引用本文： 周賢慧, 孟旭霞, 胡迭. 軸突導向因子-1對糖尿病大鼠視網膜Müller細胞活化的影響. 中華眼底病雜志, 2017, 33(5): 527-529. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2017.05.020 復制
研究發現，糖尿病（DM）視網膜病變（DR）在視網膜血管發生改變之前其視網膜神經膠質細胞即出現異常[1]。Müller細胞是視網膜最主要的膠質細胞。在DR進程中，異常活化的Müller細胞促進血管內皮生長因子（VEGF）及堿性成纖維細胞生長因子釋放，導致視網膜新生血管生成及纖維化[2, 3]。軸突導向因子（netrin-1）是目前已知的最主要神經生長導向因子。近年研究發現，netrin-1在新生血管生成中發揮重要作用[4, 5]。我們推測，如能通過外源性netrin-1早期干預Müller細胞，降低其異常活化，減少視網膜新生血管形成，可能減緩DR進程。為驗證這一推測，本研究觀察了外源性netrin-1對DM大鼠視網膜Müller細胞活化的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
健康清潔級成年雄性Sprague-Dawley大鼠50只，體重約250 g，由山東魯抗醫藥公司提供。所有動物的飼養及管理均符合國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。采用隨機數字表法將50只大鼠隨機分為正常對照組（A組）、正常+平衡鹽溶液（BSS）組（B組）、正常+netrin-1 100 μg/ml組（C組）、DM+BSS組（D組）、DM+netrin-1 100 μg/ml組（E組），每組10只。D、E組大鼠按60 mg/kg的劑量，左下腹腔注射鏈脲佐菌素誘導DM動物模型。以注射72 h后空腹血糖≥16.5 mmol/L為DM模型建立成功[6]。建模成功率為100%。建模3個月后，C、E組大鼠玻璃體腔分別注射100 μg/ml netrin-1 5 μl。B、D組大鼠玻璃體腔注射等體積BSS。A組大鼠不做任何處理。
10%水合氯醛按0.3 ml/100 g劑量腹腔注射麻醉大鼠，行前房穿刺，放出少量房水，微量加樣器取5 μl netrin-1自大鼠顳上方角膜緣后1.5～2.0 mm處以45°角刺入玻璃體腔，緩慢注入netrin-1，注射完畢后按壓穿刺口3 min，無滲出，涂氧氟沙星眼膏。所有實驗大鼠均未出現注射相關的高眼壓及鞏膜口漏等并發癥。
采用免疫組織化學染色法檢測大鼠視網膜膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）的表達。玻璃體腔注射netrin-1后1個月，過量麻醉處死大鼠，迅速摘除眼球作石蠟切片。常規脫蠟和水化后，5%山羊血清封閉，一抗用1:200兔抗大鼠GFAP多克隆抗體，二抗用生物素標記山羊抗兔IgG抗體，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察并照相，以血管內皮細胞膜呈棕黃色為陽性表達。采用Image pro plus 6.0軟件對圖像進行分析。以平均積分吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值表示視網膜中GFAP的表達量。
采用熒光定量聚合酶鏈反應檢測大鼠視網膜GFAP mRNA表達。玻璃體腔注射netrin-1后1個月，過量麻醉處死大鼠。視網膜稱重，按照每50～l00 mg加1 ml RNAiso Plus裂解視網膜，提取視網膜總RNA，去除RNA內殘留的DNA，逆轉錄成cDNA，以β-肌動蛋白（β-actin）作為內參照。用GFAP引物SYBR GreenⅠ嵌合熒光法擴增相應基因。GFAP：上游引物5′-ACCGCATCACCATTCCTGTA-3′，下游引物5′-GCACACCTCACATCACATCC-3′。β-actin：上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。退火溫度60℃，40個循環后形成擴增曲線，記錄熒光值到達閾值時所經歷的循環閾值。將A組大鼠視網膜GFAP mRNA表達設定為1，計算其他各組大鼠視網膜GFAP mRNA表達。
