引用本文： 陳春麗, 張翔, 呂驕, 田恬, 彭婕, 金海鷹, 張琦, 趙培泉. 視網膜格子樣變性并顆粒狀角膜營養不良一家系臨床觀察和基因突變檢測. 中華眼底病雜志, 2018, 34(1): 47-50. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.01.012 復制
視網膜格子樣變性特征表現為邊界清晰的環形視網膜內層變薄區，其上可見白線交錯與色素紊亂，可導致視網膜裂孔和孔源性視網膜脫離（RRD）；其發病機制不詳，部分家族表現為常染色體顯性遺傳[1]，也有研究發現COL4A4基因的改變可能導致視網膜格子樣變性的發生、發展[2]。角膜營養不良是一組原發性、雙眼性、非炎癥性且具有特征性組織病理學改變的遺傳性眼病[3]。目前已證實轉化生長因子β誘導（TGFBI）基因等多個基因突變與本病相關[4-6]。顆粒狀角膜營養不良（GCD）2型又稱為Avellino角膜營養不良，是其最常見類型，遺傳方式為常染色體顯性遺傳。我們對一個視網膜格子樣變性和GCD2型（GCD2） 3代家系中患者和健康者基因進行了測序。現將結果報道如下。
1 對象和方法
臨床驗證性研究。本研究獲上海交通大學附屬新華醫院倫理委員會審核批準；嚴格遵守赫爾辛基宣言，所有受試者或未成年監護人均簽署知情同意書。
一個三代常染色體顯性遺傳視網膜格子樣變性并GCD2家系中10名家庭成員納入研究。其中患者6例、健康成員4名。6例患者，男、女各3例；均為雙眼。年齡分別為39（Ⅱ3，先證者）、65（Ⅰ1）、41（Ⅱ1）、38（Ⅱ5）、14（Ⅲ4）、15（Ⅲ2）歲。4名健康者中，男、女各2名；年齡分別為 62（Ⅰ2）、11（Ⅲ1）、13（Ⅲ5）、4（Ⅲ3）歲。
采集家系成員的完整信息，繪制家系圖譜（圖1）。所有受試者均行視力、裂隙燈顯微鏡、三面鏡、眼底彩色照相、光相干斷層掃描、角膜內皮計數檢查。依據臨床檢查結果，患者符合GCD[7]、視網膜格子樣變性[8]診斷標準。患者既往均無眼外傷、葡萄膜炎和糖尿病、高血壓病史。健康者眼部檢查未發現角膜和周邊視網膜異常改變；其中屈光不正1名（Ⅲ1）。
圖1
家系圖
采集所有受試者以及與其共同生活、無相關遺傳性疾病的配偶外周靜脈血2 ml，全血基因組DNA提取試劑盒（QIGEN）提取DNA并編號。應用二代測序技術對提取的DNA行TGFBI基因的全外顯子組檢測，并對受試者以及配偶進行Sanger驗證（北京邁基諾基因科技股份有限公司）。
2 結果
6例患者12只眼中，視力數指/20 cm～1.0；眼壓8～18 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。角膜中央可見淺基質層雪花樣混濁（圖2）3例6只眼（Ⅱ3、Ⅱ1、Ⅱ5）；少量點狀淺基質層顆粒樣混濁（圖3）3例6只眼（Ⅰ1、Ⅲ4、Ⅲ2）。所有患眼角膜混濁間及周邊角膜清亮；角膜內皮細胞計數均正常。視網膜格子樣變性3例6只眼（Ⅱ3、Ⅱ1、Ⅰ1），其中RRD（圖4）3例4只眼；視網膜輕度變薄、未見明顯格子樣變性2例4只眼（Ⅲ4、Ⅲ2）。眼球旋轉震顫、眼底檢查未見明顯異常1例2只眼（Ⅱ5）。
圖2
先證者右眼眼前節像。2A. 角膜外眼像；2B. 角膜縱切面像。角膜中央可見淺基質層雪花樣混濁
圖3
