圖4）。建模后3 d，RIRI組、褪黑素組大鼠視網膜活性Caspase-3及Nrf2、HO-1陽性細胞數量開始下降但仍處于較高水平。建模后7 d，RIRI組、褪黑素組大鼠視網膜活性Caspase-3及Nrf2、HO-1陽性細胞數量繼續下降。建模后6、24 h及3、7 d，與RIRI組比較，褪黑素組大鼠視網膜活性Caspase-3陽性細胞數量明顯減少（F=49.118、134.173、76.225、18.385，P＜0.01），Nrf2（F=11.041、31.480、59.246、6.740，P＜0.05）、HO-1（F=128.993、21.606、51.349、8.244，P＜0.05）陽性細胞數量明顯增加，差異均有統計學意義（圖5）。
圖5
各組大鼠視網膜活性Caspase-3及Nrf2、HO-1陽性細胞數量比較。5A.活性Caspase-3陽性細胞數量比較；5B.Nrf2陽性細胞數量比較；5C.HO-1陽性細胞數量比較
相關性分析結果顯示，建模后不同時間點褪黑素組與RIRI組活性Caspase-3陽性細胞數差值與Nrf2、HO-1陽性細胞數差值均呈直線相關（r2=0.810、0.730，P＜0.01）（圖6）。
圖6
褪黑素組與RIRI組活性Caspase-3陽性細胞數差值與Nrf2、HO-1陽性細胞數差值相關性分析散點圖。6A.活性Caspase-3陽性細胞數差值與Nrf2陽性細胞數差值；6B.活性Caspase-3陽性細胞數差值與HO-1陽性細胞數差值
3 討論
Caspase-3是細胞凋亡途徑的終末蛋白，當凋亡信號出現時，細胞質中無活性的Caspase-3在多種水解酶作用下裂解活化形成活性Caspase-3，而活性Caspase-3與細胞凋亡密切相關[10, 11]。因此，本實驗通過對Caspase-3陽性細胞數量的觀察，探討褪黑素對RIRI大鼠視網膜細胞凋亡的影響。本研究結果顯示，隨著RIRI時間的延長，RIRI組活性Caspase-3陽性細胞數量逐漸增加，于建模后24 h達到高峰，此后逐漸下降；建模后各時間點褪黑素組活性Caspase-3陽性細胞數量均少于RIRI組。與Yue等[1]報道結果一致。提示褪黑素可以減輕RIRI大鼠視網膜細胞的凋亡作用。
Nrf2-ARE信號通路是體內重要的內源性抗氧化體系，激活Nrf2-ARE信號通路可通過抗凋亡、抗炎等機制減輕RIRI[12]。有研究報道，褪黑素可通過調節蛋白激酶C和Ca+信號，刺激Nrf2的磷酸化和核轉位，進而上調HO-1基因的轉錄，促進HO-1蛋白的表達[13]。HO-1的代謝產物CO通過調節有絲分裂原激活的蛋白激酶信號途徑或者抑制活化的單核巨噬細胞防止內皮細胞凋亡，發揮抗凋亡作用。褪黑素減輕RIRI大鼠視網膜細胞凋亡的機制是否與該信號通路有關目前尚不清楚。本研究通過Nrf2-ARE信號通路探討褪黑素對RIRI大鼠視網膜細胞凋亡的神經保護作用。結果發現，建模后不同時間點，褪黑素組Nrf2、HO-1陽性細胞數量均較RIRI組增加；活性Caspase-3陽性細胞數量均較RIRI組下降，但仍多于正常對照組。提示褪黑素可減輕RIRI大鼠視網膜細胞的凋亡，其機制可能與其促進Nrf2、HO-1蛋白的表達增加，即激活Nrf2信號通路有關，從而發揮其對視網膜神經細胞的神經保護作用。為了進一步驗證這一推測，我們對建模后不同時間點褪黑素組與RIRI組活性Caspase-3陽性細胞數差值與Nrf2、HO-1陽性細胞數差值進行相關性分析。結果顯示，建模后不同時間點褪黑素組與RIRI組活性Caspase-3陽性細胞數差值與Nrf2、HO-1陽性細胞數差值均呈直線相關。提示褪黑素可能通過促進Nrf2-ARE信號通路重要信號分子Nrf2、HO-1蛋白的表達，抑制RIRI大鼠視網膜細胞的凋亡。