采用SPSS16.0統計軟件進行統計學分析。定量資料結果以均數±標準差（
）表示，兩獨立樣本間比較采用獨立樣本 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
免疫組織化學染色結果顯示，A～C組大鼠視網膜僅在神經纖維層及神經節細胞層可見少量GFAP陽性表達。D組大鼠視網膜GFAP陽性表達增強。E組大鼠視網膜GFAP陽性表達較D組減少（圖1）。
圖1
大鼠視網膜GFAP免疫組織化學染色像。1A. B組；1B. C組；1C. D組；1D. E組。B、C組大鼠視網膜僅在神經纖維層及神經節細胞層可見少量GFAP陽性表達；D組大鼠視網膜GFAP陽性表達增多；E組大鼠視網膜GFAP陽性表達較D組減少 DAB ×40
A～E組大鼠視網膜GFAP陽性表達、mRNA表達比較，差異有統計學意義（F=203.43、72.91，P=0.00、0.00）（表1）。與A組比較，D組大鼠視網膜GFAP陽性表達、mRNA表達明顯增多，差異有統計學意義（t=?26.01、22.26，P=0.00、0.00）。E組大鼠視網膜GFAP陽性表達、mRNA表達較D組明顯下降（t=?10.78、3.93，P=0.00、0.00）；但仍高于A組（t=7.00、?9.82，P=0.00、0.00），差異均有統計學意義。A、C組大鼠視網膜GFAP陽性表達、mRNA表達比較，差異均無統計學意義（t=?0.29、0.50，P=0.77、0.62）。
表1
各組大鼠視網膜GFAP陽性表達、mRNA表達比較（
）
3 討論
Müller細胞是視網膜最主要的膠質細胞，位于視網膜內界膜與外界膜之間，橫跨整個視網膜；參與構成血視網膜屏障，支撐視網膜結構，釋放神經遞質和營養因子，保護及營養視神經細胞等重要作用[7]。GFAP是膠質細胞的特異性標記物。正常大鼠Müller細胞極少甚至不表達GFAP；而在DR中，Müller細胞異常活化，分泌生長因子和炎性介質，導致視網膜神經細胞和毛細血管內皮細胞功能障礙、周細胞凋亡，促進視網膜新生血管形成[8, 9]。Fu等[10]發現，Müller細胞在DM視神經細胞存活過程中也發揮重要作用。因此，保護DM大鼠Müller細胞，減少其異常活化顯得尤為重要。
Netrin-1是目前已知的最主要神經導向因子，介導細胞遷移、黏附、分化和新生血管生成等作用[4, 5]。DR時，視網膜膠質細胞異常活化神經元細胞凋亡[11]，視網膜血管通透性改變，新生血管生成；而netrin-1具有介導突觸生長，保護神經元及降低視網膜血管通透性的作用[12]。我們不禁假設netrin-1是否在兩者之間存在某種共通性，是否在DR中起到“橋梁”作用，是否對膠質細胞的活化有影響，而Müller細胞作為主要的膠質細胞成為觀察焦點。本研究結果顯示，D、E組大鼠Müller細胞活化明顯增加，其標志物GFAP陽性表達增多，GFAP mRNA隨之升高；當給予外源性netrin-1干預時，視網膜GFAP表達降低，Müller細胞活性下降，但仍未能恢復至正常水平。而A、C組大鼠視網膜GFAP表達之間無明顯差異。據此我們推測，100 μg/ml的外源性netrin-1可降低DM大鼠Müller細胞的活化，減慢DR進程，但是不能阻止DR進展。此外，我們還發現外源性netrin-1對正常大鼠Müller細胞的活化無明顯影響。
本研究結果表明，外源性netrin-1可降低DM大鼠Müller細胞的活化，但其具體機制及信號轉導通路目前尚不明確。我們前期研究發現，netrin-1可降低DM大鼠視網膜血管通透性[16]。但具體是netrin-1通過保護Müller細胞來降低視網膜血管通透性，抑或是通過降低視網膜血管通透性打破神經-血管環路的惡性循環來降低Müller細胞的活性，目前仍不清楚。這需要我們在分子生物學水平對Müller細胞進行干預以及進一步的實驗數據支持。此外，本研究尚未對神經元細胞凋亡進行觀察，這將是我們下一步的研究重點。