患者左眼眼前節像。3A. 角膜外眼像；3B. 角膜縱切面像。角膜中央可見少量點狀淺基質層顆粒樣混濁
圖4
先證者右眼彩色眼底像。2～10點時鐘位視網膜青灰色高度隆起，10:30及14:00時鐘位可見格子樣變性區內裂孔及視網膜淺脫離（紅箭），累及黃斑區
RRD 4只眼（Ⅰ1、Ⅱ1）中，分別于20、10余年前已行視網膜脫離復位手術2只眼，目前視網膜均平復。其中，可見多處萎縮病灶1只眼；大量色素沉著、片狀視網膜前增生膜1只眼。行微創鞏膜外加壓手術2只眼，手術后視網膜平復，加壓嵴明顯。
本家系遺傳方式為常染色體顯性遺傳。基因檢測結果顯示，先證者和患者中Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅱ5、Ⅲ4的TGFBI第4外顯子均存在c.371G＞A錯義突變，該突變位點所對應的氨基酸改變為TGFBI基因所編碼蛋白的第124號氨基酸由精氨酸變異為組氨酸（p.R124H）（圖5，6）。功能預測該突變為likely pathogenic。
圖5
先證者基因二代測序結果。TGFBI基因chr5-135382096，371位堿基G突變為A，對應124號蛋白由精氨酸變異為組氨酸，雜合突變
圖6
TGFBI基因測序圖。5A～5D.分別為患者Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅱ5、Ⅲ4。TGFBI第4外顯子c.371G＞A p.R124H錯義突變（紅箭）
Sanger驗證結果顯示，患者Ⅲ2和家系中健康者、無血緣關系配偶均未見TGFBI基因突變（圖7）。TGFBI p.R124H為患者的致病突變位點，此突變與患者家系的角膜變性疾病表型存在共分離現象。攜帶該位點的患者均有不同程度臨床表型。
圖7
TGFBI基因測序圖。6A.先證者母親（Ⅰ 2）；6B.先證者配偶（Ⅱ 4）。TGFBI基因未見突變（紅箭）
3 討論
角膜營養不良分類國際委員會將GCD分為GCD1（經典型）、GCD2、Reis-Bücklers角膜營養不良（RBCD）三型。GCD2一般依據病史和裂隙燈顯微鏡檢查可做出初步臨床診斷，根據基因檢測可進一步對診斷進行分型。相關研究發現，GCD2的嚴重程度與R124H的突變程度有關，純合R124H突變引起的GCD2較雜合R124H突變引起的嚴重程度高[9]。
TGFBI基因包含17個外顯子，編碼683個氨基酸，所表達的產物被稱為角膜上皮蛋白（KE蛋白）[10]。Kim等[11]、Billings[12]等發現，KE蛋白與細胞外基質的層黏連蛋白、纖維連接蛋白、膠原蛋白Ⅰ聯系密切，與膠原蛋白Ⅱ、Ⅵ有一定聯系，而與Ⅳ聯系較少。可通過凋亡促進因子caspase-3與其中一個蛋白發生異常相互作用從而誘發凋亡。Kannabiran等[13]發現此蛋白主要通過fasc-2和4區域的Asp和Ile兩個氨基酸參與調控細胞間的黏附和爬行。突變過表達后的KE蛋白將擾亂這個過程，導致變性產物在角膜沉積和上皮反復糜爛[14]。