本研究結果表明，褪黑素可激活RIRI大鼠視網膜中Nrf2-ARE信號通路，促進Nrf2、HO-1蛋白表達，從而抑制活性Caspase-3蛋白表達，減輕視網膜細胞凋亡，發揮神經保護作用。但我們僅發現了褪黑素的神經保護作用與Nrf2-ARE信號通路有關，關于褪黑素調控Nrf2-ARE信號通路抑制視網膜細胞凋亡的具體機制尚有待進一步研究。
褪黑素是松果體分泌的神經內分泌激素，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用[1, 2]。近期研究發現，褪黑素可有效減輕細胞凋亡，提高視網膜神經節細胞（RGC）存活率，發揮對視網膜缺血再灌注損傷（RIRI）的保護作用，但具體機制尚不明確[3]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3是細胞凋亡過程中的死亡蛋白，活化的Caspase-3是凋亡信號啟動的重要標志。核轉錄因子E2相關因子2（Nrf2）-抗氧化反應元件（ARE）信號通路是機體對抗氧化應激的關鍵，Nrf2活化后，可與細胞核內的ARE啟動子部位結合，啟動Nrf2下游靶基因血紅素氧合酶（HO）-1的表達，進而表現出抗氧化、抗炎和抗凋亡的保護作用[4]。研究表明，腸缺血處理后Nrf2-ARE信號通路的激活可顯著改善腸缺血再灌注引起的肺損傷和全身炎癥反應[5]；褪黑素可通過激活Nrf2-ARE信號通路，減輕肝臟缺血再灌注損傷及氧化應激[6]。但目前關于褪黑素對RIRI中Nrf2-ARE信號通路的影響尚不清楚。為此，本研究通過觀察褪黑素對RIRI大鼠視網膜細胞活性Caspase-3蛋白表達的影響，并從Nrf2-ARE信號通路探討褪黑素減輕視網膜細胞凋亡的機制，以期為臨床上采用褪黑素治療RIRI提供科學的理論依據。現將結果報道如下。
1 材料和方法
健康無眼疾雄性Sprague-Dawley大鼠54只，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。褪黑素（美國Sigma公司），兔抗活性Caspase-3（美國Cell Signaling Technology公司），兔抗Nrf2、兔抗HO-1（武漢博士德生物工程有限公司）。兔抗二步法試劑盒（PV-9001）、二氨基聯苯胺（DAB）顯色劑試劑盒（ZLI-9018）（北京中杉金橋生物技術有限公司），正置熒光顯微鏡（BX-51，日本Olympus公司），石蠟切片機（Shandon Finesse325，美國Thermo公司），電子分析天平（AL-204，美國Mettler Toledo公司）。
采用隨機數字表法將大鼠隨機分為正常對照組、RIRI組及褪黑素組，分別為6、24、24只。RIRI組及褪黑素組大鼠采用線栓法建立RIRI模型[7-9]。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，頸部正中切口，分離右側頸總、頸內外動脈并結扎右側頸總動脈近心段、頸外動脈近分叉處。于頸總動脈插入直徑0.2 mm的線栓，當線栓頭進入頸內動脈且距頸總動脈與頸內動脈分叉處18 mm時停止進線，結扎固定，縫合組織皮膚。此時可見大鼠右側眼球蒼白，眼底血流中斷，與左眼形成對比。缺血2 h后，在麻醉狀態下完全拔出線栓。可見大鼠右側眼球蒼白消失，血流恢復。造模成功30 min后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉褪黑素組大鼠，解開頸部正中切口縫線，分離右側頸總、頸內、頸外動脈；靜脈留置針經頸內動脈按1.25 ml/kg劑量注射4 mg/ml褪黑素。RIRI組大鼠注射等量的生理鹽水。建模后6、24 h及3、7 d，RIRI組及褪黑素組分別取6只大鼠用于實驗。
