引用本文： 秦廷玉, 高莎莎, 王文戰. 雷公藤紅素對交感性眼炎患者外周血單個核細胞分泌白細胞介素17的抑制作用. 中華眼底病雜志, 2018, 34(1): 51-54. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.01.013 復制
交感性眼炎（SO）是發生于單眼穿通傷或眼內手術后的一種雙眼肉芽腫性葡萄膜炎，屬于自身免疫性疾病，其病因與發病機制尚不完全清楚[1, 2]。研究表明，SO與體內CD4+ T細胞分泌的白細胞介素（IL）-17 增多密切相關[2-6]。IL-17與IL-23組成IL-23/IL-17通路在自身免疫性疾病中發揮重要作用[7-11]。Chi等[12, 13]研究發現，Vogt-Koyanagi-Harada綜合征和Beh?et病等葡萄膜炎患者的外周血單個核細胞（PBMCs）培養上清液中IL-23、IL-17含量較正常人明顯升高，且IL-23可以明顯促進IL-17產生。但目前有關IL-23/IL-17通路在SO發生發展中的作用及機制不明確，因此也缺乏抑制該通路在SO中發揮作用的有效藥物。雷公藤紅素屬于醌甲基三萜，是從雷公藤根皮中分離得到的第一個天然活性產物；其具有免疫抑制作用，已被廣泛用于治療類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病[14]。但關于雷公藤紅素對SO是否具有相同的治療作用目前尚不清楚。為此，我們觀察了雷公藤紅素對SO患者PBMCs分泌IL-17的抑制作用，并初步探討了其可能機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
淋巴細胞分離液（上海生物工程公司），1640細胞培養液（美國Gibcol BRL公司）。雷公藤紅素、金黃色葡萄球菌CowanⅠ株（SAC）（美國Sigma-Aldrich公司）。抗CD3、抗CD28抗體（美國eBioscience公司），重組人IL-23（rIL-23，美國R&D Systems公司），人IL-23酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（美國Bender MedSystems公司），人IL-17 Duoset ELISA檢測試劑盒（美國R&D Systems公司）。96孔平底細胞培養板（美國Costar公司）。
在鄭州大學第一附屬醫院眼科首次確診為活動期SO的10例患者納入本研究。其中，男性8例，女性2例；年齡19～62歲，平均年齡（38.60±12.68）歲。所有患者病程＜2個月，均符合活動期SO的診斷標準[15, 16]。患者均未使用過糖皮質激素和其他免疫抑制劑治療。選取患者家屬或健康志愿者10名作為對照。其中，男性7例，女性3例；年齡24～69歲，平均年齡（41.90±14.22）歲。兩組患者年齡（t=0.55，P=0.59）、性別分布比較（χ2=0.27，P=0.61）比較，差異均無統計學意義。所有參與者均簽署知情同意書。
采用密度梯度離心法分離PBMCs。取參與者靜脈血15～20 ml，加入10～25 U/ml肝素抗凝離心管內。將抗凝血緩慢加入淋巴細胞分離液面上（分離液：抗凝血=1.0:1.5）。室溫800×g離心20 min。沿離心管管壁周圍吸出細胞層，移入另一試管。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗細胞2次，以離心半徑12 cm、轉速800 r/min離心8 min。加入1 ml 1640細胞培養液，混勻，計數細胞。置于完全1640細胞培養液中，放入5%CO2、37℃細胞培養箱中培養。
調整PBMCs細胞濃度至2×106個/m1，200 μl/孔，置于96孔板中培養。將細胞分為A～D組。A組為正常人PBMCs；B組為SO患者PBMCs；C組為SO患者PBMCs，并在其培養液中加入0.5 μmol/L的雷公藤紅素；D組為SO患者PBMCs，并在其培養液中加入1.0 μmol/L的雷公藤紅素。每組設3個復孔，每孔加入SAC（1:500）刺激3 d，用于檢測IL-23含量；每孔加入抗CD3抗體（5 mg/ml）和抗CD28抗體（1 mg/ml）刺激3 d，用于檢測IL-17含量。重新取細胞培養后，向A、B組加入50 ng/ml rIL-23分別作為A1、B1組。再重新取細胞培養后，向A、B組加入50 ng/ml rIL-23+1 μmol/L雷公藤紅素分別作為A2、B2組。每組設3個復孔，每孔加入抗CD3抗體（5 mg/ml）和抗CD28抗體（1 mg/ml）刺激3 d，用于檢測IL-17含量。將96孔板置于5%CO2、37℃細胞培養箱中培養72 h。終止培養后收集上清液，?70℃保存。用ELISA檢測血清和PBMCs細胞培養上清液中IL-23、IL-17的含量。用酶標儀測定波長450 nm處的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。