TGFBI基因R124C、R124H、R124L突變分別見于GCD1、GCD2、RBCD[15]。國內外研究已證實GCD2顯著的基因型-表型相關性，該變異不屬于多態性位點，與Avellino角膜營養不良相關[16]。本研究家系中患者均由TGFBI基因第4外顯子雜合R124H突變引起，其遺傳方式為常染色體顯性遺傳。文獻報道，R124H所致的GCD2占TGFBI基因型角膜營養不良的23.9%，此突變與GCD2的關聯一致率達97.4%[17]。其臨床表現為，患者常于童年開始發病，早期無癥狀，至中年視力減退就診，男女均可患病；雙眼對稱性角膜病變。裂隙燈下可見角膜中央部實質中、淺層散在分布灰白色顆粒狀小結節，邊界清楚，呈雪花樣或面包屑樣混濁。混濁間區角膜透明，角膜周邊不受累，未出現角膜潰瘍、糜爛等癥狀。目前國內外GCD合并視網膜格子樣變性所致的RRD報道尚少。本家系10名受檢者年齡3 ～65歲。先證者、先證者父親及哥哥均在35歲左右出現RRD，眼底檢查均發現RRD系原發周邊視網膜格子樣變性引起；3例患者均未有屈光不正、外傷及全身病史。家系中其余3例患者眼底未見合并視網膜格子樣變性，我們推測第3代個體可能尚未到視網膜格子樣變性的發病年齡，對該家系尚需加強隨訪及追蹤觀察。
周邊視網膜格子樣變性發病機制不詳，部分家系表現為常染色體顯性遺傳[1]，也有研究發現COL4A4基因的改變可能導致視網膜格子樣變性的發生、發展[2]。基因型與臨床表現型不同，先證者弟弟（Ⅱ5）也存在R124H突變引起的GCD2表現，但周邊視網膜未見格子樣變性，表明R124H突變只是引起GCD2的原因之一，可能還有其他基因和環境因素影響TGFBI基因。我們推測TGFBI基因突變也可能同時引起視網膜格子樣變性，將進一步收集多個視網膜格子樣變性家系并對其進行基因檢測，驗證TGFBI基因是否與周邊視網膜格子樣變性相關，亦或發現新的基因突變。另外值得注意的是，臨床工作中遇到角膜顆粒樣變性的患者，即使患者無眼前黑影等主訴，也應對其進行雙眼眼底檢查。本家系先證者外院就診時主訴左眼前黑影遮擋，視力正常，雙眼角膜顆粒樣變性，未進行眼底檢查，從而導致患者錯過最佳治療期。
視網膜格子樣變性特征表現為邊界清晰的環形視網膜內層變薄區，其上可見白線交錯與色素紊亂，可導致視網膜裂孔和孔源性視網膜脫離（RRD）；其發病機制不詳，部分家族表現為常染色體顯性遺傳[1]，也有研究發現COL4A4基因的改變可能導致視網膜格子樣變性的發生、發展[2]。角膜營養不良是一組原發性、雙眼性、非炎癥性且具有特征性組織病理學改變的遺傳性眼病[3]。目前已證實轉化生長因子β誘導（TGFBI）基因等多個基因突變與本病相關[4-6]。顆粒狀角膜營養不良（GCD）2型又稱為Avellino角膜營養不良，是其最常見類型，遺傳方式為常染色體顯性遺傳。我們對一個視網膜格子樣變性和GCD2型（GCD2） 3代家系中患者和健康者基因進行了測序。現將結果報道如下。
1 對象和方法
臨床驗證性研究。本研究獲上海交通大學附屬新華醫院倫理委員會審核批準；嚴格遵守赫爾辛基宣言，所有受試者或未成年監護人均簽署知情同意書。
一個三代常染色體顯性遺傳視網膜格子樣變性并GCD2家系中10名家庭成員納入研究。其中患者6例、健康成員4名。6例患者，男、女各3例；均為雙眼。年齡分別為39（Ⅱ3，先證者）、65（Ⅰ1）、41（Ⅱ1）、38（Ⅱ5）、14（Ⅲ4）、15（Ⅲ2）歲。4名健康者中，男、女各2名；年齡分別為 62（Ⅰ2）、11（Ⅲ1）、13（Ⅲ5）、4（Ⅲ3）歲。