腹腔麻醉各組大鼠，常規心臟灌注取右側眼球，置于4%多聚甲醛后固定過夜，去晶狀體，常規石蠟包埋，以視神經矢狀軸為平面進行切片，制成4 μm石蠟切片，蘇木精伊紅（HE）染色行非連續切片。連續取3張切片分別行Caspase-3、Nrf2、HO-1免疫組織化學染色；每隔4～5張，行3張連續切片。組織切片脫蠟至水，蘇木精染色，雙蒸水沖洗2次，體積分數1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，自來水沖洗，體積分數70%酒精、80%酒精脫水；伊紅染色30 s，體積分數95%酒精分色；無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，置于光學顯微鏡下觀察。采用Cellsens 1.6圖像分析軟件測量視網膜內層厚度，并計數RGC。于視盤外200 μm處100 μm長度內，隨機取4點測量視網膜內界膜到外網狀層內層內緣的距離，取平均值。計數距視盤邊緣100 μm處RGC層100 μm長度內單位面積RGC數。
石蠟切片脫蠟至水，熱修復抗原，3% H2O2消除內源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉后，分別加入兔抗活性Caspase-3（1:100）、兔抗Nrf2（1:100）、兔抗HO-1（1:150）一抗，4 ℃冰箱中過夜；次日，復溫后 0.01 mol/L PBS沖洗，加兔抗大鼠二抗試劑盒，DAB顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。置于光學顯微鏡下觀察，計數活性Caspase-3及Nrf2、HO-1 陽性細胞數量。
采用SPSS 16.0 統計軟件進行統計學分析，所有計量資料均以均數±標準差（
）表示。方差齊性資料采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。采用一般線性回歸分析法分析建模后不同時間點褪黑素組與RIRI組活性Caspase-3陽性細胞數差值與Nrf2、HO-1陽性細胞數差值的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
光學顯微鏡觀察發現，正常對照組大鼠視網膜各層結構清晰完整，細胞排列整齊規則（圖1A）。RIRI組大鼠建模后6 h視網膜水腫明顯，視網膜內層變厚；建模后24 h視網膜內層變薄、細胞數目減少（圖1B）；建模后3、7 d視網膜內層變薄、細胞數目減少明顯。褪黑素組大鼠建模后6 h視網膜細胞水腫；建模后24 h及3、7 d，大鼠視網膜各層細胞排列較整齊，形態較規則（圖1C）。建模后6、24 h及3、7 d，與RIRI組比較，褪黑素組大鼠視網膜內層厚度增厚（F=16.710、62.303、68.389、57.132，P＜0.01），RGC數量增加（F=24.250、11.624、14.155、32.442，P＜0.05），差異均有統計學意義（圖2，3）。
圖2
各組大鼠視網膜內層厚度比較
圖3
各組大鼠RGC數量比較
正常對照組大鼠視網膜各層偶見少量活性Caspase-3及Nrf2、HO-1陽性細胞。建模后6 h，RIRI組大鼠視網膜可見較多活性Caspase-3陽性細胞，少量Nrf2、HO-1陽性細胞，主要分布于視網膜內核層、RGC層；褪黑素組大鼠視網膜可見較少量活性Caspase-3陽性細胞，較多量Nrf2、HO-1陽性細胞，主要分布于視網膜內核層、RGC層。建模后24 h，RIRI組、褪黑素組大鼠視網膜活性Caspase-3及Nrf2、HO-1陽性細胞數量明顯增加（圖4）。建模后3 d，RIRI組、褪黑素組大鼠視網膜活性Caspase-3及Nrf2、HO-1陽性細胞數量開始下降但仍處于較高水平。建模后7 d，RIRI組、褪黑素組大鼠視網膜活性Caspase-3及Nrf2、HO-1陽性細胞數量繼續下降。建模后6、24 h及3、7 d，與RIRI組比較，褪黑素組大鼠視網膜活性Caspase-3陽性細胞數量明顯減少（F=49.118、134.173、76.225、18.385，P＜0.01），Nrf2（F=11.041、31.480、59.246、6.740，P＜0.05）、HO-1（F=128.993、21.606、51.349、8.244，P＜0.05）陽性細胞數量明顯增加，差異均有統計學意義（圖5）。