志謝 感謝煙臺市業達醫院眼科姜文科、劉曉玲醫師對文稿撰寫提供的幫助
研究發現，糖尿病（DM）視網膜病變（DR）在視網膜血管發生改變之前其視網膜神經膠質細胞即出現異常[1]。Müller細胞是視網膜最主要的膠質細胞。在DR進程中，異常活化的Müller細胞促進血管內皮生長因子（VEGF）及堿性成纖維細胞生長因子釋放，導致視網膜新生血管生成及纖維化[2, 3]。軸突導向因子（netrin-1）是目前已知的最主要神經生長導向因子。近年研究發現，netrin-1在新生血管生成中發揮重要作用[4, 5]。我們推測，如能通過外源性netrin-1早期干預Müller細胞，降低其異常活化，減少視網膜新生血管形成，可能減緩DR進程。為驗證這一推測，本研究觀察了外源性netrin-1對DM大鼠視網膜Müller細胞活化的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
健康清潔級成年雄性Sprague-Dawley大鼠50只，體重約250 g，由山東魯抗醫藥公司提供。所有動物的飼養及管理均符合國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。采用隨機數字表法將50只大鼠隨機分為正常對照組（A組）、正常+平衡鹽溶液（BSS）組（B組）、正常+netrin-1 100 μg/ml組（C組）、DM+BSS組（D組）、DM+netrin-1 100 μg/ml組（E組），每組10只。D、E組大鼠按60 mg/kg的劑量，左下腹腔注射鏈脲佐菌素誘導DM動物模型。以注射72 h后空腹血糖≥16.5 mmol/L為DM模型建立成功[6]。建模成功率為100%。建模3個月后，C、E組大鼠玻璃體腔分別注射100 μg/ml netrin-1 5 μl。B、D組大鼠玻璃體腔注射等體積BSS。A組大鼠不做任何處理。
10%水合氯醛按0.3 ml/100 g劑量腹腔注射麻醉大鼠，行前房穿刺，放出少量房水，微量加樣器取5 μl netrin-1自大鼠顳上方角膜緣后1.5～2.0 mm處以45°角刺入玻璃體腔，緩慢注入netrin-1，注射完畢后按壓穿刺口3 min，無滲出，涂氧氟沙星眼膏。所有實驗大鼠均未出現注射相關的高眼壓及鞏膜口漏等并發癥。
采用免疫組織化學染色法檢測大鼠視網膜膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）的表達。玻璃體腔注射netrin-1后1個月，過量麻醉處死大鼠，迅速摘除眼球作石蠟切片。常規脫蠟和水化后，5%山羊血清封閉，一抗用1:200兔抗大鼠GFAP多克隆抗體，二抗用生物素標記山羊抗兔IgG抗體，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察并照相，以血管內皮細胞膜呈棕黃色為陽性表達。采用Image pro plus 6.0軟件對圖像進行分析。以平均積分吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值表示視網膜中GFAP的表達量。
采用熒光定量聚合酶鏈反應檢測大鼠視網膜GFAP mRNA表達。玻璃體腔注射netrin-1后1個月，過量麻醉處死大鼠。視網膜稱重，按照每50～l00 mg加1 ml RNAiso Plus裂解視網膜，提取視網膜總RNA，去除RNA內殘留的DNA，逆轉錄成cDNA，以β-肌動蛋白（β-actin）作為內參照。用GFAP引物SYBR GreenⅠ嵌合熒光法擴增相應基因。GFAP：上游引物5′-ACCGCATCACCATTCCTGTA-3′，下游引物5′-GCACACCTCACATCACATCC-3′。β-actin：上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。退火溫度60℃，40個循環后形成擴增曲線，記錄熒光值到達閾值時所經歷的循環閾值。將A組大鼠視網膜GFAP mRNA表達設定為1，計算其他各組大鼠視網膜GFAP mRNA表達。