采集家系成員的完整信息，繪制家系圖譜（圖1）。所有受試者均行視力、裂隙燈顯微鏡、三面鏡、眼底彩色照相、光相干斷層掃描、角膜內皮計數檢查。依據臨床檢查結果，患者符合GCD[7]、視網膜格子樣變性[8]診斷標準。患者既往均無眼外傷、葡萄膜炎和糖尿病、高血壓病史。健康者眼部檢查未發現角膜和周邊視網膜異常改變；其中屈光不正1名（Ⅲ1）。
圖1
家系圖
采集所有受試者以及與其共同生活、無相關遺傳性疾病的配偶外周靜脈血2 ml，全血基因組DNA提取試劑盒（QIGEN）提取DNA并編號。應用二代測序技術對提取的DNA行TGFBI基因的全外顯子組檢測，并對受試者以及配偶進行Sanger驗證（北京邁基諾基因科技股份有限公司）。
2 結果
6例患者12只眼中，視力數指/20 cm～1.0；眼壓8～18 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。角膜中央可見淺基質層雪花樣混濁（圖2）3例6只眼（Ⅱ3、Ⅱ1、Ⅱ5）；少量點狀淺基質層顆粒樣混濁（圖3）3例6只眼（Ⅰ1、Ⅲ4、Ⅲ2）。所有患眼角膜混濁間及周邊角膜清亮；角膜內皮細胞計數均正常。視網膜格子樣變性3例6只眼（Ⅱ3、Ⅱ1、Ⅰ1），其中RRD（圖4）3例4只眼；視網膜輕度變薄、未見明顯格子樣變性2例4只眼（Ⅲ4、Ⅲ2）。眼球旋轉震顫、眼底檢查未見明顯異常1例2只眼（Ⅱ5）。
圖2
先證者右眼眼前節像。2A. 角膜外眼像；2B. 角膜縱切面像。角膜中央可見淺基質層雪花樣混濁
圖3
患者左眼眼前節像。3A. 角膜外眼像；3B. 角膜縱切面像。角膜中央可見少量點狀淺基質層顆粒樣混濁
圖4
先證者右眼彩色眼底像。2～10點時鐘位視網膜青灰色高度隆起，10:30及14:00時鐘位可見格子樣變性區內裂孔及視網膜淺脫離（紅箭），累及黃斑區
RRD 4只眼（Ⅰ1、Ⅱ1）中，分別于20、10余年前已行視網膜脫離復位手術2只眼，目前視網膜均平復。其中，可見多處萎縮病灶1只眼；大量色素沉著、片狀視網膜前增生膜1只眼。行微創鞏膜外加壓手術2只眼，手術后視網膜平復，加壓嵴明顯。
本家系遺傳方式為常染色體顯性遺傳。基因檢測結果顯示，先證者和患者中Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅱ5、Ⅲ4的TGFBI第4外顯子均存在c.371G＞A錯義突變，該突變位點所對應的氨基酸改變為TGFBI基因所編碼蛋白的第124號氨基酸由精氨酸變異為組氨酸（p.R124H）（圖5，6）。功能預測該突變為likely pathogenic。
圖5
先證者基因二代測序結果。TGFBI基因chr5-135382096，371位堿基G突變為A，對應124號蛋白由精氨酸變異為組氨酸，雜合突變
圖6
TGFBI基因測序圖。5A～5D.分別為患者Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅱ5、Ⅲ4。TGFBI第4外顯子c.371G＞A p.R124H錯義突變（紅箭）
Sanger驗證結果顯示，患者Ⅲ2和家系中健康者、無血緣關系配偶均未見TGFBI基因突變（圖7）。TGFBI p.R124H為患者的致病突變位點，此突變與患者家系的角膜變性疾病表型存在共分離現象。攜帶該位點的患者均有不同程度臨床表型。
圖7
TGFBI基因測序圖。6A.先證者母親（Ⅰ 2）；6B.先證者配偶（Ⅱ 4）。TGFBI基因未見突變（紅箭）