圖5
各組大鼠視網膜活性Caspase-3及Nrf2、HO-1陽性細胞數量比較。5A.活性Caspase-3陽性細胞數量比較；5B.Nrf2陽性細胞數量比較；5C.HO-1陽性細胞數量比較
相關性分析結果顯示，建模后不同時間點褪黑素組與RIRI組活性Caspase-3陽性細胞數差值與Nrf2、HO-1陽性細胞數差值均呈直線相關（r2=0.810、0.730，P＜0.01）（圖6）。
圖6
褪黑素組與RIRI組活性Caspase-3陽性細胞數差值與Nrf2、HO-1陽性細胞數差值相關性分析散點圖。6A.活性Caspase-3陽性細胞數差值與Nrf2陽性細胞數差值；6B.活性Caspase-3陽性細胞數差值與HO-1陽性細胞數差值
3 討論
Caspase-3是細胞凋亡途徑的終末蛋白，當凋亡信號出現時，細胞質中無活性的Caspase-3在多種水解酶作用下裂解活化形成活性Caspase-3，而活性Caspase-3與細胞凋亡密切相關[10, 11]。因此，本實驗通過對Caspase-3陽性細胞數量的觀察，探討褪黑素對RIRI大鼠視網膜細胞凋亡的影響。本研究結果顯示，隨著RIRI時間的延長，RIRI組活性Caspase-3陽性細胞數量逐漸增加，于建模后24 h達到高峰，此后逐漸下降；建模后各時間點褪黑素組活性Caspase-3陽性細胞數量均少于RIRI組。與Yue等[1]報道結果一致。提示褪黑素可以減輕RIRI大鼠視網膜細胞的凋亡作用。
Nrf2-ARE信號通路是體內重要的內源性抗氧化體系，激活Nrf2-ARE信號通路可通過抗凋亡、抗炎等機制減輕RIRI[12]。有研究報道，褪黑素可通過調節蛋白激酶C和Ca+信號，刺激Nrf2的磷酸化和核轉位，進而上調HO-1基因的轉錄，促進HO-1蛋白的表達[13]。HO-1的代謝產物CO通過調節有絲分裂原激活的蛋白激酶信號途徑或者抑制活化的單核巨噬細胞防止內皮細胞凋亡，發揮抗凋亡作用。褪黑素減輕RIRI大鼠視網膜細胞凋亡的機制是否與該信號通路有關目前尚不清楚。本研究通過Nrf2-ARE信號通路探討褪黑素對RIRI大鼠視網膜細胞凋亡的神經保護作用。結果發現，建模后不同時間點，褪黑素組Nrf2、HO-1陽性細胞數量均較RIRI組增加；活性Caspase-3陽性細胞數量均較RIRI組下降，但仍多于正常對照組。提示褪黑素可減輕RIRI大鼠視網膜細胞的凋亡，其機制可能與其促進Nrf2、HO-1蛋白的表達增加，即激活Nrf2信號通路有關，從而發揮其對視網膜神經細胞的神經保護作用。為了進一步驗證這一推測，我們對建模后不同時間點褪黑素組與RIRI組活性Caspase-3陽性細胞數差值與Nrf2、HO-1陽性細胞數差值進行相關性分析。結果顯示，建模后不同時間點褪黑素組與RIRI組活性Caspase-3陽性細胞數差值與Nrf2、HO-1陽性細胞數差值均呈直線相關。提示褪黑素可能通過促進Nrf2-ARE信號通路重要信號分子Nrf2、HO-1蛋白的表達，抑制RIRI大鼠視網膜細胞的凋亡。
本研究結果表明，褪黑素可激活RIRI大鼠視網膜中Nrf2-ARE信號通路，促進Nrf2、HO-1蛋白表達，從而抑制活性Caspase-3蛋白表達，減輕視網膜細胞凋亡，發揮神經保護作用。但我們僅發現了褪黑素的神經保護作用與Nrf2-ARE信號通路有關，關于褪黑素調控Nrf2-ARE信號通路抑制視網膜細胞凋亡的具體機制尚有待進一步研究。