采用SPSS16.0統計軟件進行統計學分析。定量資料結果以均數±標準差（
）表示，兩獨立樣本間比較采用獨立樣本 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
免疫組織化學染色結果顯示，A～C組大鼠視網膜僅在神經纖維層及神經節細胞層可見少量GFAP陽性表達。D組大鼠視網膜GFAP陽性表達增強。E組大鼠視網膜GFAP陽性表達較D組減少（圖1）。
圖1
大鼠視網膜GFAP免疫組織化學染色像。1A. B組；1B. C組；1C. D組；1D. E組。B、C組大鼠視網膜僅在神經纖維層及神經節細胞層可見少量GFAP陽性表達；D組大鼠視網膜GFAP陽性表達增多；E組大鼠視網膜GFAP陽性表達較D組減少 DAB ×40
A～E組大鼠視網膜GFAP陽性表達、mRNA表達比較，差異有統計學意義（F=203.43、72.91，P=0.00、0.00）（表1）。與A組比較，D組大鼠視網膜GFAP陽性表達、mRNA表達明顯增多，差異有統計學意義（t=?26.01、22.26，P=0.00、0.00）。E組大鼠視網膜GFAP陽性表達、mRNA表達較D組明顯下降（t=?10.78、3.93，P=0.00、0.00）；但仍高于A組（t=7.00、?9.82，P=0.00、0.00），差異均有統計學意義。A、C組大鼠視網膜GFAP陽性表達、mRNA表達比較，差異均無統計學意義（t=?0.29、0.50，P=0.77、0.62）。
表1
各組大鼠視網膜GFAP陽性表達、mRNA表達比較（
）
3 討論
Müller細胞是視網膜最主要的膠質細胞，位于視網膜內界膜與外界膜之間，橫跨整個視網膜；參與構成血視網膜屏障，支撐視網膜結構，釋放神經遞質和營養因子，保護及營養視神經細胞等重要作用[7]。GFAP是膠質細胞的特異性標記物。正常大鼠Müller細胞極少甚至不表達GFAP；而在DR中，Müller細胞異常活化，分泌生長因子和炎性介質，導致視網膜神經細胞和毛細血管內皮細胞功能障礙、周細胞凋亡，促進視網膜新生血管形成[8, 9]。Fu等[10]發現，Müller細胞在DM視神經細胞存活過程中也發揮重要作用。因此，保護DM大鼠Müller細胞，減少其異常活化顯得尤為重要。
Netrin-1是目前已知的最主要神經導向因子，介導細胞遷移、黏附、分化和新生血管生成等作用[4, 5]。DR時，視網膜膠質細胞異常活化神經元細胞凋亡[11]，視網膜血管通透性改變，新生血管生成；而netrin-1具有介導突觸生長，保護神經元及降低視網膜血管通透性的作用[12]。我們不禁假設netrin-1是否在兩者之間存在某種共通性，是否在DR中起到“橋梁”作用，是否對膠質細胞的活化有影響，而Müller細胞作為主要的膠質細胞成為觀察焦點。本研究結果顯示，D、E組大鼠Müller細胞活化明顯增加，其標志物GFAP陽性表達增多，GFAP mRNA隨之升高；當給予外源性netrin-1干預時，視網膜GFAP表達降低，Müller細胞活性下降，但仍未能恢復至正常水平。而A、C組大鼠視網膜GFAP表達之間無明顯差異。據此我們推測，100 μg/ml的外源性netrin-1可降低DM大鼠Müller細胞的活化，減慢DR進程，但是不能阻止DR進展。此外，我們還發現外源性netrin-1對正常大鼠Müller細胞的活化無明顯影響。
本研究結果表明，外源性netrin-1可降低DM大鼠Müller細胞的活化，但其具體機制及信號轉導通路目前尚不明確。我們前期研究發現，netrin-1可降低DM大鼠視網膜血管通透性[16]。但具體是netrin-1通過保護Müller細胞來降低視網膜血管通透性，抑或是通過降低視網膜血管通透性打破神經-血管環路的惡性循環來降低Müller細胞的活性，目前仍不清楚。這需要我們在分子生物學水平對Müller細胞進行干預以及進一步的實驗數據支持。此外，本研究尚未對神經元細胞凋亡進行觀察，這將是我們下一步的研究重點。
志謝 感謝煙臺市業達醫院眼科姜文科、劉曉玲醫師對文稿撰寫提供的幫助
