Ras同源蛋白（Rho）/Rho激酶（ROCK）通路是廣泛存在于人和哺乳動物細胞內的一種信號傳導通路，與視神經損害后修復受抑制密切相關。視神經損傷后，活化的Rho水平升高，ROCK表達上調，并激活其下游一系列串聯反應產生抑制軸突延伸和神經修復的效應；而ROCK抑制劑可阻斷這一過程，促進損傷視神經的修復，保護受損視網膜神經節細胞并促進軸突再生和延伸，還能抑制瘢痕形成、降低眼壓以及可能存在一定的抗炎作用。目前，部分種類的ROCK抑制劑已投入臨床使用，其應用價值日益凸顯，有望成為視神經疾病的新一代治療藥物。
引用本文： 王曉玲, 陳長征. Ras同源蛋白/ras同源蛋白激酶通路及其抑制劑在視神經疾病中的作用研究現狀. 中華眼底病雜志, 2017, 33(5): 548-550. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2017.05.031 復制
Ras同源蛋白（Rho）是鳥苷酸結合蛋白偶聯受體膜受體超家族的一員，與視網膜炎癥反應、新生血管生成、神經元和神經膠質細胞損傷等有關[1]。Rho/Rho激酶（ROCK）通路是廣泛存在于人和哺乳動物細胞內的一種信號傳導通路，與視神經損害后修復受抑制密切相關[2]。目前國內針對Rho/ROCK的研究多集中在視網膜色素變性、糖尿病視網膜病變等視網膜變性性疾病和血管性疾病[1, 3]，而對其在視神經疾病中的作用并不清楚。現就Rho/ROCK通路及其抑制劑在視神經疾病中的作用研究現狀進行綜述，為臨床探尋Rho/ROCK通路抑制損害后視神經修復困難的機制及ROCK抑制劑的神經保護作用提供理論依據。
1 Rho/ROCK通路與ROCK抑制劑
Rho是一種存在于細胞質內的三磷酸鳥苷（GTP）磷酸酶，其與GTP結合，催化GTP水解為二磷酸鳥苷，產生的高能磷酸鍵激活ROCK，隨后繼續磷酸化其下游信號分子[4]。ROCK屬于絲氨酸-蘇氨酸家族的蛋白，包括ROCK-Ⅰ（p160 ROCK或ROCKβ）和ROCK-Ⅱ（ROCKα）兩種亞型。Fujisawa等[5]發現，ROCK-Ⅰ在人類除腦組織外的包括心臟、胰腺、肺、肝、骨骼肌以及腎臟在內的絕大多臟器中均有表達。Takahashi等[6]于1999年成功從人腦組織的cDNA庫中分離出ROCK-Ⅱ亞型。Nakagawa等[7]在動物實驗中發現，ROCK-Ⅰ和ROCK-Ⅱ在鼠體內包括腦在內的所有組織均有表達，但ROCK-Ⅰ優先表達在肝、脾和腎，而ROCK-Ⅱ優先表達在腦和骨骼肌。ROCK表達受其上游信號分子的調節，其上游信號分子有髓磷脂相關性糖蛋白（MAG）、神經突增生抑制劑（Nogo）、少突細胞髓磷脂糖蛋白（OMgp）、硫酸軟骨素蛋白聚糖等4種髓磷脂相關蛋白[8-10]。ROCK下游效應器包括肌球蛋白輕鏈（MLC）及MLC磷酸酶、LIM激酶（LIMK）、ERM家族、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、核因子-κB、微管結合蛋白（MAPs）、腦衰蛋白調停蛋白2、張力蛋白同系物（PTEN）。其中，PTEN與神經元存活和軸突再生密切相關[11]；MAPs促進神經突延伸[12]。GFAP是一種中間絲狀體蛋白，大量表達于星型膠質細胞，在修補神經系統損傷以及形成膠質瘢痕方面起重要作用[13]。
ROCK抑制劑通過抑制ROCK及其下游效應器的功能發揮神經元保護及促進軸突延伸的作用，且該作用已在青光眼、神經元變性等疾病中被證實[14-16]。目前用于研究的ROCK抑制劑包括Y-39983、Y-27632、二甲基法舒地爾（Dimethylfasudil或H-1152）、法舒地爾（fasudil或HA-1077）和K-115（ripasudil）等。并非所有ROCK抑制劑均有促進軸突延伸的作用；其中，法舒地爾僅促進神經膠質細胞的活動，保護幸存神經元，但無促進軸突延伸的作用[17]。