采用SPSS 18.0統計學軟件進行統計分析。數據資料經W檢驗呈正態分布，以均數±標準差（
）表示。組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用獨立樣本 t 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
A～D組PBMCs細胞培養上清液中IL-23含量分別為（228.43±17.27）、（513.85±36.46）、（381.07±20.93）、（237.14±17.97）pg/ml。4組間比較，差異有統計學意義（F=306.65，P=0.00）。A組與B組（t=22.37，P=0.00）、A組與C組（t=17.79，P=0.00）、B組與C組（t=9.99，P=0.00）、B組與D組（t=21.53，P=0.00）、C組與D組（t=16.50，P=0.00）PBMCs細胞培養上清液中IL-23含量兩兩比較，差異均有統計學意義。A組與D組PBMCs細胞培養上清液中IL-23含量比較，差異無統計學意義（t=1.11，P=0.28）（圖1）。
圖1
各組PBMCs細胞培養上清液中IL-23含量比較
A～D組PBMCs細胞培養上清液中IL-17含量分別為（220.55±31.15）、（866.77±72.92）、（517.43±54.87）、（242.89±34.09）pg/ml。4組間比較，差異有統計學意義（F=348.24，P=0.00）。A組與B組（t=25.77，P=0.00）、A組與C組（t=14.88，P=0.00）、B組與C組（t=12.11，P=0.00）、B組與D組（t=24.51，P=0.00）、C組與D組（t=13.44，P=0.00）PBMCs細胞培養上清液中IL-17含量兩兩比較，差異均有統計學意義。A組與D組PBMCs細胞培養上清液中IL-17的含量比較，差異無統計學意義（t=1.53，P=0.14）（圖2）。
圖2
各組PBMCs細胞培養上清液中IL-17含量比較
重新取細胞培養后，A、A1、B、B1組PBMCs細胞培養上清液中IL-17含量為（215.63±20.31）、（417.33±22.05）、（865.47±74.89）、（1373.13±92.95）pg/ml。A1、B1組PBMCs細胞培養上清液中IL-17含量分別較A、B組增加，差異均有統計學意義（t=21.28、13.45，P=0.00、0.00）（圖3）。
圖3
重新取細胞培養后各組PBMCs細胞培養上清液中IL-17含量比較
再次取細胞培養后，A1、A2、B1、B2組PBMCs細胞培養上清液中IL-17含量分別為（428.43±24.53）、（229.15±23.28）、（1373.39±89.51）、（571.01±94.88）pg/ml。A2、B2組PBMCs細胞培養上清液中IL-17含量分別較A1、B1組明顯降低，差異均有統計學意義（t=18.63、19.45，P=0.00、0.00）（圖4）。
圖4
再次取細胞培養后各組PBMCs細胞培養上清液中IL-17含量比較
3 討論
本研究結果顯示，B組PBMCs細胞培養上清液中IL-23、IL-17含量均高于A組；A1組、B1組PBMCs細胞培養上清液中IL-23、IL-17含量分別高于A、B組。說明SO患者PBMCs分泌的IL-17較正常健康者更多，而IL-23能促進正常健康者或SO患者的PBMCs分泌更多的IL-17；這與以往其他類型葡萄膜炎的研究結果相似，提示IL-23/IL-17通路在SO的發生發展中可能發揮重要作用。
雷公藤紅素具有抗炎及免疫抑制、誘導細胞凋亡和抗腫瘤等作用，已被廣泛應用于一些自身免疫性疾病的治療[14, 17]。本研究結果顯示，C、D組PBMCs細胞培養上清液中IL-23、IL-17含量均較B組明顯降低，且D組與A組PBMCs細胞培養上清液中IL-23、IL-17含量無明顯差異；A2、B2組PBMCs細胞培養上清液中IL-23、IL-17含量分別較A1、B1組明顯降低。說明雷公藤紅素不僅可以明顯抑制SO患者PBMCs分泌IL-23和IL-17，而且可以抑制rIL-23刺激正常健康者和SO患者PBMCs分泌IL-17。提示雷公藤紅素抑制PBMCs分泌IL-17可能是通過抑制IL-23的分泌而發揮作用，為今后更深入的研究指明了方向。
本研究結果表明，雷公藤紅素可以抑制SO患者PBMCs分泌IL-17，其機制可能與抑制IL-23/IL-17通路發揮作用有關；但是否還有別的細胞因子參與其中或是雷公藤紅素通過影響哪些細胞信號通路發揮作用尚不清楚。另外，目前只針對PBMCs進行研究還不夠，今后研究應增加T細胞亞群流式檢測和增生實驗，測試雷公藤紅素對T細胞亞群分泌細胞因子的影響。待體外實驗研究較為完整時，再進行動物體內實驗，觀察雷公藤紅素對動物體內T細胞分泌IL-23、IL-17等細胞因子的影響，并探討其機制。