3 討論
角膜營養不良分類國際委員會將GCD分為GCD1（經典型）、GCD2、Reis-Bücklers角膜營養不良（RBCD）三型。GCD2一般依據病史和裂隙燈顯微鏡檢查可做出初步臨床診斷，根據基因檢測可進一步對診斷進行分型。相關研究發現，GCD2的嚴重程度與R124H的突變程度有關，純合R124H突變引起的GCD2較雜合R124H突變引起的嚴重程度高[9]。
TGFBI基因包含17個外顯子，編碼683個氨基酸，所表達的產物被稱為角膜上皮蛋白（KE蛋白）[10]。Kim等[11]、Billings[12]等發現，KE蛋白與細胞外基質的層黏連蛋白、纖維連接蛋白、膠原蛋白Ⅰ聯系密切，與膠原蛋白Ⅱ、Ⅵ有一定聯系，而與Ⅳ聯系較少。可通過凋亡促進因子caspase-3與其中一個蛋白發生異常相互作用從而誘發凋亡。Kannabiran等[13]發現此蛋白主要通過fasc-2和4區域的Asp和Ile兩個氨基酸參與調控細胞間的黏附和爬行。突變過表達后的KE蛋白將擾亂這個過程，導致變性產物在角膜沉積和上皮反復糜爛[14]。
TGFBI基因R124C、R124H、R124L突變分別見于GCD1、GCD2、RBCD[15]。國內外研究已證實GCD2顯著的基因型-表型相關性，該變異不屬于多態性位點，與Avellino角膜營養不良相關[16]。本研究家系中患者均由TGFBI基因第4外顯子雜合R124H突變引起，其遺傳方式為常染色體顯性遺傳。文獻報道，R124H所致的GCD2占TGFBI基因型角膜營養不良的23.9%，此突變與GCD2的關聯一致率達97.4%[17]。其臨床表現為，患者常于童年開始發病，早期無癥狀，至中年視力減退就診，男女均可患病；雙眼對稱性角膜病變。裂隙燈下可見角膜中央部實質中、淺層散在分布灰白色顆粒狀小結節，邊界清楚，呈雪花樣或面包屑樣混濁。混濁間區角膜透明，角膜周邊不受累，未出現角膜潰瘍、糜爛等癥狀。目前國內外GCD合并視網膜格子樣變性所致的RRD報道尚少。本家系10名受檢者年齡3 ～65歲。先證者、先證者父親及哥哥均在35歲左右出現RRD，眼底檢查均發現RRD系原發周邊視網膜格子樣變性引起；3例患者均未有屈光不正、外傷及全身病史。家系中其余3例患者眼底未見合并視網膜格子樣變性，我們推測第3代個體可能尚未到視網膜格子樣變性的發病年齡，對該家系尚需加強隨訪及追蹤觀察。
周邊視網膜格子樣變性發病機制不詳，部分家系表現為常染色體顯性遺傳[1]，也有研究發現COL4A4基因的改變可能導致視網膜格子樣變性的發生、發展[2]。基因型與臨床表現型不同，先證者弟弟（Ⅱ5）也存在R124H突變引起的GCD2表現，但周邊視網膜未見格子樣變性，表明R124H突變只是引起GCD2的原因之一，可能還有其他基因和環境因素影響TGFBI基因。我們推測TGFBI基因突變也可能同時引起視網膜格子樣變性，將進一步收集多個視網膜格子樣變性家系并對其進行基因檢測，驗證TGFBI基因是否與周邊視網膜格子樣變性相關，亦或發現新的基因突變。另外值得注意的是，臨床工作中遇到角膜顆粒樣變性的患者，即使患者無眼前黑影等主訴，也應對其進行雙眼眼底檢查。本家系先證者外院就診時主訴左眼前黑影遮擋，視力正常，雙眼角膜顆粒樣變性，未進行眼底檢查，從而導致患者錯過最佳治療期。