2 Rho/ROCK通路及其抑制劑在青光眼中的作用
青光眼是一組以特征性視神經萎縮和視野缺損為共同特征的慢性神經變性疾病[18]。高眼壓的機械壓迫或血管因素造成視網膜缺血、視網膜神經節細胞（RGC）能量供應不足，進而導致RGC死亡和軸突破壞[19]。青光眼患者的病情進展與視神經及RGC的損害密切相關。因此，對視神經及RGC進行保護可減緩青光眼患者的病情進展。青光眼患者RGC死亡機制推測與缺血損害、一氧化氮（NO）誘導的氧化損傷以及谷氨酸鹽興奮性中毒有關。其中，氧化應激損傷與ROCK通路密切相關[20]。Yamamoto等[21]研究表明，在青光眼的視神經損傷動物模型中，活化的Rho水平升高，ROCK表達加強，作為媒介的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶mRNA水平隨之升高，氧化產物堆積，最終導致RGC死亡。
ROCK抑制劑可以抑制ROCK繼續磷酸化其下游效應器MLC，重塑細胞骨架結構，降低小梁網的水密性，促進房水通過小梁網排入Schlemm’s管；同時，還可減小Schlemm’s管內壁細胞單層分子跨上皮電阻及管壁細胞內蛋白復合體的緊密連接，增加其通透性，促進房水排出進而達到降低眼壓的效果[22, 23]。Kaneko等[23]發現，對于正常眼壓的家兔和猴，Y-27632、fasudil和K-115等ROCK抑制劑與拉坦前列素、噻嗎洛爾和布那唑嗪等降眼壓藥物能取得相同的降壓效果；其中，K-115的有效藥物濃度較Y-27632和fasudil更低，且為首個在日本獲批應用于青光眼的ROCK抑制劑。因ROCK抑制劑降眼壓機制與碳酸酐酶抑制劑、前列腺素類及β2腎上腺素受體阻滯劑等各不相同，ROCK抑制劑有望與以上各類藥物協同降眼壓。此外，ROCK抑制劑還可抑制纖維母細胞過度分化為肌成纖維細胞，抑制瘢痕形成，提高濾過手術效果[24, 25]。
ROCK抑制劑可通過抑制ROCK的表達阻斷氧化應激過程，減少氧化產物堆積，提高RGC存活率。Yamamoto等[21]發現，K-115和法舒地爾兩種ROCK抑制劑均能發揮間接抑制氧化產物堆積的作用，達到保護RGC的目的。Koch和Lingor[26]在實驗中也得出了相同結論，即在青光眼動物模型和患者的視網膜內ROCK表達上調，而當抑制ROCK表達時，軸突變性速度減慢，RGC存活率增加。完整的RGC為軸突的延伸提供有利條件。此外，ROCK抑制劑還可解除受損視神經周圍的抑制環境來達到促進軸突延伸的目的[27]。這些研究結果說明ROCK通路的表達與青光眼疾病進展有關，ROCK抑制劑具有保護RGC并促進軸突延伸的作用。提示ROCK抑制劑有望成為新一代青光眼治療藥物。
3 Rho/ROCK通路及其抑制劑在視神經機械性損傷中的作用
視神經機械性損傷是指擠壓、外傷或鉗夾等機械因素造成血管營養障礙、急性壓迫性損傷、視神經鞘內出血、視神經挫裂或離斷，導致視神經功能部分或全部喪失，進而出現逆行性RGC死亡[28]。與此同時，機體自我修復機制啟動，但受損神經的修復不僅與其自身細胞性能有關，還與細胞周圍環境密切相關。MAG、Nogo、OMgp等ROCK上游信號分子廣泛存在于病變位置的少突細胞胞膜和膠質瘢痕處，這些信號分子通過ROCK通路繼續磷酸化其下游的LIMK，導致神經細胞的生長錐萎陷，軸突再生障礙，而這一串聯效應可被ROCK通路抑制劑阻斷[29, 30]。