交感性眼炎（SO）是發生于單眼穿通傷或眼內手術后的一種雙眼肉芽腫性葡萄膜炎，屬于自身免疫性疾病，其病因與發病機制尚不完全清楚[1, 2]。研究表明，SO與體內CD4+ T細胞分泌的白細胞介素（IL）-17 增多密切相關[2-6]。IL-17與IL-23組成IL-23/IL-17通路在自身免疫性疾病中發揮重要作用[7-11]。Chi等[12, 13]研究發現，Vogt-Koyanagi-Harada綜合征和Beh?et病等葡萄膜炎患者的外周血單個核細胞（PBMCs）培養上清液中IL-23、IL-17含量較正常人明顯升高，且IL-23可以明顯促進IL-17產生。但目前有關IL-23/IL-17通路在SO發生發展中的作用及機制不明確，因此也缺乏抑制該通路在SO中發揮作用的有效藥物。雷公藤紅素屬于醌甲基三萜，是從雷公藤根皮中分離得到的第一個天然活性產物；其具有免疫抑制作用，已被廣泛用于治療類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病[14]。但關于雷公藤紅素對SO是否具有相同的治療作用目前尚不清楚。為此，我們觀察了雷公藤紅素對SO患者PBMCs分泌IL-17的抑制作用，并初步探討了其可能機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
淋巴細胞分離液（上海生物工程公司），1640細胞培養液（美國Gibcol BRL公司）。雷公藤紅素、金黃色葡萄球菌CowanⅠ株（SAC）（美國Sigma-Aldrich公司）。抗CD3、抗CD28抗體（美國eBioscience公司），重組人IL-23（rIL-23，美國R&D Systems公司），人IL-23酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（美國Bender MedSystems公司），人IL-17 Duoset ELISA檢測試劑盒（美國R&D Systems公司）。96孔平底細胞培養板（美國Costar公司）。
在鄭州大學第一附屬醫院眼科首次確診為活動期SO的10例患者納入本研究。其中，男性8例，女性2例；年齡19～62歲，平均年齡（38.60±12.68）歲。所有患者病程＜2個月，均符合活動期SO的診斷標準[15, 16]。患者均未使用過糖皮質激素和其他免疫抑制劑治療。選取患者家屬或健康志愿者10名作為對照。其中，男性7例，女性3例；年齡24～69歲，平均年齡（41.90±14.22）歲。兩組患者年齡（t=0.55，P=0.59）、性別分布比較（χ2=0.27，P=0.61）比較，差異均無統計學意義。所有參與者均簽署知情同意書。
采用密度梯度離心法分離PBMCs。取參與者靜脈血15～20 ml，加入10～25 U/ml肝素抗凝離心管內。將抗凝血緩慢加入淋巴細胞分離液面上（分離液：抗凝血=1.0:1.5）。室溫800×g離心20 min。沿離心管管壁周圍吸出細胞層，移入另一試管。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗細胞2次，以離心半徑12 cm、轉速800 r/min離心8 min。加入1 ml 1640細胞培養液，混勻，計數細胞。置于完全1640細胞培養液中，放入5%CO2、37℃細胞培養箱中培養。
調整PBMCs細胞濃度至2×106個/m1，200 μl/孔，置于96孔板中培養。將細胞分為A～D組。A組為正常人PBMCs；B組為SO患者PBMCs；C組為SO患者PBMCs，并在其培養液中加入0.5 μmol/L的雷公藤紅素；D組為SO患者PBMCs，并在其培養液中加入1.0 μmol/L的雷公藤紅素。每組設3個復孔，每孔加入SAC（1:500）刺激3 d，用于檢測IL-23含量；每孔加入抗CD3抗體（5 mg/ml）和抗CD28抗體（1 mg/ml）刺激3 d，用于檢測IL-17含量。重新取細胞培養后，向A、B組加入50 ng/ml rIL-23分別作為A1、B1組。再重新取細胞培養后，向A、B組加入50 ng/ml rIL-23+1 μmol/L雷公藤紅素分別作為A2、B2組。每組設3個復孔，每孔加入抗CD3抗體（5 mg/ml）和抗CD28抗體（1 mg/ml）刺激3 d，用于檢測IL-17含量。將96孔板置于5%CO2、37℃細胞培養箱中培養72 h。終止培養后收集上清液，?70℃保存。用ELISA檢測血清和PBMCs細胞培養上清液中IL-23、IL-17的含量。用酶標儀測定波長450 nm處的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。