Yang等[14]在大鼠視神經鉗夾傷（ONC）模型的實驗中發現，ONC+Y-39983組存活RGC密度和軸突數目均明顯高于ONC+磷酸鹽緩沖液（PBS）組。正常對照組、ONC+PBS組以及ONC+Y-39983組各組間總的Rho蛋白水平不變；但ONC+PBS組視網膜和視神經內活化的Rho水平升高，ROCK mRNA表達上調；而ONC+Y-39983組活化的Rho水平降低，ROCK mRNA表達下調。說明Y-39983可通過抑制活化的Rho水平及ROCK mRNA表達發揮促進RGC存活及軸突生長的作用。Sagawa等[30]研究證實，Y-39983增加延伸軸突數目的作用強于Y-27632，前者效力約為后者的30倍；在各自促進軸突延長的最適濃度下，兩組軸突延伸的長度無明顯差異；同時，2周內重復或連續給藥可以進一步促進軸突延伸，但過高的藥物濃度會對軸突延伸產生抑制作用。
4 Rho/ROCK通路及其抑制劑在非動脈炎性前部缺血性視神經病變（NAION）中的作用
NAION是一種多發于老年人的視神經缺血、缺氧性損害，軸突損害后，神經細胞周圍的抑制性環境強烈抑制軸突再生，隨后導致RGC死亡，進而出現視神經功能障礙[31, 32]。視神經缺血梗死后，RGC層活化的Rho水平逐漸升高，下游后續反應與視神經挫傷具有一定的相似性，均出現神經損傷修復困難的現象；同時，伴隨血視網膜屏障的破壞，多核白細胞迅速聚集、浸潤，在梗死區域的視神經及RGC層內，巨噬細胞及小膠質細胞等炎性細胞水平隨之升高，且與活化的Rho水平變化趨勢及達峰時間呈現高度一致性。
ROCK抑制劑可促進NO合酶的表達，提高血管內皮中NO濃度，抑制其下游MLC的磷酸化，降低血管緊張度，從而增加視神經血流量，提高RGC存活率，同時為軸突修復提供有利條件。此外，ROCK抑制劑還參與介導炎性細胞的遷移，抑制炎癥反應[33]。Hayreh和Zimmerman[34]在應用玻璃體腔注射法舒地爾治療NAION的臨床研究中發現，與NAION自然病程視力預后相比，玻璃體腔注射法舒地爾組視力預后更好。ROCK抑制劑對NAION有一定療效，但具體機制尚缺乏相關研究，可能與ROCK抑制劑舒張血管、保護神經元及其抗炎作用有關[35-37]。
Ras同源蛋白（Rho）是鳥苷酸結合蛋白偶聯受體膜受體超家族的一員，與視網膜炎癥反應、新生血管生成、神經元和神經膠質細胞損傷等有關[1]。Rho/Rho激酶（ROCK）通路是廣泛存在于人和哺乳動物細胞內的一種信號傳導通路，與視神經損害后修復受抑制密切相關[2]。目前國內針對Rho/ROCK的研究多集中在視網膜色素變性、糖尿病視網膜病變等視網膜變性性疾病和血管性疾病[1, 3]，而對其在視神經疾病中的作用并不清楚。現就Rho/ROCK通路及其抑制劑在視神經疾病中的作用研究現狀進行綜述，為臨床探尋Rho/ROCK通路抑制損害后視神經修復困難的機制及ROCK抑制劑的神經保護作用提供理論依據。
1 Rho/ROCK通路與ROCK抑制劑
Rho是一種存在于細胞質內的三磷酸鳥苷（GTP）磷酸酶，其與GTP結合，催化GTP水解為二磷酸鳥苷，產生的高能磷酸鍵激活ROCK，隨后繼續磷酸化其下游信號分子[4]。ROCK屬于絲氨酸-蘇氨酸家族的蛋白，包括ROCK-Ⅰ（p160 ROCK或ROCKβ）和ROCK-Ⅱ（ROCKα）兩種亞型。Fujisawa等[5]發現，ROCK-Ⅰ在人類除腦組織外的包括心臟、胰腺、肺、肝、骨骼肌以及腎臟在內的絕大多臟器中均有表達。Takahashi等[6]于1999年成功從人腦組織的cDNA庫中分離出ROCK-Ⅱ亞型。Nakagawa等[7]在動物實驗中發現，ROCK-Ⅰ和ROCK-Ⅱ在鼠體內包括腦在內的所有組織均有表達，但ROCK-Ⅰ優先表達在肝、脾和腎，而ROCK-Ⅱ優先表達在腦和骨骼肌。ROCK表達受其上游信號分子的調節，其上游信號分子有髓磷脂相關性糖蛋白（MAG）、神經突增生抑制劑（Nogo）、少突細胞髓磷脂糖蛋白（OMgp）、硫酸軟骨素蛋白聚糖等4種髓磷脂相關蛋白[8-10]。ROCK下游效應器包括肌球蛋白輕鏈（MLC）及MLC磷酸酶、LIM激酶（LIMK）、ERM家族、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、核因子-κB、微管結合蛋白（MAPs）、腦衰蛋白調停蛋白2、張力蛋白同系物（PTEN）。其中，PTEN與神經元存活和軸突再生密切相關[11]；MAPs促進神經突延伸[12]。GFAP是一種中間絲狀體蛋白，大量表達于星型膠質細胞，在修補神經系統損傷以及形成膠質瘢痕方面起重要作用[13]。
ROCK抑制劑通過抑制ROCK及其下游效應器的功能發揮神經元保護及促進軸突延伸的作用，且該作用已在青光眼、神經元變性等疾病中被證實[14-16]。目前用于研究的ROCK抑制劑包括Y-39983、Y-27632、二甲基法舒地爾（Dimethylfasudil或H-1152）、法舒地爾（fasudil或HA-1077）和K-115（ripasudil）等。并非所有ROCK抑制劑均有促進軸突延伸的作用；其中，法舒地爾僅促進神經膠質細胞的活動，保護幸存神經元，但無促進軸突延伸的作用[17]。
2 Rho/ROCK通路及其抑制劑在青光眼中的作用
青光眼是一組以特征性視神經萎縮和視野缺損為共同特征的慢性神經變性疾病[18]。高眼壓的機械壓迫或血管因素造成視網膜缺血、視網膜神經節細胞（RGC）能量供應不足，進而導致RGC死亡和軸突破壞[19]。青光眼患者的病情進展與視神經及RGC的損害密切相關。因此，對視神經及RGC進行保護可減緩青光眼患者的病情進展。青光眼患者RGC死亡機制推測與缺血損害、一氧化氮（NO）誘導的氧化損傷以及谷氨酸鹽興奮性中毒有關。其中，氧化應激損傷與ROCK通路密切相關[20]。Yamamoto等[21]研究表明，在青光眼的視神經損傷動物模型中，活化的Rho水平升高，ROCK表達加強，作為媒介的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶mRNA水平隨之升高，氧化產物堆積，最終導致RGC死亡。
ROCK抑制劑可以抑制ROCK繼續磷酸化其下游效應器MLC，重塑細胞骨架結構，降低小梁網的水密性，促進房水通過小梁網排入Schlemm’s管；同時，還可減小Schlemm’s管內壁細胞單層分子跨上皮電阻及管壁細胞內蛋白復合體的緊密連接，增加其通透性，促進房水排出進而達到降低眼壓的效果[22, 23]。Kaneko等[23]發現，對于正常眼壓的家兔和猴，Y-27632、fasudil和K-115等ROCK抑制劑與拉坦前列素、噻嗎洛爾和布那唑嗪等降眼壓藥物能取得相同的降壓效果；其中，K-115的有效藥物濃度較Y-27632和fasudil更低，且為首個在日本獲批應用于青光眼的ROCK抑制劑。因ROCK抑制劑降眼壓機制與碳酸酐酶抑制劑、前列腺素類及β2腎上腺素受體阻滯劑等各不相同，ROCK抑制劑有望與以上各類藥物協同降眼壓。此外，ROCK抑制劑還可抑制纖維母細胞過度分化為肌成纖維細胞，抑制瘢痕形成，提高濾過手術效果[24, 25]。