采用SPSS 18.0統計學軟件進行統計分析。數據資料經W檢驗呈正態分布，以均數±標準差（
）表示。組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用獨立樣本 t 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
A～D組PBMCs細胞培養上清液中IL-23含量分別為（228.43±17.27）、（513.85±36.46）、（381.07±20.93）、（237.14±17.97）pg/ml。4組間比較，差異有統計學意義（F=306.65，P=0.00）。A組與B組（t=22.37，P=0.00）、A組與C組（t=17.79，P=0.00）、B組與C組（t=9.99，P=0.00）、B組與D組（t=21.53，P=0.00）、C組與D組（t=16.50，P=0.00）PBMCs細胞培養上清液中IL-23含量兩兩比較，差異均有統計學意義。A組與D組PBMCs細胞培養上清液中IL-23含量比較，差異無統計學意義（t=1.11，P=0.28）（圖1）。
圖1
各組PBMCs細胞培養上清液中IL-23含量比較
A～D組PBMCs細胞培養上清液中IL-17含量分別為（220.55±31.15）、（866.77±72.92）、（517.43±54.87）、（242.89±34.09）pg/ml。4組間比較，差異有統計學意義（F=348.24，P=0.00）。A組與B組（t=25.77，P=0.00）、A組與C組（t=14.88，P=0.00）、B組與C組（t=12.11，P=0.00）、B組與D組（t=24.51，P=0.00）、C組與D組（t=13.44，P=0.00）PBMCs細胞培養上清液中IL-17含量兩兩比較，差異均有統計學意義。A組與D組PBMCs細胞培養上清液中IL-17的含量比較，差異無統計學意義（t=1.53，P=0.14）（圖2）。
圖2
各組PBMCs細胞培養上清液中IL-17含量比較
重新取細胞培養后，A、A1、B、B1組PBMCs細胞培養上清液中IL-17含量為（215.63±20.31）、（417.33±22.05）、（865.47±74.89）、（1373.13±92.95）pg/ml。A1、B1組PBMCs細胞培養上清液中IL-17含量分別較A、B組增加，差異均有統計學意義（t=21.28、13.45，P=0.00、0.00）（圖3）。
圖3
重新取細胞培養后各組PBMCs細胞培養上清液中IL-17含量比較
再次取細胞培養后，A1、A2、B1、B2組PBMCs細胞培養上清液中IL-17含量分別為（428.43±24.53）、（229.15±23.28）、（1373.39±89.51）、（571.01±94.88）pg/ml。A2、B2組PBMCs細胞培養上清液中IL-17含量分別較A1、B1組明顯降低，差異均有統計學意義（t=18.63、19.45，P=0.00、0.00）（圖4）。
圖4
再次取細胞培養后各組PBMCs細胞培養上清液中IL-17含量比較
3 討論
本研究結果顯示，B組PBMCs細胞培養上清液中IL-23、IL-17含量均高于A組；A1組、B1組PBMCs細胞培養上清液中IL-23、IL-17含量分別高于A、B組。說明SO患者PBMCs分泌的IL-17較正常健康者更多，而IL-23能促進正常健康者或SO患者的PBMCs分泌更多的IL-17；這與以往其他類型葡萄膜炎的研究結果相似，提示IL-23/IL-17通路在SO的發生發展中可能發揮重要作用。
雷公藤紅素具有抗炎及免疫抑制、誘導細胞凋亡和抗腫瘤等作用，已被廣泛應用于一些自身免疫性疾病的治療[14, 17]。本研究結果顯示，C、D組PBMCs細胞培養上清液中IL-23、IL-17含量均較B組明顯降低，且D組與A組PBMCs細胞培養上清液中IL-23、IL-17含量無明顯差異；A2、B2組PBMCs細胞培養上清液中IL-23、IL-17含量分別較A1、B1組明顯降低。說明雷公藤紅素不僅可以明顯抑制SO患者PBMCs分泌IL-23和IL-17，而且可以抑制rIL-23刺激正常健康者和SO患者PBMCs分泌IL-17。提示雷公藤紅素抑制PBMCs分泌IL-17可能是通過抑制IL-23的分泌而發揮作用，為今后更深入的研究指明了方向。
本研究結果表明，雷公藤紅素可以抑制SO患者PBMCs分泌IL-17，其機制可能與抑制IL-23/IL-17通路發揮作用有關；但是否還有別的細胞因子參與其中或是雷公藤紅素通過影響哪些細胞信號通路發揮作用尚不清楚。另外，目前只針對PBMCs進行研究還不夠，今后研究應增加T細胞亞群流式檢測和增生實驗，測試雷公藤紅素對T細胞亞群分泌細胞因子的影響。待體外實驗研究較為完整時，再進行動物體內實驗，觀察雷公藤紅素對動物體內T細胞分泌IL-23、IL-17等細胞因子的影響，并探討其機制。