ROCK抑制劑可通過抑制ROCK的表達阻斷氧化應激過程，減少氧化產物堆積，提高RGC存活率。Yamamoto等[21]發現，K-115和法舒地爾兩種ROCK抑制劑均能發揮間接抑制氧化產物堆積的作用，達到保護RGC的目的。Koch和Lingor[26]在實驗中也得出了相同結論，即在青光眼動物模型和患者的視網膜內ROCK表達上調，而當抑制ROCK表達時，軸突變性速度減慢，RGC存活率增加。完整的RGC為軸突的延伸提供有利條件。此外，ROCK抑制劑還可解除受損視神經周圍的抑制環境來達到促進軸突延伸的目的[27]。這些研究結果說明ROCK通路的表達與青光眼疾病進展有關，ROCK抑制劑具有保護RGC并促進軸突延伸的作用。提示ROCK抑制劑有望成為新一代青光眼治療藥物。
3 Rho/ROCK通路及其抑制劑在視神經機械性損傷中的作用
視神經機械性損傷是指擠壓、外傷或鉗夾等機械因素造成血管營養障礙、急性壓迫性損傷、視神經鞘內出血、視神經挫裂或離斷，導致視神經功能部分或全部喪失，進而出現逆行性RGC死亡[28]。與此同時，機體自我修復機制啟動，但受損神經的修復不僅與其自身細胞性能有關，還與細胞周圍環境密切相關。MAG、Nogo、OMgp等ROCK上游信號分子廣泛存在于病變位置的少突細胞胞膜和膠質瘢痕處，這些信號分子通過ROCK通路繼續磷酸化其下游的LIMK，導致神經細胞的生長錐萎陷，軸突再生障礙，而這一串聯效應可被ROCK通路抑制劑阻斷[29, 30]。Yang等[14]在大鼠視神經鉗夾傷（ONC）模型的實驗中發現，ONC+Y-39983組存活RGC密度和軸突數目均明顯高于ONC+磷酸鹽緩沖液（PBS）組。正常對照組、ONC+PBS組以及ONC+Y-39983組各組間總的Rho蛋白水平不變；但ONC+PBS組視網膜和視神經內活化的Rho水平升高，ROCK mRNA表達上調；而ONC+Y-39983組活化的Rho水平降低，ROCK mRNA表達下調。說明Y-39983可通過抑制活化的Rho水平及ROCK mRNA表達發揮促進RGC存活及軸突生長的作用。Sagawa等[30]研究證實，Y-39983增加延伸軸突數目的作用強于Y-27632，前者效力約為后者的30倍；在各自促進軸突延長的最適濃度下，兩組軸突延伸的長度無明顯差異；同時，2周內重復或連續給藥可以進一步促進軸突延伸，但過高的藥物濃度會對軸突延伸產生抑制作用。
4 Rho/ROCK通路及其抑制劑在非動脈炎性前部缺血性視神經病變（NAION）中的作用
NAION是一種多發于老年人的視神經缺血、缺氧性損害，軸突損害后，神經細胞周圍的抑制性環境強烈抑制軸突再生，隨后導致RGC死亡，進而出現視神經功能障礙[31, 32]。視神經缺血梗死后，RGC層活化的Rho水平逐漸升高，下游后續反應與視神經挫傷具有一定的相似性，均出現神經損傷修復困難的現象；同時，伴隨血視網膜屏障的破壞，多核白細胞迅速聚集、浸潤，在梗死區域的視神經及RGC層內，巨噬細胞及小膠質細胞等炎性細胞水平隨之升高，且與活化的Rho水平變化趨勢及達峰時間呈現高度一致性。
ROCK抑制劑可促進NO合酶的表達，提高血管內皮中NO濃度，抑制其下游MLC的磷酸化，降低血管緊張度，從而增加視神經血流量，提高RGC存活率，同時為軸突修復提供有利條件。此外，ROCK抑制劑還參與介導炎性細胞的遷移，抑制炎癥反應[33]。Hayreh和Zimmerman[34]在應用玻璃體腔注射法舒地爾治療NAION的臨床研究中發現，與NAION自然病程視力預后相比，玻璃體腔注射法舒地爾組視力預后更好。ROCK抑制劑對NAION有一定療效，但具體機制尚缺乏相關研究，可能與ROCK抑制劑舒張血管、保護神經元及其抗炎作用有關[35-37]。